Genetica dei microrganismi

Genetica dei microrganismi: superavvolgimenti

Un esempio di topoisomerasi II è la DNA girasi, che ha la funzione di introdurre superavvolgimenti negativi; questo è un tetramero, costituito da due GyrA e due GyrB proteins. All'inizio GyrB afferra una sezione della doppia elica del DNA; in seguito GyrA si lega al filamento, provocando una rottura al DNA. Aggiungere un superavvolgimento negativo al DNA richiede energia, data dall'idrolisi dell'ATP che avviene a livello di GyrA; ciò fa sì che la sezione di DNA tagliata passi al di sopra del filamento non tagliato e GyrB ne permette la rilegazione. La molecola di DNA contiene adesso un superavvolgimento negativo.

Per mantenere le proprietà del DNA superavvolto, una cellula deve poter bilanciare l'attività di ambedue le topoisomerasi. Alcuni Archeae, come Sulfolobus, che vivono in ambienti la cui temperatura è molto alta, devono poter proteggere il DNA dalla denaturazione che

normalmente avviene a queste alte temperature, dunque, hanno adottato un sistema che prevede un numero maggiore di superavvolgimenti positivi che richiedono sicuramente una maggio energia per permettere la separazione delle due eliche.

Qui è riportato un gel d'agarosio, tecnica che permette la separazione delle molecole di DNA in base alle loro dimensioni; il gel è una tavoletta gelatinosa, formato da agarosio che forma all'interno del gel una rete, attraverso il quale passa il DNA; molecole più piccole si muovono meglio rispetto a molecole più grandi, perché riescono ad attraversare meglio le maglie della rete. Il gel viene messo in un campo elettrico, in maniera tale che il DNA, carico negativamente, si muova verso il polo positivo del campo, perché attratto. Nella figura a sinistra, si ha il polo

positivo in basso e quellonegativo in alto è nella colonna 6, le colonne inbasso corrispondono alle molecole di DNA più piccole; le molecole in alto sono invece di dimensioni maggiori. Il superavvolgimento contribuisce così tanto alle dimensioni di una cellula che, anche se si ha una molecola delle stesse identiche dimensioni, ad esempio un plasmide, il fatto che questo si trovi in forma circolare oppure superavvolta (quindi compattato), o ancora lineare, cambia la velocità a cui il plasmide si muove all'interno del gel. Infatti, la forma superavvolta è talmente più piccola che si muove più velocemente rispetto alle due forme dello stesso plasmide. Esistono 3 elementi che sono coinvolti nella formazione di superavvolgimenti; l'elemento TOPOISOMERASI è il principale, sono degli enzimi che prendono il nome di, la cui funzione è proprio quella di creare o rimuovere superavvolgimenti sia positivi che negativi, cambiando il numero divolte con cui le due eliche si avvolgono l'una sull'altra per poi richiudere il DNA; si suddividono in due tipi: - tipo I: creano e rimuovono superavvolgimenti tagliando solo una delle due eliche del DNA; - tipo II: tagliano entrambe le eliche del DNA. Supercoiling In E. coli esistono 4 diversi tipi: 1) Topoisomerasi: Le 2 topoisomerasi, principalmente coinvolte nella formazione di superavvolgimenti nel compattamento sono: la topoisomerasi I e la DNA girasi. 2) Duplication and transcription: La topoisomerasi I rimuove superavvolgimenti negativi; mentre la DNA girasi crea superavvolgimenti negativi e rimuove superavvolgimenti positivi. La topoisomerasi IV è invece principalmente coinvolta nella duplicazione del DNA. 3) NAPs: Ci sono altri due elementi che sono coinvolti nella formazione di superavvolgimenti: - trascrizione e duplicazione ogni volta che la doppia elica di DNA deve essere aperta, o

Per essere duplicata, la trascrizione deve essere trascritta o trascritta in una forma duplicata. Questo cambia il superavvolgimento del DNA.

Riassumendo: il nucleoide batterico è una struttura fortemente compatta, ciò è dovuto ad elementi generici che in generale permettono il compattamento del genoma, ma che non sono direttamente coinvolti in questo processo; l'entropia, il sovraffollamento molecolare e la trascrizione. Ci sono invece due elementi specifici che principalmente contribuiscono al compattamento del genoma, in primis in E. coli, ma che in generale si sono ritrovati in tutti gli altri batteri: le NAPs, proteine che interagiscono con il DNA e agiscono andando a piegare e compattare regioni del DNA di circa 1000 pb; e i superavvolgimenti, che contribuiscono a mantenere il DNA cromosomico organizzato in forma plectonemica o solenoidale con proteine come le NAPs.

compattare regioni del DNA un po' più grandi, di circa 10.000 pb. Il genoma di E. coli, come quello della maggior parte dei batteri, è costituito da delle ampie regioni, che sono superavvolte negativamente: in particolare da delle regioni che si superavvolgono e formano dei loop, detti plectonemici. Questa parola indica semplicemente che, in questi loop, il superavvolgimento avviene lungo l'asse della molecola. Questi loop citoplasmatici, che possono comprendere anche ampie regioni di superavvolgimento diverse, corrispondono esattamente ai loop visti nel modello a rosetta; cioè quelli che si dipartivano dal core centrale, che si diramavano all'esterno della cellula, altro non sono che questi loop plectonemici, costituiti da DNA superavvolto e ulteriormente compattato dalla presenza delle NAPs. Inoltre, sempre nel modello a rosetta, le anse formate sono nettamente

separate le una alle altre e ciò è relativo al fatto che questi loop sono, in qualche modo, nettamente separati l'uno dall'altro. Dunque, se si taglia la molecola a livello di uno di questi loop, il superavvolgimento viene perso solamente in quello stesso loop, mentre tutti gli altri loop circostanti rimangono inalterati. Per comprendere meglio in che modo questi loop siano separati l'uno dall'altro, è fondamentale sapere a cosa servino. Questi loop, infatti, costituiti da DNA superavvolto e NAPs corrispondono a delle regioni funzionali particolari nel genoma, cioè delle regioni di genoma che svolgono funzioni diverse dalle regioni circostanti; questo è stato scoperto grazie all'utilizzo di una tecnica, che prende il nome di CHROMOSOME CONFORMATION CAPTURE (3C) + DEEP SEQUENCING, che è stata sviluppata qualche anno fa e che permette di andare ad identificare tutte quelle regioni del genoma che interagiscono di

più fra di loro. Essa cioè consiste nel prelevare il genoma di un batterio, fissarlo con formaldeide e in questo modo tutte le regioni del genoma che18GENETICA DEI MICRORGANISMI sono spazialmente vicine fra di loro, cioè che interagiscono fra di loro, anche se di fatto sono localizzate lontano dal genoma, vengono legate insieme le una alle altre. Se si taglia poi il genoma e a sequenziare i vari pezzi che si ottengono, si possono identificare delle regioni del genoma che CIDsà chromosome interaction domain sono state denominate , che anche se sono localizzate spazialmente lontane le una dalle altre nel genoma, interagiscono fortemente tra di loro da un punto di vista funzionale. Questi CIDs, chiamate anche microdomini, corrispondono esattamente ai loop visti precedentemente e quindi non sono altro che regioni di DNA superavvolte formate da più domini di superavvolgimenti diversi, ma che sono nettamente separate dai domini di superavvolgimento multipli (o CIDs o

microdomini vicini). Questi ultimi sono dunque regioni di DNA separate le une dalle altre, cioè tutta la porzione di genoma che è contenuta all'interno di un Spatial organization of the nucleoid Spatial organization of the nucleoid

Chromosome conformation capture (3C) + Deep sequencing = Hi-C

• Chromosomal interaction domains (CIDs): highly self-interacting regions, equivalent to topologically associating domains (TADs) of eukaryotic chromosomes
• Two characteristics:
  1. genomic regions of a CID physically interact with each other more frequently than with the genomic regions outside that CID or with those of a neighboring CID
  2. the presence of a boundary between CIDs that prevents physical interactions between genomic regions of two neighboring CIDs
• Although identities of domain barriers remain to be established, possible mechanisms responsible for the formation of the barriers include:
  • (i) Proteins bind to two distinct sites on the

altri. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che non sono le proteine a separare i CIDs, ma piuttosto la struttura del DNA stesso. Infatti, si è scoperto che i CIDs sono delimitati da sequenze di DNA chiamate BIMEs (elementi batterici a mosaico interspersi). Queste sequenze sono presenti in molteplici copie nel genoma di E. coli e svolgono un ruolo importante nella formazione dei CIDs. Inoltre, è stato osservato che il DNA all'interno dei CIDs è fortemente legato alla membrana cellulare. Questa interazione tra il DNA e la membrana è essenziale per il processo di trascrizione, in cui l'informazione genetica contenuta nel DNA viene trascritta in molecole di RNA. In conclusione, il cromosoma di E. coli è organizzato in CIDs, che sono delle regioni funzionali e strutturali del genoma. Questi CIDs sono delimitati da sequenze di DNA chiamate BIMEs e sono fortemente legati alla membrana cellulare. Questa organizzazione del DNA contribuisce alla regolazione dell'espressione genica e alla corretta replicazione del genoma durante la crescita cellulare.

altrià questa era una convinzioneabbastanza diffusa. In realtà sembra però che non siano le proteine a separare un dominio dall'altro. Si è pensato che potessero essere delle particolari sequenze di DNA, ma anche in questo caso non sono state identificate delle regioni particolari di DNA che potevano corrispondere a tali regioni; si è pensato che quello che divideva una regione dall'altra potessero essere delle aree di DNAattaccate alla membranaàes. dell'elastico: ci sono due CIDs diversi, se il DNA in un punto èchiuso da una proteina oppure è attaccata al DNA, se si taglia questo dominio, quello che succede èche l'altro rimane integro. In realtà quello che sembra emergere sempre di più è che quello cheregioni ad alto livello disepara un microdominio da un altro microdominio nel genoma, siano delle