Genetica batterica

Si prepara una coltura per ogni mutageno che si vuole analizzare, e in seguito per ogni mutageno utilizzato

si effettua anche un controllo con una sostanza neutra.

Dalle colture potremo ottenere che :

1)Se non si ha la formazione di un certo numero di colonie la sostanza in esame non è cancerogena. Lo

stesso si osserva nel controllo

2) Se la sostanza che si ritiene cancerogena, rende il microrganismo capace di poter sintetizzare

nuovamente l'istidina, viene considerato mutageno.

La ricombinazione genetica

la ricombinazione comporta lo scambio fisico tra materiale genetico tra elementi genetici.

Si parla di ricombinazione omologa quando lo scambio avviene tra sequenze omologhe di DNA di due

origini differenti. (crossing over).

Nei batteri la ricombinazione omologa coinvolge la proteina RecA.

Il processo comincia con un taglio, in una delle due molecole di DNA con la formazione di un frammento.

Una proteina che lega il DNA a singola elica si associa a questo frammento, seguita dalla proteina RecA,

formando un complesso che facilita il riappaiamento con la sequenza complementare nel DNA duplice

adiacente, mentre avviene in modo simultaneo lo spostamento del filamento residente (invasione del

filamento).

Affinché possano emergere nuovi genotipi è importante che le sequenze omologhe siano geneticamente

distinte. Nei procarioti, si ovvia attraverso tre processi: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

Attraverso questi meccanismi i frammenti di DNA omologo vengono trasferiti dal cromosoma di una cellula

donatrice a quella ricevente. Solo dopo il trasferimento, avviene la ricombinazione omologa.

Trasformazione

La trasformazione è il trasferimento di materiale genetico da un batterio all'altro mediato da frammenti di

DNA extracellulare (questo DNA può provenire da cellule morte o può essere estratto e somministrato

artificialmente a cellule riceventi).

Essa inizia quando il DNA a doppio filamento viene agganciato da un recettore sulla superficie della cellula

ricevente. Appena viene tirato all'interno, grazie alla trascrizione di alcuni geni che sono attivati in seguito

a stimoli ambientali, un filamento del DNA viene degradato e l'altro, invece, risulta protetto dalla

degradazione mediante una proteina di rivestimento.

Successivamente questo singolo filamento di DNA trasformante invade il cromosoma della cellula ricevente

appaiandosi con il filamento complementare del DNA e rimpiazzando quello ad essi equivalente. Il

filamento sostituito viene quindi anch'esso degradato. Se le cellule donatrici e riceventi portano differenti

alleli di un gene, la risultante doppia elica ricombinante avrà un allele su un filamento e l'altro sul secondo

filamento. Questo tipo di DNA a doppia elica, che viene detto eteroduplex (una doppia elica “eterozigote”),

segrega poi in due omoduplex quando viene replicato.

La competenza

All'interno di generi batterici "trasformabili", solo alcuni ceppi o specie sono in grado di essere trasformati.

Una cellula in grado di assumere una molecola di DNA e di essere trasformata è detta competente, e questa

caratteristica è determinata geneticamente. Nella maggior parte dei batteri naturalmente trasformabili, la

competenza è regolata e vi sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e processare il DNA.

Esse possono comprendere una proteina associata alla membrana che si lega al DNA,un'autolisina della

parete cellulare e varie nucleasi. Uno dei meccanismi di attivazione della competenza naturale

in Bacillus subtilis, una specie batterica facilmente trasformabile, fa parte di un sistema "quorum-sensing",

regolato da un sistema a due componenti. Le cellule, durante la crescita, producono e secernono un piccolo

peptide e, in presenza di un'elevata concentrazione di questo peptide, divengono competenti.

La trasduzione

La trasduzione è una modalità di trasferimento genico, dove il trasferimento dei geni batterici è mediato da

batteriofagi. Esistono due tipi di trasduzione:

1. la trasduzione generalizzata dove un frammento casuale di DNA batterico viene impacchettato nella testa

del fago al posto del cromosoma fagico, con formazione di una particella trasducente.

2.La trasduzione specializzata dove si è verificato un evento di ricombinazione tra il cromosoma ospite e il

cromosoma fagico, producendo quindi un cromosoma fagico che contiene un pezzo di DNA batterico e uno

fagico.

Nella trasduzione generalizzata, durante il ciclo litico

nella testa del virus( temperato o virulento), possono

essere incorporati frammenti di DNA batterico. Si forma

una popolazione mista con fagi che contengono i geni

virali di origine, e fagi con DNA batterico; questi

ultimi possono poi inoculare i geni batterici in un

nuovo batterio, così, il DNA inoculato si fonde con

quello batterico. A differenza della trasduzione

specializzata, vi saranno particelle trasducenti

contenenti solamente DNA fagico o solamente DNA

cromosomico La trasduzione specializzata è, invece, caratteristica di virus

temperati che trasferiscono solo certi tipi di geni tra i

batteri. Il batteriofago lambda è il fago trasducente

specializzato conosciuto in modo

più approfondito. Esso trasporta i geni gal (richiesto per

l'utilizzo del galattosio come fonte di energia) e bio

(essenziale per la sintesi della biotina) da una cellula di

E.coli ad un'altra.

Il sito specifico dell'integrazione del cromosoma circolare di

si trova tra i geni gal e bio del cromosoma batterico,

motivo per cui il fago trasduce questi geni in modo così

specifico. Il cromosoma integrato va incontro a rare

escissioni spontanee e in seguito alle quali entra nella via

litica. L'escissione del profago può essere anche indotta

irradiando le cellule lisogeniche con raggi ultravioletti. La

normale escissione è essenzialmente l'opposto del processo di

integrazione sito-specifica e porta ad un fago ed un

cromosoma circolari intatti.

Occasionalmente, l'escissione, è imprecisa, con un crossing-over che si verifica ad un sito differente da

quello originario di attacco. Quando questo avviene, una porzione del cromosoma batterico viene escissa

insieme al DNA fagico ed una porzione del cromosoma fagico viene lasciata nel cromosoma ospite.

L'escissione anomala del profago, quindi, produce fagi trasducenti specializzati che portano i geni gal e bio

dell'ospite.

Erroneamente il fago excidendosi dal cromosoma può incorporare le regioni fiancheggianti il sito att

gal bio

costituite dai geni o dai geni generando cosi fagi difettivi per quanto riguarda il genoma fagico ma

portatori di segmenti di DNA cromosomico.

I fagi lambda dgal o lambda dbio contengono quindi sia DNA fagico che DNA cromosomico.

I fagi trasducenti lamda dgal o lambda dbio sono fagi difettivi in quanto l’acquisizione di geni cromosomici

è compensata dalla perdita di genoma fagico.

Le particelle saranno quindi difettive e potranno replicarsi solo in presenza di un fago helper.

Conversione fagica

E’ quando un fago temperato normale (che non è difettivo) lisogenizza una cellula e il suo DNA viene

convertito allo stato di profago, la cellula lisogena risulta immune da ulteriore infezione da parte dello

stesso tipi di fago.

CICLO LITICO: il DNA si replica, vengono sintetizzati RNA e proteine virali; queste ultime si uniscono fra

loro (si assemblano) per formare nuovi virus, nella cui testa si inserisce il genoma virale neoformato. Ogni

batterio infettato da virus si trasforma così in una fabbrica di nuove unità virali. Al termine del processo, il

batterio va incontro a lisi e a liberazione dei virus, che vanno poi ad infettare altri batteri.

CICLO LISOGENO: quando il virus infetta il batterio il suo DNA va ad integrarsi nel DNA batterico.

I fagi che hanno un ciclo lisogeno vengono chiamati virus temperati, perché il loro DNA si integra nel

cromosoma batterico e come esso si comporta; di conseguenza, viene trasferito alle nuove generazioni senza

determinare alcun danno per il batterio. Questo stato di quiescenza può essere tuttavia spezzato da stimoli

opportuni (raggi UV, stress ecc.); in queste situazioni il DNA virale si può staccare (excidere), passando dal

ciclo lisogeno a quello litico.

I plasmidi

I plasmidi sono elementi genetici in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma per questo vengono

definiti anche repliconi. La maggior parte di essi è costituita da DNA a doppia elica e ha forma circolare,

sebbene ne siano noti di lineari.

Si differenziano dai virus per due motivi: (1) non provocano danni alla cellula (anzi, generalmente sono

vantaggiosi per la cellula ospite) e (2) non hanno una vita extracellulare. I plasmidi sono stati trovati

soltanto in alcuni eucarioti, mentre sono ampiamente diffusi nei procarioti, dove possono svolgere un ruolo

di fondamentale importanza nella biologia del microrganismo. Infatti, alcuni plasmidi contengono geni in

grado di conferire alla cellula ospite caratteristiche importanti, come la resistenza agli antibiotici o a ioni

metallici.

Inoltre a differenza del cromosoma, che contiene i geni (housekeeping) che codificano prodotti coinvolti

nelle funzioni essenziali della cellula, i plasmidi non sono essenziali e generalmente codificano geni che

sono necessari per la crescita soltanto in condizioni particolari. I plasmidi possono essere di grandi

dimensioni o di piccole dimensioni. Generalmente quelli di grandi dimensioni sono coniugativi, ossia in

grado di trasferirsi da una cellula all'altra. Mentre quelli di piccole dimensioni non sono coniugativi e

spesso mobilizzabili, ovvero capaci di utilizzare il sistema di trasferimento di un altro plasmide di tipo

coniugativo presente nella cellula).

Un'altra importanza fondamentale dei plasmidi è la loro capacità di permettere il trasferimento genetico tra

le diverse specie e sono tra i principali responsabili del trasferimento genico orizzontale (HGT), ossia il

fenomeno per il quale i geni sono trasferiti da una cellula ad un'altra attraverso un processo diverso da

quello ereditario, che consiste nel passaggio dalla cellula madre a quella figlia.

Tra le caratteristiche funzionali che i plasmidi sono in grado di conferire, figurano:

la produzione o la resistenza agli antibiotici o farmaci in generale (plasmide R), ai metalli pesanti e

• ai raggi UV;

l'utilizzo di fonti di carbonio insolite o la fissazione di azoto inorganico nel suolo;

• la produzione di proteine in grado di uccidere gli altri batteri (batteriocini);

• Agrobacterium tumefaciens).

la virulenza (plasmide T di

•

La replicazione dei plasmidi, può avvenire in tre modi: replicazione monodirezionale (una sola forcella di

replicazione lascia l'origine e procede lungo il DNA), replicazione bidirezionale (si formano due forcelle di

replicazione che procedono dall'origine in direzioni opposte) oppure replicazione a cerchio