Genetica generale

Introduzione alla genetica

La genetica è la disciplina che chiarisce le regole e i meccanismi dell’ereditarietà biologica e della variazione genetica. I geni sono gli elementi di eredità trasmessi dai genitori alla progenie tramite la riproduzione sessuata. Il gene è un segmento di DNA che produce un prodotto funzionale, nella maggior parte dei casi una proteina. Solitamente, ci si riferisce a un gene in relazione a come influisce su un carattere (genotipo in relazione al fenotipo). Studiare l’attività dei geni è importante perché essa è alla base di tutti i processi biologici.

Il DNA è il materiale genetico, ovvero contiene l’informazione che deve essere espressa con la trascrizione e la traduzione, cioè codifica per le proteine. La variabilità genetica è la costituzione genetica di ogni individuo, è il modo differente in cui i loci genetici influenzano il fenotipo, ed è unica. Le relazioni tra genotipo e fenotipo sono molto complesse perché il fenotipo non dipende solo da un singolo gene, ma è la risultante tra diversi geni e fattori ambientali che modificano l’espressione genica. Il genotipo di un organismo è la costituzione genetica che ha ereditato (varianti nella sequenza del DNA), mentre il suo fenotipo è quello che appare, la sua morfologia, fisiologia e comportamento.

Livelli di espressione genica

Ci sono più livelli a cui possiamo far riferimento quando parliamo di espressione genica: livello molecolare, livello cellulare, livello di organismo e livello di popolazione. Facciamo un esempio. A livello molecolare, il gene della fibrosi cistica codifica per la proteina CFTR. A livello cellulare, questa proteina di membrana permette, in particolare, il passaggio degli ioni cloro. Se la proteina viene mutata, si presenta la condizione di fibrosi cistica, per cui il canale del cloro viene bloccato e si forma un muco denso al di fuori delle cellule.

Quindi, a livello di organismo si avranno problemi a livello polmonare, come infezioni batteriche. Il muco, inoltre, può bloccare anche i dotti pancreatici, che non secernono più enzimi digestivi. Infine, a livello di popolazioni, si possono studiare le varie mutazioni che interessano il gene e la frequenza di queste varianti. Ad esempio, sappiamo che le mutazioni del gene che codifica per CFTR sono più frequenti nell’Europa del nord rispetto a quella del sud.

Campi di indagine della genetica

• Genetica classica (mendeliana): studia come i caratteri vengono passati da una generazione all’altra, definendo gli elementi fondamentali dell’ereditarietà, le sue basi cellulari (DNA e cromosomi), l’arrangiamento dei geni sui cromosomi e la ricombinazione.
• Genetica molecolare: studia le basi biochimiche del materiale ereditario e l’espressione genica, la struttura e la funzione dei geni a livello molecolare e le modalità di azione all’interno della cellula e nell’organismo intero.
• Genetica di popolazione (evolutiva): studia come la composizione genetica è correlata all’evoluzione, ovvero studia la composizione genica di gruppi di individui, e come questa si trasforma nel tempo e nello spazio.

Organismi modello

Uno degli strumenti sfruttati maggiormente dalla genetica sono gli organismi modello, su cui fare ricerca. Essi devono avere delle caratteristiche specifiche:

• Devono avere un ciclo vitale breve
• Devono avere una progenie numerosa
• Devono essere facili da gestire sperimentalmente
• Ci deve essere la presenza di variabilità genetica e la possibilità di introdurre mutazioni

Le origini della genetica

La genetica è una scienza molto recente, ha praticamente solo un secolo, ma gli ultimi e più importanti sviluppi sono avvenuti negli ultimi 50 anni. Soprattutto grazie agli incroci utilizzati per l’allevamento e l’agricoltura, si è potuto capire in che modo i caratteri vengono trasmessi tra le varie generazioni.

La prima ipotesi di trasmissione dei caratteri ereditari fu formulata dai greci ed era l’idea della pangenesi, per cui i caratteri di un individuo potevano essere trasmessi, attraverso gli organi riproduttivi, attraverso delle gemmule, delle particelle. Altra ipotesi fu quella del preformazionismo, per cui dentro gli spermatozoi si trova un individuo già formato in miniatura.

Contributi dei botanici

I botanici furono gli scienziati che diedero il maggior contributo alla genetica. Nel 1760, Joseph Kölreuter effettuò degli incroci tra le piante di tabacco, dove osservò che la progenie aveva, in genere, caratteristiche intermedie tra quelle dei due genitori. Da qui, nacque la teoria dell’eredità per mescolamento, che afferma che:

• I fattori che controllano i caratteri ereditari sono plasmabili
• Questi fattori possono mescolarsi tra loro di generazione in generazione

Nel 1839, Schleiden e Schwann proposero la teoria cellulare, mentre nel 1879 Walther Flemming osservò la cromatina nel nucleo e descrisse la mitosi e la divisione dei cromosomi.

Le vere origini della genetica

Le vere origini della genetica, però, partono con la pubblicazione del lavoro di Mendel, nel 1866, che venne riscoperto solo dopo il 1900 da tre botanici che lavoravano indipendentemente (Correns, deVries e von Tschermak). Con il suo lavoro, Mendel formulò delle regole astratte che descrivevano i meccanismi tramite quali i geni (fattori ereditari) vengono trasmessi dai genitori ai figli. Quelle di Mendel, però, erano formulazioni astratte, senza una dimostrazione visiva. Infatti, solo nel 1944 Avery scoprì che il DNA era il materiale genetico, e nel 1953 Watson e Crick scoprirono la sua struttura; infine, negli anni ’60, Nirenberg decifrò il codice genetico.

Rivoluzioni genetiche

A questi eventi, fecero seguito una serie di rivoluzioni che hanno permesso di scoprire tutti i segreti della genetica. La rivoluzione molecolare si ha con:

• La scoperta del DNA ricombinante (anni ’70), tecnologie che permettono di inserire un frammento di DNA di un organismo in quello di un altro e di clonare la molecola ricombinante
• Il sequenziamento del DNA da parte di Fred Sanger
• Il metodo della PCR (reazione a catena della polimerasi), elaborato nel 1986 da Kary Mullis, per amplificare un qualsiasi segmento di DNA

Poi, dagli anni ’90 ad oggi, possiamo evidenziare una rivoluzione genomica, che include:

• L’inizio del Progetto Genoma Umano, nel 1990
• La pubblicazione della prima bozza del genoma umano, nel 2001
• La versione completa della sequenza del genoma umano, nel 2003

Il Progetto Genoma Umano

Il Progetto Genoma Umano era un progetto considerato molto ambizioso, fortemente finanziato e sviluppato in maniera internazionale in più laboratori, per cercare di sequenziare 3 miliardi di paia di basi. Nel 2001, quando si conobbe la prima versione dell’intera sequenza del genoma umano, vennero pubblicate due versioni. Infatti, anche se il progetto era finanziato pubblicamente, perché il genoma umano appartiene all’umanità, alla fine degli anni ’90 un genetista imprenditore fondò la propria società privata, credendo di riuscire in poco tempo a determinare il sequenziamento di tutto il genoma, utilizzando un protocollo diverso da quello usato pubblicamente. Per questo motivo, i laboratori che lavoravano al progetto pubblico furono costretti ad accelerare i tempi (la stima iniziale per la pubblicazione era nel 2003), per paura che il genoma venisse privatizzato se fosse stata pubblicata per prima la sequenza del laboratorio privato.

Quindi, i laboratori hanno dovuto preliminarmente mappare tutto il genoma, per poi prendere ciascun frammento e sequenziarlo. Al contrario, il progetto privato utilizzò l’intero genoma, tutto mescolato, sequenziandolo in modo random (shot gun) e utilizzando l’informatica per allineare tutti i frammenti sequenziati, in modo da ottenere il genoma iniziale. Questo secondo metodo è più efficiente e più veloce, ma funziona bene per genomi corti e poco ripetuti, al contrario del genoma umano. Infatti, dove le sequenze sono molto ripetute, non si riesce ad attribuire a quale tratto corrispondano. Visto che, però, man mano che i laboratori pubblici sequenziavano e mappavano il genoma lo rendevano disponibile online, questo fa presupporre che anche il laboratorio privato potesse consultare le sequenze per accertarsi della validità dei suoi risultati. Comunque, dopo la prima versione, sono state pubblicate altre versioni più aggiornate: quella più recente risale al 2013.

Nuove tecnologie di sequenziamento

Dopo il sequenziamento del genoma umano, si sono sequenziati i genomi di tutti gli organismi modello e dei batteri; in particolare, negli ultimi 5 anni si sono sviluppate nuove tecnologie di sequenziamento che hanno permesso un notevole sviluppo. Infatti, fino ad ora si era sempre utilizzato il metodo di Sanger, che non permetteva di sequenziare un frammento più lungo di 700 paia di basi e necessitava sempre di un’elettroforesi. I metodi di sequenziamento di nuova generazione, invece, si basano sul sequenziamento massimo parallelo, cioè utilizzando supporti solidi su cui attaccare i segmenti di DNA sequenziati. Questi metodi, oltre ad essere molto più veloci, sono riusciti anche ad abbassare enormemente i costi di sequenziamento. Ora, quindi, il problema non è più sequenziare tanto materiale, ma immagazzinare e analizzare un’infinità di dati.

Medicina genomica

Grazie alle possibili applicazioni in campo medico del sequenziamento, nasce l’idea della medicina genomica, cioè personalizzata e basata sull’informazione genomica. Quindi, dalla diagnosi e dalla cura si vorrebbe passar ad analizzare il genoma per capire quali misure di precauzione attuare, o quali cure personalizzate si possono mettere in atto. Il passo, però, non è immediato, perché occorre innanzitutto capire quali sono le funzioni delle varie parti del genoma, perché le sequenze in sé non danno alcuna informazione. Inoltre, occorre capire quali sono le varianti tra un genoma e l’altro che influenzano il fenotipo. Quindi, bisogna capire quali sono le basi delle malattie e cercare di rendere di routine il sequenziamento del genoma di ogni individuo, per poi cercare nuovi metodi di diagnosi, terapia e prevenzione.

Funzione del genoma

Quindi, per lo studio della funzione del genoma, bisogna ancora fare molto. Ad esempio, occorre capire quali sono le sequenze codificanti, e a cosa servono quelle non codificanti. Un aiuto, in questo ambito, è arrivato comparando genomi di diversi organismi (genomica comparativa). Infatti, si sono potute individuare sequenze conservate nel corso dell’evoluzione, presenti in diversi organismi, che cambiano più lentamente di quelle non conservate perché hanno uno scopo, una funzione. Inoltre, esistono anche sequenze conservate non codificanti, per cui devono avere una funzione di regolazione dell’espressione genica o strutturale; ad esempio, tante sequenze trascrivono per RNA non codificanti ma funzionali. Infatti, si stima che:

• Il 5% delle sequenze del genoma umano è conservato tra i mammiferi e presumibilmente funzionale
• L’1,5% del DNA codifica per proteine (i geni); ci sono circa 18/22000 geni che codificano per più di 22000 proteine diverse
• Il 3,5% del DNA è funzionale ma non codificante, come i geni con funzione di regolazione, i cromosomi funzionali e gli elementi funzionali non ancora scoperti

Per questo, il dogma centrale della biologia molecolare sta acquisendo livelli di complessità sempre più elevati. Ad esempio, la regolazione della trascrizione dipende dalle interazioni tra proteine e DNA, tra RNA e DNA, dalla topologia del DNA e dai cambiamenti epigenetici, cioè cambiamenti che influenzano l’espressione genica senza cambiare la sequenza di base (come la metilazione). Il progetto ENCODE si ripropone di studiare gli elementi funzionali del genoma.

Variazione genetica

Un’altra difficoltà per arrivare alla medicina genomica è data dallo studio della variazione genetica: la prima versione del genoma umano è solo il primo passo, perché ci sono tanti genomi e bisogna vedere quali sono le variazioni tra essi, e quali di questi cambiamenti influenza il fenotipo. Ad esempio, le varianti genetiche sono di diverso tipo:

• Le differenze più frequenti sono i cambiamenti di una singola base in un locus e sono detti SNP (Single Nucleotide Polymorphism); si parla, invece, di mutazioni quando la modificazione di quella base è molto rara, e si osserva solo in alcuni individui
• A volte, una sequenza ripetuta può variare nel numero di ripetizioni in tandem, e allora si parla di SSR (Short Sequence Repeats)
• Oppure, una sequenza molto grande viene ripetuta più o meno volte in base ogni organismi, quindi si parla di CNV (Copy Number Variation)

L’HapMap Project si è riproposto di comporre una mappa di aplotipi, cioè diverse varianti vicine tra loro nello stesso cromosoma, per capire le varianti nelle diverse popolazioni umane. Tutto questo è servito a cercare le basi genetiche delle principali malattie. In pochi decenni si sono fatti grossi progressi, soprattutto per quanto riguarda le malattie genetiche monogeniche. In questo tipo di malattia, il fenotipo è determinato da una mutazione su un singolo gene, per cui facilmente identificabile (malattia mendeliana). In altri casi, però, ci possono essere fattori ambientali che influenzano l’espressione genica, e il fenotipo può essere determinato dalla combinazione di più geni. Attualmente, si conoscono migliaia di malattie monogeniche, di cui la maggior parte è molto rara (l’individuo ha una ridotta vitalità e riproducibilità). Invece, si conosce ancora poco delle malattie multigeniche (complesse), perché sono causate dalla combinazione di molti geni dall’ambiente, e di solito non sono rare. La genetica ha cominciato a dare dei risultati anche nelle malattie complesse grazie agli studi GWAS (Genome Wide Association Studies), un approccio che valuta campioni di individui malati confrontandoli con individuo non malati, cercando di capire se alcune modificazioni geniche sono più o meno frequenti nei soggetti malati. Ad esempio, sono state individuate delle varianti che predispongono l’individuo ad una malattia, ma non ne sono la causa diretta. Ad esempio, il primo GWAS ha trovato la predisposizione per la degenerazione della macula nella retina. La speranza, intanto, è quella di individuare le possibili cause, cure e prevenzioni della malattia. Attualmente, sappiamo che molte delle malattie complesse sono molto più complesse di quello che si pensava, quindi non si riesce a fare una stima significativa dei rischi. Però, scoprire quali geni sono coinvolti nella malattia o ne causano la predisposizione può far andare a studiare quel gene più a fondo.

Sequenziamento del genoma

Un’altra difficoltà è quella di sequenziare come routine l’intero genoma di ogni individuo. Come abbiamo detto, c’è stato un avanzamento delle tecnologie del sequenziamento per cui ora, con poche migliaia di dollari, si può sequenziare il genoma di un singolo individuo. L’interesse sta soprattutto nel sequenziare il genoma di persone malate di patologie come il cancro, in cui le mutazioni non sono ereditare, cioè sono somatiche. Infatti, diventa molto importante sequenziare le varianti che possono dare una predisposizione verso queste malattie. Comunque, il passo ancora più difficile da compiere è l’analisi di routine della sequenza genomica, perché non si conosce ancora la funzione di tutte le sequenze e non si riescono ad analizzare migliaia e migliaia di dati in tempi brevi.

Applicazioni della medicina genomica

Le applicazioni più importanti della medicina genomica sono nuove diagnosi, nuove terapie e nuove forme di prevenzione. Ad esempio, la microbiologia ci indica come i microrganismi che abitano il nostro organismo possono influenzare il nostro stato di salute. Un’altra importante applicazione è la farmacogenomica, ovvero capire perché alcuni farmaci funzionano meglio su un individuo e non su un altro, perché alcuni farmaci sono addirittura tossici per un organismo e non per un altro, in modo da poter dare ad ogni individuo il farmaco più appropriato.

La genetica mendeliana

Gli studi di Mendel, alla fine del 1800, hanno posto le basi della genetica. Gregor Johann Mendel (1822-1884), divenne nel 1843 monaco agostiniano di Brno. Nel 1854 iniziò i suoi esperimenti di incrocio tra piante di pisello da giardino, Pisum sativum, e nel 1865 pubblicò le sue conclusioni, il cui significato fu riscoperto solo tra la fine del 1800 e l’inizio del 1900.

Le leggi di Mendel

La prima legge di Mendel, il principio della segregazione, stabilisce che i due membri di una coppia genica (alleli) si separano uno dall’altro, durante la formazione dei gameti. La seconda legge di Mendel, il principio dell’assortimento indipendente, stabilisce che i membri di due differenti coppie geniche sono trasmessi indipendentemente uno dall’altro durante la formazione dei gameti.

Successo degli esperimenti di Mendel

Mendel era un botanico e, come tale, cominciò ad incrociare le piante di pisello per cercare di prevedere i risultati degli incroci. Il successo di Mendel nello stabilire i fattori dell’ereditarietà furono dovuti a diversi fattori:

• Scelse di condurre i suoi esperimenti sulla pianta di pisello da giardino, facile da coltivare e che produce una progenie numerosa.
• Elevato numero di varietà di piselli a disposizione
• Escluse dalla sua analisi i caratteri che variavano molto, e utilizzò solo caratteri che si manifestavano solo in due forme facilmente differenziabili

Inoltre, Mendel utilizzò un approccio sperimentale: sulla base dei risultati ottenuti formulò delle ipotesi e quindi effettuò nuovi incroci per verificare tali ipotesi.