Genetica ecologica e biomarcatori di alterazioni ambientali

Elementi di genetica ecologica

Nucleotide e basi azotate

Nucleotide = unità di base degli acidi nucleici, molecola con zucchero pentoso, gruppo fosfato e base azotata. Basi azotate = A (adenina), G (guanina), T (timina) e C (citosina). 4 nucleotidi possibili. Sequenze di nucleotidi codificano l’informazione genetica = gene = tratto di DNA (unità ereditaria fondamentale dei viventi).

Espressione genica

Il prodotto finale dell’informazione genetica è la produzione di proteine = espressione genica. Primo passo nelle cellule eucariotiche è la trascrizione = sequenza nucleotidica di DNA copiata nei nucleotidi di RNA e relativo appaiamento tra basi di DNA e RNA (dove Uracile, no timina). Poi maturazione RNA in cui rimozione di introni (regioni non codificanti dei geni) tramite splicing e modificazione estremità del trascritto. Restano solo gli esoni nell’RNA maturo (mRNA, messaggero) e sono le sequenze che codificheranno per le proteine. Poi traduzione mRNA sui ribosomi per produrre polipeptidi (catene di amminoacidi), in cui ogni gruppo di tre nucleotidi consecutivi forma un codone (gruppo codificante) che specifica una corrispondente unità amminoacidica nella catena.

Codice genetico

Codice genetico = elenco degli amminoacidi specificati da ciascun codone. Spesso il cambiamento nella terza base non cambia l’amminoacido specificato dal codone.

Genoma e cromosomi

Genoma = tutto il DNA in una cellula. Dimensione del genoma = quantità di DNA. Geni su cromosomi, strutture filiformi formate da una molecola di DNA a doppio filamento. Gameti umani = 23 cromosomi (numero aploide). Locus = posizione del gene sul cromosoma. Durante meiosi avviene ricombinazione tra loci, quindi nuove combinazioni alleliche. Diploide = ogni cellula somatica ha due copie di ogni tipo di cromosoma, una ereditata da madre una da padre (in ogni locus quindi hanno due copie dello stesso gene (=alleli), ciascuna nella stessa posizione (omologa) nei cromosomi materno e paterno. Se i due alleli in un locus sono uguali = omozigote, se sono diversi = eterozigote.

Genotipo e fenotipo

Genotipo = coppia diploide di alleli in un locus, è la costituzione genetica, tutti gli alleli presenti in un gene. Fenotipo = l'insieme delle caratteristiche morfologiche e funzionali di un organismo, che risultano dall'espressione del suo genotipo e dalle influenze ambientali. I caratteri fenotipici possono essere definiti a molti livelli gerarchici di organizzazione, per questo motivo lo stesso genotipo può produrre fenotipi diversi, tramite l’azione dell’ambiente.

Genetica ecologica

Genetica ecologica = studia sia i caratteri ecologicamente importanti, quelli che influenzano la fitness (capacità di un individuo di riprodursi, numero di figli prodotti), sia i processi di evoluzione fenotipica che sta avvenendo nelle popolazioni, intesa come un cambiamento nella media o varianza di un carattere attraverso le generazioni a causa di variazioni nelle frequenze alleliche indotte dalle forze microevolutive.

Quindi tema centrale della genetica ecologica è l’adattamento, quel processo che porta una popolazione/individuo ad essere più adeguato a confrontarsi con le caratteristiche dell’ambiente, quindi un carattere fenotipico che diviene prevalente poiché vantaggioso. Cambiamenti fenotipici possono anche peggiorare la sopravvivenza e riproduzione di una popolazione. L’unica che porta all’adattamento è la selezione naturale, le altre possono solo accelerarne o rallentarne lo sviluppo (tutte, però, sono responsabili dell’evoluzione, ovvero cambiamento nelle frequenze alleliche).

Selezione naturale

L’azione della selezione naturale si manifesta tramite i fattori ecologici, biotici e abiotici, con la capacità riproduttiva, e quindi nella fitness tra individui fenotipicamente diversi nella popolazione. La selezione naturale agisce sulle variazioni genetiche create da mutazione e ricombinazione (la variabilità genetica dovuta alla riproduzione sessuale è causata da: assortimento indipendente durante la meiosi, alleli di geni diversi segregano/si distribuiscono indipendentemente tra loro in gameti diversi, crossing over, scambio di materiale genetico tra cromosomi omologhi durante la meiosi, e fecondazione casuale) per cambiare la composizione genetica della popolazione. La composizione genetica viene anche influenzata dalle altre forze microevolutive.

Genetica delle popolazioni

Genetica delle popolazioni = studio della variazione genetica all’interno e tra le popolazioni (sia della stessa specie, in questo caso si parla di differenziazione genetica, sia di specie diverse) e dei processi che influenzano le frequenze genotipiche e alleliche di uno o più loci genici, quali inincrocio e forze microevolutive. Non si interessa dei fenotipi, dei quali si occupa la genetica quantitativa.

Cerca di spiegare l’origine ed il mantenimento della variazione genetica, le sue forme e organizzazione, e capire i fenomeni che generano cambiamenti nelle frequenze alleliche. Variazione genetica si instaura in una popolazione quando al suo interno vi è più di un allele per un dato locus genico (polimorfica/segregante per quel locus = la presenza simultanea in una popolazione di alleli diversi di uno stesso gene, ciascuno dei quali compare con una frequenza non trascurabile). Alcuni loci invece sono fissati, ovvero tutti i membri della popolazione sono omozigoti per lo stesso allele. Due popolazioni possono anche essere “fissate” per alleli diversi di un dato locus.

Popolazione e metapopolazione

La popolazione è la più piccola unità nella quale è possibile il cambiamento evolutivo, è un gruppo circoscritto ad incrocio panmittico (in cui qualunque membro della specie può potenzialmente incrociarsi con qualunque altro membro del sesso opposto) avente ridotto flusso genico (minimi trasferimenti di geni causati da migrazione e successivi inincroci) con altri gruppi della stessa specie. Di solito la probabilità di incroci è funzione della distanza. Un gruppo di popolazioni, in questo caso sottopopolazioni, connesse da una certa quantità di flusso genico è detto metapopolazione. Flusso genico avviene sia all’interno delle sottopopolazioni (zona dove vive una certa popolazione) sia tra sottopopolazioni di una meta.

Marcatori genetici

Marcatori genetici = strumenti per studiare variazione genetica, stabilire quali alleli sono presenti nella popolazione, quantificare l’inincrocio, il flusso genico, l’ereditabilità e costruire mappe genetiche.

Polimorfismi visibili

• Caratteri fenotipici con poche varianti distinte (morfi), la cui variazione fenotipica è generata da singoli o coppie di loci genici (ex: fiore bianco o giallo studiato da Mendel).

Marcatori molecolari

Marcatori molecolari: genetica molecolare si basa su:

• Elettroforesi, con cui macromolecole (DNA, RNA e proteine) vengono separate in un gel (matrice per il movimento differenziale delle molecole) mediante un campo elettrico generato da un generatore e degli elettrodi posti alle estremità del gel nella soluzione tampone. I campioni con queste macromolecole di un certo tot di individui sono posti separatamente all’estremità di un gel e differenti molecole del campione si spostano a diverse velocità a seconda di dimensione, forma, peso molecolare o carica elettrica. Quelle che si spostano alla stessa velocità formeranno delle bande. Il gel viene poi trattato per visualizzare le bande. Di solito il gel è composto da: amido, agarosio (è un polimero polisaccaride purificato dall'agar-agar, una sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle Rhodophyta, un polimero lineare), acetato di cellulosa e poliacrillamide (polimero ottenuto dall’ammide acrilica).
• Elettroforesi di proteine = enzimi solubili o allozimi (diverse forme di un enzima che vengono codificate da differenti alleli nello stesso locus genico). C’è un buffer (soluzione tampone) per mantenere il ph costante e poi parte del campione con tutti gli allozimi viene posta all’origine del gel. Alla fine si usa un colorante specifico (con un substrato specifico) per visualizzare un unico specifico enzima. Quindi si studiano differenze all’interno dello stesso enzima e bande diverse rappresentano forme alternative della stessa proteina (generate da differenze della sequenza amminoacidica). Inoltre molti enzimi hanno amminoacidi con cariche opposte, quindi quando applicato un campo elettrico migrano a velocità diverse. Queste variazioni nella mobilità rivelano l’intrinseca variazione genetica, infatti, sequenze di DNA di alleli diversi possono codificare proteine con sequenze amminoacidiche diverse. EX: profilo di bandeggio ottenuto da analisi di un semplice locus enzimatico con due forme alleliche. Riesce a rivelare marcatori/alleli codominanti, forme alleliche che non dominano l’una sull’altra, quindi gli eterozigoti genereranno due distinte bande sul gel (una per ciascun enzima codificato dai due diversi alleli), di cui sarà migrata più avanti dell’altra (quindi diverse distanze), mentre gli omozigoti ne produrranno solo una (poiché gli enzimi codificati dai due alleli sono uguali e quindi migrano alla stessa distanza). Vantaggi: allozimi quasi sempre codominanti e rivela una buona quantità di variazione genetica. Svantaggi sono tutti conseguenze del fatto che permette di valutare il fenotipo enzimatico e non direttamente il genotipo: mostra solo una parte della variazione genetica nelle sequenze di DNA di individui diversi poiché essendo le proteine prodotti genici non viene rivelata la variazione genetica delle regioni non codificanti del genoma, per molte proteine non sono disponibili coloranti specifici (quindi solo alcuni loci possono essere studiati), alcune variazione nelle sequenze amminoacidiche possono comunque non provocare differenze di mobilità e, inoltre, anche cambiamenti di sequenze di DNA in regioni codificanti possono non generare modifiche nelle sequenze amminoacidiche.

Marcatori di DNA

• RFLP (polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione): DNA incubato con enzimi di restrizione che lo tagliano in piccole sequenze specifiche (in prossimità di posizioni specifiche che vengono riconosciute dall’enzima) dette siti di restrizione, che poi vengono separate per elettroforesi e, tramite la tecnica del Southern blot, vengono trasferiti ad un filtro di nitrocellulosa che viene poi ibridato con una sonda radioattiva che si lega ai frammenti complementari di DNA (ancora non visibili) che poi viene lavata e poi il filtro viene esposto ad una lastra radiografica, che svilupperà alcune bande scure (i frammenti) a causa della radioattività o dell’emissione di luce generata dalla sonda. Due alleli diversi di uno stesso gene (uno su un cromosoma e l’altro sul cromosoma omologo, stesso locus) possono avere siti di restrizione in posizioni diverse, quindi se i siti di restrizione sono rari o assenti in un allele, allora si genera un frammento grande, che quindi migrerà poco durante elettroforesi, e più lungo rispetto all’altro allele che ha più siti di restrizione e quindi il DNA sarà ridotto in frammenti più piccoli, che invece migreranno più rapidamente. Le bande più spesse si formano da frammenti uguali presenti su entrambi i cromosomi (dagli stessi alleli) e solo quei frammenti ai quali la banda si legherà saranno evidenziati come bande. Le differenze dello schema di bandeggio tra individui indicano variazione genetica del numero e della posizione dei siti identificati dall’enzima di restrizione nella sequenza di DNA. Polimorfismi RFLP sono codominanti (posso solo distinguere fenotipo eterozigote-omozigote ma no genotipo), anche se molto laborioso e serve tanto DNA.
• PCR (reazione a catena della polimerasi): sintesi di oligonucleotidi da 20/30 basi, complementari alle due estremità (quindi uno 5’ e uno 3’ e viceversa) di un frammento da amplificare, utilizzati poi come primers/inneschi per la sintesi di DNA. Vengono miscelati al campione di DNA da analizzare, alla DNA-polimerasi (che catalizza la sintesi di DNA) e ad un eccesso dei 4 nucleotidi. Questa miscela sottoposta a ripetuti cicli di (1) denaturazione del campione di DNA in filamenti singoli che fungono da stampo nella reazione di sintesi, (2) legame dei primers ai due filamenti e (3) sintesi di nuove copie del DNA tra i due primers. I frammenti generati da ogni ciclo sono utilizzati come stampo negli stadi successivi, così il numero di copie del frammento raddoppierà ad ogni ciclo, sovrastando numericamente tutti gli altri DNA del campione, infatti gran parte dei frammenti, dopo molti cicli, conterrà solo la sequenza dei primers e quella del DNA tra essi compresa. Con le prossime tecniche basate su PCR, si possono quindi amplificare solo i frammenti di DNA di interesse e basta un qualsiasi composto per colorare il DNA.
• RAPD (amplificazione casuale di DNA polimorfico): usando la PCR. Primers di 10 nucleotidi generati casualmente e come stampo l’intero genoma dell’individuo. Se le sequenze complementari ai primers si ritroveranno in una certa zona di DNA, su filamenti opposti e abbastanza vicine tra loro, il filamento compreso tra i primers sarà amplificato e comparirà con una banda nel gel quando elettroforesi. Se i siti di legame dei primers sui due filamenti sono troppo distanti, la sintesi del frammento non potrà essere completata quando la fase di polimerizzazione terminerà, e quindi il frammento non sarà amplificato. Con questa tecnica molti marcatori molecolari identificati: SPAR (quando una regione/frammento amplificata da un singolo primer), SCAR (se di un frammento di determina anche la sequenza) e CAPS (frammento amplificato che contiene un polimorfismo per un sito di restrizione). Se esiste una regione del genoma con due siti di legame dei primers su filamenti opposti, un frammento sarà amplificato e nel gel comparirà una banda. Se un altro individuo della popolazione ha una sequenza di DNA diversa in uno dei due siti, il primer non si legherà e la banda non si formerà.
• AFLP (polimorfismo di lunghezza di frammenti amplificati, NB: non rivela polimorfismi di lunghezza): genoma tagliato con enzimi di restrizione, come nella RFLP (anche se più rapida e semplice), e alcuni dei frammenti generati vengono amplificati selettivamente mediante PCR utilizzando primer casuali, come nella RAPD (anche se migliore riproducibilità poiché i primers utilizzati sono in genere due volte più lunghi, quindi meno frequenti errori di legame al DNA stampo). Se un frammento prodotto per digestione con enzimi di restrizione possiede estremità con sequenze che permettono ai primers e alla loro posizione casuale di legarsi, quel frammento sarà amplificato, se le sequenze di legame ad una delle due estremità sono diverse, no amplificazione frammento e no banda.

Sia RAPD sia AFLP rivelano la variazione genetica di una popolazione mediante un’analisi della presenza/assenza di specifiche sequenze di DNA scelte casualmente. In questi ciascuna banda rappresenta una regione diversa del genoma anziché rappresentare, come negli altri metodi, forme alleliche differenti di uno steso locus. Molti marcatori sono dominanti, cioè gli eterozigoti e uno dei due omozigoti avranno lo stesso profilo di bandeggio (anche se nella banda dell’omozigote ci sarà il doppio di DNA). L’altro omozigote non produrrà alcuna banda e il suo marcatore sarà denominato allele nullo.

VNTRS

VNTRS (varianza del numero di sequenze ripetute in tandem): regioni di DNA nucleare a doppio filamento, non codificanti del genoma costituite da ripetizioni stessa sequenza fino a 64 nucleotidi. Ripetizioni formate da unità più grandi sono minisatelliti, quelle da unità più brevi microsatelliti. Con minisatelliti il DNA tagliato con enzimi di restrizione e visualizzato.