Genetica batterica

Genetica batterica

Una mutazione è un cambiamento ereditabile in una sequenza di basi dell'acido nucleico nel genoma di un organismo. Un ceppo che porta tale cambiamento viene detto mutante. Un ceppo mutante differisce dal ceppo parentale nel genotipo, ovvero nella sequenza nucleotidica del suo genoma. Inoltre, le proprietà osservabili del mutante sono il fenotipo. È comune riferirsi a un ceppo isolato in natura come un ceppo di tipo selvatico.

Adattamento fisiologico

Consiste nella manifestazione di un nuovo fenotipo in relazione al cambiamento ambientale. Alcune mutazioni sono selezionabili in quanto conferiscono alcuni vantaggi agli organismi che le possiedono mentre altre sono non selezionabili anche se portano a un profondo cambiamento del fenotipo di un organismo. Una mutazione selezionabile conferisce al mutante un vantaggio in certe condizioni ambientali per cui la progenie della cellula mutante è in grado di crescere in modo tale da sostituirsi a quella parentale.

Un esempio di mutazione selezionabile è la resistenza ai farmaci. I microrganismi antibiotico-resistenti possono crescere in presenza di concentrazioni di antibiotico che inibisce o uccide il parentale ed è così selezionato in queste condizioni. Un esempio di mutazione non selezionabile è quello della perdita di colore in un organismo pigmentato. Per le cellule mutate non presenta né un vantaggio né uno svantaggio, rispetto alle colonie parentali pigmentati, quando crescono in piastre di agar.

Adattamento genetico

Comparsa di nuovi fenotipi che vengono selezionati positivamente dall'ambiente perché più adatti.

L'isolamento di mutanti auxotrofi nutrizionali e la selezione con penicillina

Possono essere identificati mutanti nutrizionali difettivi attraverso la tecnica del replica plating. Con l'ausilio di un velluto sterile una carta da filtro viene ottenuta una stampa delle colonie da una piastra madre su un'altra piastra di agar mancante di alcuni nutrienti. Le colonie di tipo parentali cresceranno normalmente ma non quelle dei mutanti. Quindi l'incapacità di una colonia di crescere sulla piastra replicata contenente un terreno minimo la segnala come mutante. La colonia sulla piastra madre che corrisponde al punto vuoto nella piastra replicata può essere quindi prelevata, purificata e caratterizzata. Un mutante che presenta nutrizionale particolare viene detto auxotrofo. Il ceppo selvatico parentale da cui l'auxotrofo deriva è detto prototrofo. Per esempio, i mutanti di Escherichia coli con il fenotipo His sono detti auxotrofi per l'istidina.

Un altro metodo largamente impiegato per l'isolamento degli auxotrofi è il metodo della selezione con penicillina. La penicillina è un antibiotico che uccide solamente le cellule che crescono, infatti essa viene aggiunta a una popolazione che cresce in un terreno privo del fattore di crescita necessario per ottenere il mutante desiderato, le cellule del mutante che non si sviluppano resteranno vitali. Pertanto, dopo un'incubazione preliminare, in assenza del fattore di crescita in un terreno contenente penicillina, la popolazione viene lavata dalla penicillina e trasferita in piastre contenenti il fattore di crescita. Tra le colonie che si sono sviluppate, comprese alcune cellule selvatiche che sono sfuggite all'effetto della penicillina, ci saranno i mutanti per il fattore di crescita. La selezione con la penicillina è quindi una specie di selezione negativa perché essa non è a favore del mutante ma è contro il ceppo parentale.

Tipi di mutanti

• Mutanti nutrizionali o auxotrofi: Hanno perso la capacità di sintetizzare metaboliti e necessitano di un supplemento nutritivo per la crescita.
• Mutanti letali condizionali: Sono capaci di crescere in certe condizioni ambientali e non in altre. Per esempio, mutanti temperatura-sensibili sono capaci di crescere a 20°C e non a 42°C mentre il ceppo selvatico cresce a entrambe le temperature.
• Mutanti resistenti: Sono mutanti resistenti a sostanze antimicrobiche come antibiotici e virus.

Test di fluttuazione

Ricorrendo all'analisi della fluttuazione del numero di mutanti di E. coli resistenti al fago T1, i mostrarono che le variazioni osservate nei batteri rappresentavano effettivamente delle mutazioni che insorgevano spontaneamente in coltura, in assenza di induzione da parte di fattori esterni, confutando in tal modo la teoria adattativa. Batteri provenienti da una coltura di E. coli, originata da una singola cellula sensibile al fago T1, vengono inoculati contemporaneamente in una beuta e in diverse provette contenenti terreno nutritivo. Ogni inoculo è costituito da un numero basso di batteri (50-500), in modo da avere una probabilità molto alta di non avere mutanti resistenti al fago. Quando si è raggiunta la crescita massima nelle colture, si semina un'aliquota dei batteri di ogni coltura in provetta su una piastra, contemporaneamente a un numero di fagi da poter uccidere tutte le cellule sensibili.

Analogamente, aliquote di batteri vengono prelevate dalla beuta e seminate su diverse piastre insieme ai batteriofagi. Le piastre vengono poi inoculate per permettere l'uccisione delle cellule sensibili e la formazione di colonie da parte delle eventuali cellule resistenti. Se i mutanti si originassero in seguito al contatto con il fago (teoria adattativa), dato che in ogni piastra è stato seminato un egual numero di batteri, ci si aspetterebbe per tutte le piastre un identico numero di colonie (con variazioni minime). Se invece le mutazioni avvenissero a caso durante la crescita in coltura, prima cioè che le cellule vengano esposte in coltura (teoria genica), il numero di mutanti resistenti atteso per ogni provetta dovrebbe dipendere dal momento della comparsa del primo mutante e quindi fluttuare: prima avviene la mutazione durante la crescita, e più numerosi saranno i batteri resistenti alla fine della crescita. I risultati mostrarono che vi è effettivamente una grande fluttuazione nel numero delle colonie nelle piastre dove sono state seminate le colture indipendenti: infatti in alcune piastre le colonie sono assenti, in alcune sono pochissime e in altre più numerose.

Le basi molecolari delle mutazioni

Le mutazioni possono essere spontanee o indotte. La mutazione spontanea può essere risultato dell'azione di una radiazione naturale sulle basi del DNA. Le mutazioni che coinvolgono la sostituzione in una coppia di base sono definite mutazioni puntiformi. Come in tutte le mutazioni, l'alterazione del fenotipo che risulta da una mutazione puntiforme dipende dal punto esatto in cui la mutazione è situata nel gene, dal tipo di sostituzione nucleotidica e da quale prodotto è normalmente codificato dal gene.

Sostituzione di paia di basi

Quando in un gene si verifica una mutazione puntiforme nella regione codificante una proteina, è quasi certo che ci sarà qualche alterazione del fenotipo della cellula come conseguenza dell'alterazione della sequenza degli amminoacidi e del polipeptide prodotto. L'errore nel DNA viene trascritto nel mRNA che viene a sua volta tradotto per produrre la proteina. Il codice a triplette sarà sbagliato. A causa della degenerazione del codice genetico non tutte le mutazioni dei geni che codificano polipeptidi determinano un cambiamento nel polipeptide stesso.

Un cambiamento nell'RNA da UAC a UAU sembra non avere alcun effetto evidente, poiché anche UAU è un codone della tirosina. Le mutazioni che inducono questi cambiamenti sono sempre mutazioni ma non interferiscono nella sequenza primaria del polipeptide e si chiamano mutazioni silenti. Queste mutazioni cadono sempre nella terza base. I cambiamenti nella prima o seconda base della tripletta possono condurre a alterazioni significative nel polipeptide. Un singolo cambiamento di base da UAC a AAC determina la sostituzione di un aminoacido da tirosina a asparagina. Questa mutazione è definita missenso. Se l'alterazione è avvenuta in un punto critico della catena polipeptidica, la proteina può risultare inattiva o con ridotta attività.

Un altro risultato possibile della sostituzione di una coppia di basi è la formazione di codoni di stop. Avviene la terminazione prematura della traduzione che porta a proteine incomplete. Queste mutazioni sono dette mutazioni nonsenso.

• Le transizioni coinvolgono mutazioni in cui una base purinica è sostituita con un'altra purina (o pirimidina con pirimidina).
• Le trasversioni sono mutazioni puntiformi dove una base purinica è sostituita con una pirimidina e viceversa.

Scivolamento della schema di lettura

Poiché il codice genetico viene letto in triplette, ogni perdita o inserzione di una coppia di basi determina uno scivolamento della lettura (frame shift).

Retromutazioni o inversioni

Le mutazioni puntiformi sono generalmente reversibili attraverso le reversioni. Un revertante è un ceppo in cui il fenotipo selvatico, che era stato perso nel mutante, viene ripristinato. I revertanti possono essere:

• Revertante dello stesso sito: la mutazione che ripristina l'attività, si verifica nel medesimo sito della mutazione originale.