Genetica generale

Genetica generale

La genetica è lo studio del materiale genetico, del suo mezzo di trasmissione e delle relazioni tra l'informazione genetica e la sua funzione. L'oggetto di studio della genetica è il gene; tradizionalmente, secondo la teoria classica, esso è un'unità d'informazione biologica che influenza un carattere (una qualsiasi caratteristica osservabile di un organismo vivente).

Con il passare del tempo, però, il significato di gene è cambiato e attualmente si considera un gene il segmento di DNA o RNA (nel caso di alcuni virus) che codificano per un prodotto funzionale, che nella maggior parte dei casi sarà una proteina o più proteine (grazie allo splicing per cui un gene può essere processato in modi diversi e dare origine a proteine diverse) oppure RNA non codificante.

Meccanismo fondamentale dell'espressione genica

Da un gene, attraverso la trascrizione e la traduzione, si arriva alla formazione di una proteina.

Termini genetici

È importante specificare il significato di alcuni termini riguardanti la genetica:

• Genotipo: l'informazione genetica contenuta nel DNA di una cellula, un individuo o una popolazione (all'interno di individui della stessa specie sono fondamentali le varianti genetiche che rendono ogni individuo diverso da un altro). Il genotipo influenza il fenotipo.
• Fenotipo: una caratteristica osservabile dell'individuo che deriva dall'espressione dei geni. Ad esempio, prendiamo in considerazione il colore del pelo come carattere: il fenotipo potrebbe essere il pelo bianco o grigio.

Uno degli obiettivi fondamentali della genetica è capire come il fenotipo e il genotipo siano correlati tra loro; infatti, gli step che intercorrono tra una sequenza di DNA e l'espressione di un carattere sono molti e complessi: DNA ➔ RNA ➔ proteina ➔ interazioni proteina-proteina ➔ pathways ➔ carattere.

Livelli di osservazione

Quando si studia il legame tra fenotipo e genotipo è necessario definire a che livello si vuole osservare il loro rapporto:

• A livello molecolare: riferito a come viene espresso un gene e qual è il prodotto funzionale.
• A livello cellulare: specifica la funzione proteica (prodotto dell'informazione genica) nella cellula.
• A livello di organismo: studia come i geni influenzano macroscopicamente l'organismo.
• A livello di popolazione: osserva come una malattia genetica sia presente all'interno di una popolazione.

Esempio di malattia genetica

Prendiamo come esempio la malattia genetica della fibrosi cistica. Consideriamo un tratto di DNA sul cromosoma 7 umano. Il tratto è formato da diversi introni ed esoni e il prodotto finale è una proteina di membrana detta CFTR che, a livello cellulare, costituisce un canale ionico che usa l'energia dell'ATP per far passare ioni cloro dall'interno della cellula verso lo spazio extracellulare. Mutazioni che colpiscono il gene portano alla formazione di un canale non funzionante e questo porta a un disequilibrio idrico-salino nelle cellule con la formazione di muco denso nella parte extracellulare. L'individuo con questa mutazione sarà affetto da fibrosi cistica (sono presenti sintomi in diversi organi, in particolare nelle cellule epiteliali delle vie aeree e del pancreas). Poi, possiamo andare a vedere come varia la sequenza di questo gene in individui appartenenti a diverse popolazioni: una specifica mutazione, nota come F508del, che corrisponde alla delezione di un singolo amminoacido, si trova con maggiore frequenza nella popolazione europea.

Prospettiva storica della genetica

La genetica ha radici antiche, che risalgono allo sviluppo dell'agricoltura e dell'allevamento, quando gli uomini cercavano di incrociare le specie che erano più utili; le prime domande di senso però appartengono al periodo greco, in particolare sotto la scuola di Ippocrate; in quel periodo le teorie erano la Pangenesi, secondo la quale tutte le cellule del corpo potevano trasmettere informazioni genetiche e l'eredità dei caratteri acquisiti, secondo cui, durante la vita dell'individuo, delle sostanze non definite venivano influenzate dagli stimoli ambientali, per poi confluire negli organi riproduttivi ed essere trasmessi alla progenie.

Questi concetti vennero ritenuti validi per molti anni, anche Darwin era ancora influenzato da queste teorie erronee: nonostante all'interno della sua teoria avesse rivoluzionato la visione della trasmissibilità dell'informazione genetica, accoglieva ancora la teoria dell'eredità per mescolamento (i caratteri trasmessi alla progenie erano una via di mezzo di quelli genitoriali). La nascita della genetica vera e propria risale all'inizio del '900, quando Mendel confuta sia il concetto di eredità per mescolamento sia la teoria dell'eredità dei caratteri acquisiti, mediante la formulazione di regole astratte che descrivono i meccanismi attraverso i quali i fattori ereditari possano essere trasmessi dai genitori ai figli.

Ad aiutare la comprensione della genetica sono state le scoperte, in ambito biologico, dei cromosomi, della teoria del germoplasma, ecc. Queste nuove scoperte, insieme alle migliorie tecniche (microscopio) e le leggi di Mendel hanno reso possibile la nascita della genetica.

Uno dei grandi meriti di Mendel fu che riuscì a semplificare il problema della trasmissione ereditaria (Mendel non era l'unico, ma il problema era affrontato da diversi scienziati). Mendel riuscì a guardare l'eredità di singoli geni andando a studiare dei caratteri semplici, le cui variazioni dipendono da un singolo gene, utilizzando come organismo modello le piante di pisello. Questi caratteri, in realtà, sono molto rari perché la maggior parte dei caratteri sono influenzati da molti geni e magari anche da fattori ambientali.

Per chiarire i meccanismi, Mendel andò a studiare dei mutanti, ossia degli organismi che mostrano delle variazioni fenotipiche del carattere. Selezionare un fenotipo di interesse, selezionare dei mutanti per un certo carattere e poi con gli strumenti dell'analisi genetica identificare il gene che causa quel fenotipo è un approccio chiamato genetica diretta. Tutt'oggi, tra i possibili metodi figura quello utilizzato da Mendel, con la differenza che avendo una migliore disponibilità tecnologica si può indurre la mutazione senza cercare all'interno di una popolazione il campione d'interesse, e una volta trovato il gene è possibile mapparlo, isolarlo e sequenziarlo.

Più recentemente, dopo la nascita della biologia molecolare con gli strumenti del DNA ricombinante, spesso si usa un approccio chiamato reverse genetics: in questo caso si parte da una particolare sequenza di DNA, e, per ottenere informazioni, si genera una mutazione (con tecniche come geni knock-out, CRISPR, silenziamento genico) in un individuo e si osserva come questa modifica influenza il fenotipo.

Utilizzo degli organismi modello

Nella genetica, particolarmente utili sono gli organismi modello nello studio della trasmissione dei caratteri ereditari. Gli organismi modello devono avere certe caratteristiche:

• Ciclo vitale breve
• Progenie numerosa
• Facile da gestire sperimentalmente
• Presenza di variabilità genetica e possibilità di introdurre mutazione

Storicamente, ma ancora oggi, gli organismi modello più usati sono il lievito (Saccharomyces cerevisiae), il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster), il nematode C. elegans, Arabidopsis thaliana, il topo (Mus musculus). Per studiare l'organismo umano si possono usare colture cellulari in vitro come surrogato: ad esempio, si possono usare cellule staminali per ottenere in vitro diverse tipologie cellulari, in modo da studiare determinati fenotipi a livello cellulare.

Scoperte genetiche del XX secolo

A metà degli anni '50, lo studio della genetica viene rivoluzionato a seguito di molte scoperte riferite alla genetica molecolare, come la scoperta della struttura del DNA a doppia elica, la definizione del dogma centrale della biologia molecolare e la descrizione del codice genetico. Ad esempio, la prima correlazione tra fenotipo e genotipo è stata osservata nella mutazione di una base della sequenza del gene della b-globina, modificando l'aminoacido, da glutammina a valina, si modificava la struttura tridimensionale. Questa mutazione è responsabile dell'anemia falciforme.

Negli anni '60, una scoperta fondamentale fu lo sviluppo della tecnologia per il sequenziamento del DNA, da parte di Fred Sanger nel 1977 (questo metodo ha come limite la lunghezza di DNA sequenziabile: 500-800 bp) che negli anni '90 è stato rivoluzionato facendo spostare l'obiettivo dai singoli geni (genetica) all'intero genoma (genomica). La genomica non si occupa più del singolo gene, ma osserva l'organizzazione del genoma, le variazioni da l'uno all'altro e i meccanismi che ne determinano il funzionamento.

Progetto genoma umano

Nel 1990 un consorzio internazionale si pone un obiettivo molto ambizioso: sequenziare l'intero genoma umano costituito da 3 miliardi di nucleotidi (in quel periodo il metodo valido era quello di Sanger). L'idea di fondo di questo progetto era mappare il DNA dividendolo in varie parti da consegnare a più collaboratori che dovevano analizzare singolarmente i frammenti e poi condividere pubblicamente le informazioni, mantenendo, quindi, tutta la ricerca pubblica e utilizzando finanziamenti a loro volta pubblici. Nello stesso periodo, Craig Venter (un grande imprenditore) ipotizza di poter acquistare su scala industriale centinaia di sequenziatori automatici e utilizzando un approccio chiamato shotgun annuncia che in breve tempo avrebbe sequenziato l'intero DNA. Questa rivalità mette in difficoltà il progetto pubblico, poiché Venter aveva in mente di privatizzare e brevettare le sue scoperte, dunque attraverso dei compromessi accelerano il sequenziamento ed entrambe le compagnie annunciano nel 2000 la bozza del genoma umano per poi renderlo ufficiale nel 2001 (non tutto il DNA era stato sequenziato, delle zone ad alta ripetitività non potevano essere riassemblate, dunque delle zone vicine al centromero erano incomplete).

Il completamento del progetto genoma umano segna una pietra miliare nello studio della genomica, ma dà il via a numerose domande sul funzionamento del DNA; le migliorie tecnologiche hanno permesso di rispondere ad alcune di queste domande rendendo molto più accessibile il sequenziamento del genoma umano (inizialmente si stima sia costato 3 miliardi; oggi sequenziare un intero genoma impiega 2 giorni e costa meno di 1000$), e potendo così comparare diversi genomi e analizzarli più velocemente.

Nascita delle scienze -omiche

Nascono così le scienze -omiche che si riferiscono non solo al gene ma, ad esempio, all'intero trascrittoma (transcrittomica) o all'insieme delle proteine (proteomica) o all'epigenomica ovvero le modificazioni che influenzano la trascrizione senza modificare il DNA. Queste nuove scienze sono d'impatto in molti ambiti, in medicina; l'istituto NHGRI, per esempio, ha avviato un piano per accostare alle diagnosi un approccio genomico, in modo da sviluppare terapie uniche per ogni individuo.

Il primo obiettivo della genomica è comprendere come variano i genomi e quali sono le varianti del DNA, perché quest'ultime sono responsabili delle mutazioni e della variabilità. Confrontando più DNA si nota che generalmente la maggior parte del DNA è simile, alcune basi invece sono differenti e, tra queste varianti, alcune sono polimorfismi (comuni tra la popolazione) mentre altre sono più particolari e modificano l'espressione genica in maniera definitiva.

Il genoma umano diploide è formato approssimativamente da 3 miliardi di coppie di basi, dell'intero genoma solo 20.000 sono geni, il resto del DNA può avere funzioni regolatorie, il metodo per discriminare se il restante DNA svolge una funzione o meno è osservare se il frammento di DNA si conserva per molte generazioni, in questo caso probabilmente svolge una funzione (per selezione naturale). Sono comuni anche sequenze non durature nelle generazioni che, però, influenzano le modificazioni epigenetiche, ovvero modificazioni chimiche delle proteine legate al DNA andando così a modificare il fenotipo senza intaccare il genotipo; ad esempio, la metilazione dell'istone modifica il livello di condensazione del DNA influenzando così la trascrizione. Ad oggi gli elementi non codificanti noti sono largamente studiati e la loro comprensione sta migliorando esponenzialmente (nell'uomo solo il 1,5% del genoma codifica per proteine).

Mendel e i principi fondamentali della trasmissione ereditaria (Lezione 2)

L'analisi genetica di Mendel pone le basi per l'approccio di analisi genetica. Definiamo un carattere come una proprietà osservabile di un organismo e il fenotipo è la modalità con cui si presenta questo carattere. Nell'approccio mendeliano l'analisi genetica sfrutta i cosiddetti "mutanti" cioè individui di una popolazione che presentano delle varianti fenotipiche dello stesso carattere. I mutanti vengono isolati e vengono sottoposti a incroci con individui che presentano un fenotipo differente e, in base all'osservazione dei risultati (cioè della progenie), può essere ideato un modello di trasmissione del carattere che permetta, attraverso metodi di mappaggio genetico, di andare a isolare i geni che sono alla base della manifestazione fenotipica.

Mendel visse nel 1800 ed era un monaco. Aveva studiato matematica, biologia, botanica all'università di Vienna. Mendel non aveva nessuna conoscenza riguardo al DNA. La sua grande scoperta è che lui definisce, al contrario di quanto sostenevano le teorie pre-mendeliane come quella della trasmissione per mescolamento, una teoria secondo cui i fattori responsabili della trasmissione ereditaria sono unità discrete di eredità, che quindi non vengono modificate (discrete) da una generazione all'altra. Il successo dell'approccio mendeliano fu dovuto ad una serie di fattori favorevoli:

• Per i suoi studi utilizzò una pianta facile da coltivare e che produce una progenie numerosa.
• Sul mercato erano presenti tante varietà della stessa pianta.
• Lo studio della trasmissione ereditaria fu effettuato su caratteri monogenici, cioè caratteri la cui espressione è regolata da un unico gene. Per questi caratteri vi è quindi una correlazione diretta tra presenza di una determinata variante genetica e rappresentazione fenotipica.
• Si affidò ad un approccio sistematico e sperimentale: annotò in modo quantitativo i risultati dei suoi esperimenti, formulò ipotesi che andò a confermare o demolire tramite altri esperimenti.

Al tempo si sapeva che gli organismi, come i mammiferi, si riproducono per riproduzione sessuata e cioè che i gameti si sviluppano negli organi maschili e femminili e che si uniscono a formare uno zigote che darà origine a un embrione e poi all'organismo. Anche le piante si sapeva che si riproducevano con riproduzione sessuata (ovario e granuli pollinici) che avviene attraverso l'impollinazione.

Autoimpollinazione e linee pure

Nel tipo di pianta scelta da Mendel, il pisello, spesso la riproduzione avviene per autoimpollinazione perché sia l'ovaio che le antere si ritrovano nello stesso fiore. Questo permise a Mendel di selezionare delle linee pure, ossia piante lasciate autoimpollinare per più generazioni, che mostravano fenotipi alternativi (due) per un carattere. Raggiungendo le linee pure le varietà presentavano un fenotipo invariato per quel carattere da genitori a progenie.

Quindi, selezionò 7 caratteri da portare avanti nei suoi esperimenti perché si presentavano in modo netto e alternato: colore del seme, forma del seme, colore del baccello, forma del baccello, posizione del fiore, lunghezza del fusto, colore del rivestimento del seme.

Incroci monoibridi

Mendel riusciva anche a fare degli incroci, delle cross-impollinazioni, tra una varietà e un'altra, evitando che ci fosse autoimpollinazione, ossia faceva un'ibridazione (incrocio di 2 piante con fenotipo diverso), per fare ciò rimuoveva gli stami da un fiore per evitare l'autoimpollinazione, poi prendeva il polline da un'altra pianta e lo trasferiva nel pistillo dell'altra pianta. Le linee pure iniziali le chiamiamo linee parentali. Facciamo, ad esempio un incrocio tra pisello liscio e pisello rugoso: la progenie F1 è tutta liscia, ma cosa è successo all'altro fenotipo? Quindi, Mendel fa autofecondare la generazione F1, ottenendo una generazione F2, in cui è ricomparso il fenotipo rugoso che era scomparso nella F1: la proporzione di fenotipo liscio e fenotipo rugoso era di 4754 lisci e circa 1850 rugosi, in un rapporto di circa 3 a 1. Fa la stessa cosa con tutti gli altri fenotipi che aveva isolato (giallo/verde, ecc.) e in tutti i casi uno dei 2 fenotipi parentali scompare nella F1 e uno invece rimane. Quello che scompare è chiamato fenotipo recessivo, l'altro è chiamato dominante. Nella F2 il fenotipo recessivo ricompare, sempre con un rapporto di circa 3:1. 3/4 della progenie della F2 presenta un fenotipo dominante, mentre 1/4 presenta un fenotipo recessivo.

Mendel, inoltre, fa anche gli incroci invertendo i sessi (prende il polline da una e feconda l'altra, poi fa il contrario) l'esperimento non cambia e nella F1 c'è sempre il fenotipo dominante. Quindi i caratteri (e i relativi fenotipi) sono indipendenti dal sesso dei gameti; questo è vero per molti caratteri, ma non per tutti.

Primo principio di Mendel

Dalle sue esperienze, Mendel sconfessava la teoria dell'ereditarietà per mescolamento e formula una sua teoria, ossia che l'ereditarietà è data da questi fattori ipotetici che rimangono costanti nel passaggio da una generazione all'altra; inoltre, questi fattori sono presenti a coppie, ossia possono essere di un tipo o di un altro tipo e li chiamiamo S (dominante) quello responsabile dei piselli lisci e s (recessivo) quello per i piselli rugosi. Nelle linee parentali noi assumiamo che questi fattori siano presenti in copie uguali o diverse e che la loro combinazione determini il fenotipo dell'organismo.