Genetica - parte1

La genetica dei microrganismi

Microrganismi, tra cui i batteri, sono importanti perché hanno consentito di sviluppare alcuni concetti importanti di genetica molecolare, ma anche perché sono usati in laboratorio.

Importanza nella ricerca:

• Furono fatti degli esperimenti che dimostrarono che i caratteri sono determinati dalla presenza del DNA. Negli anni '30 Griffith scoprì che il DNA è il principio trasformante, cioè se introdotto in un batterio fa insorgere alcune caratteristiche.
• Hersey negli anni '50 scopre che il DNA è il materiale genetico usando E. coli che è un organismo modello.
• Jacob e Monod negli anni '60 scoprono il meccanismo di regolazione dell'operone lac.
• Boyer e Cohen negli anni '70 usano E. coli per clonare una molecola di DNA. Quindi gli esperimenti con i batteri consentirono poi di arrivare al DNA ricombinante e all'ingegneria genetica.

E. coli

E. coli ha una grandezza di 0.5 micron e contiene un singolo

Il cromosoma batterico è una singola molecola di DNA a doppia elica. Questo singolo cromosoma si trova in una zona della cellula detta nucleoide (non si ha compartimentalizzazione). Il DNA all'interno della cellula è superavvolto (in quanto sarebbe altrimenti 1000 volte più lungo della cellula). Se si sottopone la cellula ad una lisi blanda, il DNA viene rilasciato in forma altamente ripiegata.

Si riuscì a stimare la lunghezza del genoma di E. coli: 4,6 Mb (megabasi o milioni di basi). Questo permise di fare l'annotazione all'interno del genoma una serie di geni (stimati 4288 geni). Cercarono poi di attribuire una funzione a tutti i geni e li classificarono in 22 gruppi funzionali.

Il cromosoma di E. coli contiene un'unica origine di replicazione, ma è stato dimostrato che la replicazione procede in due direzioni. Man mano che procede la forca replicativa dà origine ad una struttura chiamata theta (θ). Una volta separati i nuclei,

Attraverso l'ingegnerizzazione dei plasmidi. Come si fanno crescere i batteri in laboratorio? E. coli può crescere in laboratorio su terreni appropriati, liquidi o solidi (gelatinosi) ad una temperatura di 37°C (visto che è un batterio intestinale). Si parla di terreno minimo quando questo contiene solamente sali minerali, fonte di carbonio e vitamine. In laboratorio, a seconda del tipo di esperimento, si possono ottenere altri terreni completi. Il terreno completo non selettivo contiene il terreno minimo + amminoacidi e basi azotate.

Terreno liquido → si prepara il terreno, si mettono le cellule, si mette in incubazione e si mantiene in agitazione in modo da avere uno scambio con l'esterno. Le cellule aumentano con una curva di crescita che è esponenziale. All'inizio le divisioni sono più lente (fase di lag → di acclimatazione), poi c'è una fase di crescita veloce (fase logaritmica) poi si arriva a una fase...

stazionaria visto che si tratta di un ambiente chiuso in cui si raggiunge la saturazione.

Terreno solido → per realizzare questo tipo di terreno si usano le capsule Petri. Le cellule crescono in colonie. Al terreno viene aggiunto un agente gelificante (di solito agar). Sopra il terreno solido si aggiunge un po’ di terreno liquido (piastratura). Si mettono le cellule, meglio se isolate, che quando cresceranno daranno origine a delle colonie. Ciascuna colonia origina da una singola cellula. Di solito la crescita avviene in 24 ore, a volte di meno (es. overnight).

Fenotipi mutanti nei batteri

Sono dei fenotipi che non sono rilevabili visivamente, ma solo attraverso dei saggi. Ciascun fenotipo corrisponde all’azione di un gene. Possono essere di 3 tipi:

• per fonte di carbonio
• resistenti
• auxotrofi

Fonte di carbonio (lac ) → le fonti di carbonio sono zuccheri aggiunti al terreno o che il batterio trova nell'ambiente in cui vive. Il glucosio è la fonte

più classica che entra direttamente nella glicolisi. A volte anche il lattosio può essere utilizzato come fonte di carbonio, ma ci sono i mutanti che non sono in grado di usarlo. Se quindi all’interno di un terreno metto solo il lattosio come fonte di carbonio, i batteri mutanti non crescono.

Questi batteri vengono divisi in base al terreno: solo lattosio o solo glucosio. Ci sarà un ceppo di tipo selvatico lac e uno mutante lac. In presenza di glucosio entrambi crescono, in presenza di lattosio il selvatico cresce mentre il mutante no.

Resistenza → oltre agli antibiotici, ci sono anche altre sostanze chimiche o metalli pesanti che impediscono la crescita dei batteri, ma anche la presenza di virus batteriofagi. Il wild type in presenza di queste cose non cresce. Il mutante invece, ha acquisito la capacità di resistere quindi cresce lo stesso. In questo caso la presenza di un batterio mutante si può rilevare utilizzando dei terreni selettivi:

minimo + inibitore della crescita(antibiotici, virus…). Per individuare i mutanti si utilizzano un minimo edei terreni selettivi, poi si confronta selvatico con imutanti. In un terreno con la streptomicina noncresce il ceppo selvatico, un ceppo mutante invececresce sia su terreno minimo e anche sul terrenoRcon antibiotico (St = resistente allastreptomicina). Se nel terreno c’è un virusR Rbatteriofago (es. fago T1) il selvatico e St non crescono, mentre il ceppo resistente al fago cresce lo stesso (T1= resistente al fago). Auxotrofi o mutanti nutrizionali → il ceppo selvatico sidefinisce prototrofo, cioè in grado di sintetizzare le sostanzeorganiche necessarie per la crescita (aminoacidi, vitamine,precursori dell’RNA e DNA). Per produrre una molecolacomplessa non basta una reazione ma serve una via metabolica, cioè una catena di reazioni successive che a30partire da un substrato lo trasforma in una specifica molecola. I prototrofi possiedono

tutti i geni necessari per completare le vie metaboliche (e i geni sono funzionali). Il mutante auxotrofo invece, manca di qualcosa. Non è in grado di sintetizzare una delle molecole (es. non può produrre un amminoacido). Questo avviene in quanto uno dei geni della catena non è funzionale. Questo tipo di mutante può crescere solamente su un terreno dove è presente la sostanza che non è in grado di produrre (deve essere fornita dall'esterno). Arg non produce l'arginina; Bio non produce la biotina (che è una vitamina e uno stimolatore della crescita).

Tecnica per isolare i mutanti auxotrofi → tecnica del replica plating (Ester e Joshua Lederberg 1952) In laboratorio è importante avere dei mutanti, e quindi saperli isolare. Si parte da una piastra Petri con un terreno completo, che permette la crescita di tutte le colonie (qualsiasi sia la loro carenza). Di questa collezione di batteri che sono cresciuti, si può fare un

lattosio come fonte di C. Il terreno sarà terreno minimo+ arginina e uno zucchero diverso dal lattosio (es. glucosio).

Mutanti condizionali

I mutanti condizionali sono mutanti che esprimono il loro fenotipo solo se fatti crescere in condizioni restrittive, cioè diverse dalle condizioni ottimali. Se in condizioni normali il batterio cresce, sembra normale, se cambiano le condizioni il mutante non cresce più.

Questi mutanti spesso si usano nella ricerca. Si trovano anche in altri organismi, non solo nei batteri.

Importanza dei mutanti condizionali → possono essere impiegati per studiare i geni delle funzioni metaboliche di base. Le mutazioni in questi geni conferiscono letalità, quindi di solito è difficile studiarle.

Esempio: i mutanti per il gene che codifica l'enzima DNA polimerasi. Si usa un mutante che si manifesta a temperature restrittive, mentre se lo faccio cresce a temperatura permissiva il mutante può crescere (così non muore).

subito).● A T restrittive: fenotipo mutante = assenza di crescita● A T permissiva: cresce e può essere mantenuto in laboratorio 31UN GENE UN ENZIMADeficienze enzimatiche a base genetica nell'uomoNel 1899 lo studioso inglese Garrod aveva descritto una "bizzarra" malattia che aveva osservato per la primavolta in un neonato. Parecchie ore dopo il parto si era rinvenuto nei pannolini dell'urina scura. Rintracciandometicolosamente i pazienti di quel tipo e i loro parenti, Garrod aveva scoperto che la malattia ricorreva nellefamiglie e continuava nell'età adulta. Garrod immaginò che in questi pazienti vi fosse un fattore ereditarioalterato.Questa malattia si chiama l'alcaptonuria (ACU) e comporta la presenza di urine scure. Questo fenotipo èdeterminato dalla presenza di acido omogentisico. La malattia è frequente nei matrimoni tra consanguinei.L'alcaptonuria è dovuta ad un errore nel metabolismo di questocomposto,