Genetica forense - Domande aperte

Analisi di consanguineità e relazione nell'interpretazione dei profili

Il test di consanguineità consente di conoscere se due persone sono effettivamente legate da parentela; se ad esempio sono fratelli o nipoti o hanno altro grado di parentela. Il test si basa sempre sull'analisi del profilo genetico (in questi casi sono richiesti anche un numero superiore di loci analizzati) in aggiunta al cromosoma Y (se l'ipotesi di trasmissione è in linea paterna) ed altre analisi dedicate in funzione della linea familiare da individuare (materna o paterna).

In questo test generalmente, non essendoci una relazione padre-figlio diretta, più persone saranno analizzate, più dati genetici verranno raccolti, maggiori saranno le probabilità di fornire una risposta importante con il calcolo biostatistico. Il test è in grado di confermare con sicurezza se due o più persone sono biologicamente correlate, cioè se sono tra di loro parenti. In questi casi si analizzano i campioni prelevati da uno o più presunti parenti e da uno o più membri della famiglia.

Il test di consanguineità può rispondere a diversi quesiti: ad esempio se due soggetti sono figli dello stesso padre ma di madri diverse, oppure se sono fratelli, figli degli stessi genitori. Oppure può consentire come già detto il ricongiungimento tra parenti. Consente inoltre anche in caso di decesso del presunto padre attraverso l'analisi dei nonni paterni di calcolare il valore di probabilità di paternità con il bambino: infatti i nonni contengono il profilo genetico del proprio figlio e quindi con un semplice calcolo è possibile effettuare un test di paternità "indiretto".

Se il bambino da analizzare è di sesso maschile, di ausilio sarà senz'altro anche l'analisi del cromosoma Y.

Aplotipo del cromosoma Y in ambito forense

L'analisi dell’aplotipo del Cromosoma Y (Y-STR) serve per determinare la relazione di parentela tra soggetti di sesso maschile attraverso la linea paterna. Questa analisi è utile per:

• Stabilire se soggetti di sesso maschile appartengono alla stessa linea paterna (es. se due o più fratelli sono figli dello stesso padre);
• Determinare la parentela del lato maschile di una famiglia;
• Ricostruire le relazioni di parentela collegate al padre;
• Distinguere il campione biologico maschile tra un insieme di campioni, in caso di aggressione sessuale.

Il cromosoma Y è trasmesso dal padre esclusivamente ai discendenti del sesso maschile. Nella popolazione umana questo cromosoma si caratterizza per un elevato grado di polimorfismo, quindi attraverso l’analisi di regioni polimorfiche del Cromosoma Y (Y-STR) è possibile determinare se su due o più soggetti di sesso maschile hanno lo stesso ascendente in linea maschile, il grado di questa parentela e se tutti sono i membri della stessa famiglia.

Il cromosoma Y non è soggetto a ricombinazione e viene trasmesso attraverso la linea maschile. Gli aplotipi del cromosoma Y vengono in genere ereditati come un'unità, cioè in blocco. Ciò consente di determinare nella linea ancestrale un legame paterno comune. Osservando i marcatori del cromosoma Y in tutti i maschi della stessa discendenza paterna ci si può aspettare che tutti i maschi correlati abbiano in comune gli stessi alleli del cromosoma Y (e quindi il medesimo profilo), perciò profili identici Y-STR indicano l'attribuzione in una determinata famiglia, mentre profili diversi ne indicano l'esclusione.

Allele drop-out

Quando si amplificano frammenti di DNA contenenti loci STR è possibile osservare un fenomeno chiamato allele drop-out, causato da mutazioni o polimorfismi nella regione di annealing dei primers a livello di uno dei due cromosomi o da scarsa quantità di DNA. L’allele nel campione esiste, ma non viene amplificato e quindi rilevato perché i primers, a causa delle mutazioni o dei polimorfismi presenti, non riescono a legarsi al filamento complementare e quindi non vengono allungati dalla polimerasi; per questa ragione viene chiamato allele nullo. Come conseguenza di questo fenomeno un campione eterozigote a un determinato locus appare omozigote.

Banca dati del DNA

La Banca Dati Nazionale del DNA è stata istituita con la Legge 30 giugno 2009 n. 85 per contrastare efficacemente il terrorismo, la criminalità organizzata transfrontaliera e l’immigrazione clandestina, ed ha la finalità di facilitare l’identificazione degli autori dei delitti, delle persone scomparse, nonché per le finalità di collaborazione internazionale di polizia.

Per le finalità di cui sopra, il trattamento dei dati personali è relativo al profilo del DNA ottenuto da:

• I soggetti ai quali sia applicata la misura della custodia cautelare in carcere o quella degli arresti domiciliari;
• I soggetti arrestati in flagranza di reato o sottoposti a fermo di indiziato di delitto;
• I soggetti detenuti o internati a seguito di sentenza irrevocabile, per un delitto non colposo;
• I soggetti nei confronti dei quali sia applicata una misura alternativa alla detenzione a seguito di sentenza irrevocabile, per un delitto non colposo;
• I soggetti ai quali sia applicata, in via provvisoria o definitiva, una misura di sicurezza detentiva.
• Consanguinei di persone scomparse.

La tipizzazione del DNA dei soggetti di cui ai punti precedenti, può essere effettuato esclusivamente se si procede nei confronti dei soggetti per delitti, non colposi, per i quali è consentito l’arresto facoltativo in flagranza. Nel caso di arresto in flagranza di reato o di fermo di indiziato di delitto, il prelievo è effettuato dopo la convalida da parte del giudice.

Il periodo di conservazione dei dati è disciplinato dal Decreto del Presidente della Repubblica del 7 aprile 2016 n. 87 e le modalità di cancellazione dei profili del DNA, di distruzione dei campioni biologici, di immissione e aggiornamento dei dati necessari ai fini della determinazione dei tempi di conservazione dei medesimi profili, sono disciplinate dal Decreto del Ministero dell’Interno del 12 maggio 2017. La cancellazione può avvenire nei seguenti casi:

• A seguito di sentenza di assoluzione, divenuta irrevocabile, perché il fatto non sussiste, l’imputato non lo ha commesso, il fatto non costituisce reato, il fatto non è previsto dalla legge come reato;
• A seguito di identificazione di cadavere o di resti cadaverici, nonché del ritrovamento di persona scomparsa, e comunque in ogni caso in cui lo richieda un consanguineo;
• Quando le operazioni di prelievo sono state compiute in violazione delle disposizioni previste dall’articolo 9 della Legge 30 giugno 2009 n. 85;
• In ogni altro caso il profilo del DNA resta inserito nella Banca Dati Nazionale del DNA per trenta anni dalla data dell’ultima registrazione ed elevato a quaranta anni quando il profilo del DNA si riferisce a persone condannate con sentenza irrevocabile per uno o più dei reati per i quali la legge prevede l’arresto obbligatorio in flagranza, o per taluno dei reati di cui all’articolo 407, comma 2, lettera a) del codice di procedura penale. Il profilo è altresì conservato per quaranta anni nel caso in cui in sede di emissione di sentenza di condanna irrevocabile, sia stata ritenuta la recidiva.

Decorsi trenta o quaranta anni dall’ultima circostanza che ha determinato l’inserimento del profilo del DNA nella Banca Dati Nazionale del DNA, il profilo viene automaticamente cancellato. Il termine decorre dalla data di avvenuta registrazione delle operazioni di identificazione e prelievo.

Banche dati europee in ambito ENFSI

Le istituzioni europee concepiscono lo scambio transfrontaliero di informazioni come strumento idoneo a rafforzare la cooperazione giudiziaria e di polizia in materia penale. Accanto a strumenti più tradizionali che si occupano, anche solo implicitamente di scambio di profili del DNA con finalità probatoria si pongono nuovi mezzi. Alcuni sono genericamente tesi a regolare lo scambio di informazioni e di dati, si tratta di sistemi centralizzati di raccolta delle informazioni, gestiti da un organo sovranazionale (Europol o Eurojust) e diversi dagli archivi nazionali. Altri strumenti specifici prevedono il metodo della semplificazione dello scambio di dati genetici e informazioni attraverso la condivisione nell’intero territorio dell’Unione europea, del patrimonio di conoscenze di ciascun Stato.

Il Trattato di Prum e la relativa decisione di recepimento nel quadro legislativo dell’Unione europea si collocano nel segno dell’impostazione tracciata dal Programma de l’Aia e fondata su una filosofia di stretto interscambio informativo alla luce del principio di disponibilità delle informazioni. Tale principio mira a realizzare la condivisione dei dati in possesso di un singolo Stato con le autorità di law enforcement degli altri Stati. Sono tre i tratti innovativi del Trattato:

• La prima innovazione si riferisce all’imposizione dell’obbligo, in capo a ciascun Stato contraente, di istituire e di mantenere archivi nazionali centralizzati dei quali, uno, raccoglie i profili del DNA;
• Il secondo elemento di novità va ricondotto al diritto di ogni Stato membro, di richiedere, ancor prima dello scambio, la raccolta di dati genetici.
• Infine, si deve segnalare l’impiego di procedure automatizzate di consultazione.

L’ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes – Rete Europea degli Istituti di Scienze Forensi) è stato istituito il 20 Ottobre 1995 partendo da una condivisione di intenti tra i Direttori degli Istituti Governativi Forensi dell’Europa Occidentale, seguita da una fase operativa costituita dal Primo meeting tenutosi nel 1993 a Rijswijk (Paesi Bassi). All’inizio i Laboratori di Polizia Scientifica erano rappresentati da 11 Paesi, tra cui l’Italia, fino a giungere nel 2005 ad oltre 50 Paesi membri rappresentati.

L’organizzazione prevede un comitato direttivo costituito da un consiglio (ENFSI board – 5 membri) e dai rappresentanti autorevoli di ciascun Istituto, nonché due commissioni permanenti (standing committee) che si occupano della certificazione di qualità (QCC) e dell’Accademia Europea di Scienze Forensi (EAFS), un segretariato ed i Gruppi di Lavoro (ENFSI Working Group) dedicati a tematiche specifiche forensi, tra le quali appunto l’esame del DNA, ma anche l’analisi degli stupefacenti, l’analisi di fibre, l’analisi delle impronte digitali, l’analisi di esplosivi, l’analisi dei residui dello sparo, l’analisi della scena del crimine, l’analisi di vetri e vernici, etc.

L’ENFSI è l’organismo tecnico di riferimento europeo, sia della Comunità Europea, sia del Gruppo di Cooperazione Europeo delle Polizie nonché dell’Europol e dell’Interpol riguardo la definizione degli standard tecnici utilizzati dai Laboratori di Polizia Scientifica.

Catena di custodia

La Catena di custodia è l’assicurazione dell’identificazione di tutte le persone che hanno avuto la custodia di un reperto e del luogo in cui tali reperti sono stati raccolti in ordine cronologico a partire dalla raccolta fino poi eventualmente al completo utilizzo o distruzione. La catena di custodia, correttamente eseguita, rappresenta un percorso ininterrotto di raccolta, custodia, controllo, trasferimento, e deposito dei reperti. Campioni derivanti da reperti primari come ad esempio l’estratto del DNA devono avere una propria catena di custodia mantenuta nella stessa misura del reperto originale. La catena di custodia può essere garantita attraverso strumenti cartacei ed elettronici o da una qualsiasi combinazione dei precedenti. Il sistema manuale di registrazione deve comunque includere un mezzo idoneo per tracciare il trasferimento di reperti da persona a persona e all’interno del luogo di archiviazione.

La documentazione della catena di custodia dovrebbe includere i seguenti elementi minimi:

• Descrizione del reperto/oggetto;
• Numero identificativo unico (per esempio, numero del caso);
• Dove sono stati raccolti i reperti;
• Dove è stato conservato il reperto;
• Chi era in possesso del reperto e per quale scopo;
• Cosa è stato fatto sul reperto (ad esempio, analisi o riconfezionamento);
• Informazioni relative alla data e ora di ogni attività effettuata.

Le registrazioni relative alla catena di custodia devono essere conservate per un periodo di tempo congruo anche in relazione alle disposizioni dell’Autorità Giudiziaria. L'accesso al luogo dove sono depositati i reperti deve essere limitato esclusivamente a coloro che sono autorizzati a movimentare e restituire i reperti.

CODIS

Il CODIS (Combined DNA Index System) è il software che supporta l’impianto del database e permette l’organizzazione dei dati relativi al DNA nel sistema informatico ed è stato fornito direttamente dall’FBI alla direzione centrale della polizia criminale italiana. Ciò si è reso necessario proprio a fronte della alta specificità e del particolare funzionamento che richiede un software per il corretto management di questo tipo di dati. Negli anni '90 l’FBI propone la creazione di un database nazionale per lo scambio di informazioni tra laboratori a livello federale, statale e locale. Alla fine del 2003 conteneva già oltre 1 milione e mezzo di profili genotipici.

Il CODIS è composto da due indici:

• CONVICTED OFFENDER INDEX (contiene i profili di soggetti colpevoli di crimini a sfondo sessuale o crimini violenti);
• FORENSIC INDEX (contiene i profili genetici estrapolati da campioni biologici rinvenuti sulla scena del crimine).

All’interno del CODIS i profili non sono associati ad altri dati personali del soggetto. Il CODIS operante in Europa, similmente al modello americano, ha tre livelli di organizzazione funzionale:

• 1° livello, entro il quale i profili genetici sono materialmente elaborati e vengono immessi nel sistema;
• 2° livello, entro il quale i profili genetici acquisiti in uno stesso Stato vengono immessi in un maxi-file che li raggruppa;
• 3° livello in cui tutti i profili genetici provenienti dai file dei diversi stati sono riuniti. Qui sono possibili i riscontri comparativi, i quali sono funzionali anche se il campione registrato nel database e quello di riferimento che produce il match provengono da Stati diversi.

Certificazione UNI EN ISO/IEC 17025

L'ISO/IEC 17025 è una norma che esprime i "Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di taratura". L'ultima edizione è uscita febbraio 2018. Se nella versione superata c'era un'impostazione generale che poneva una certa enfasi sulla competenza del personale e sull'affidabilità del dato analitico, nella nuova versione si pone maggiore attenzione a quella che è l'analisi del rischio.

I requisiti gestionali prescrivono il riesame periodico degli obiettivi del sistema di gestione e l'impegno evidente nel miglioramento continuo del sistema di gestione. Il personale addetto deve possedere la preparazione necessaria all'attività svolta e all'utilizzo di una data apparecchiatura, inoltre deve impegnarsi all'aggiornamento continuo. Il personale deve anche essere imparziale e non soggetto a pressioni da parte terzi. L'acquisto, ricezione e immagazzinamento di materiale di consumo e reagenti è soggetto a specifiche procedure. Il laboratorio deve impegnarsi nel miglioramento continuo.

I requisiti tecnici richiedono che l'area di lavoro sia idonea a ospitare le apparecchiature utilizzate e allo svolgimento delle attività. Devono essere tenute sotto controllo le condizioni ambientali (temperatura, umidità ed eventualmente altre) che possono influenzare l'esito dell'attività stessa. Il metodo analitico utilizzato deve essere validato e deve essere nota l'incertezza associata alla misura, assicurando in questo modo che i requisiti richiesti per l'utilizzazione del metodo siano soddisfatti. Le apparecchiature utilizzate devono essere conformi alle specifiche richieste dalla prova in oggetto e sottoposte a un programma di taratura periodica.

Contaminazione

Qualora una traccia “al limite” cioè una traccia che abbia una quantità/qualità scarsa di materiale genetico presente, venga esposta ad un fenomeno di contaminazione, ovvero al trasferimento di DNA esogeno sulla stessa in un tempo successivo all'azione criminosa, questa può risultare compromessa ed inutilizzabile. Fonti di probabile contaminazione sono:

• I sanitari che intervengono, gli operatori addetti all'attività investigativa, i tecnici di laboratorio che si occupano delle analisi;
• La contaminazione tra campioni diversi, anche di altre analisi (contaminazione crociata);
• La contaminazione da DNA di precedenti analisi (contaminazione da carry over products);

La prima causa, può essere risolta attraverso l'utilizzo di un database del personale addetto alle varie operazioni, mentre le altre due, seppur in maniera non semplice, possono essere ridotte attraverso l'adozione di determinati accorgimenti, come la giusta progettazione dei laboratori di analisi, che devono prevedere aree distinte per le varie fasi, e mediante l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale e materiale sterile e possibilmente monouso.

Controlli positivi e negativi nell'analisi del DNA

Senza il controllo positivo e negativo non si può essere sicuri del risultato ottenuto da una PCR. Il controllo positivo è costituito da un campione che contiene con certezza la sequenza bersaglio. Ci si aspetta, quindi, come dice il nome, che dia un risultato positivo, ovvero un amplificato.