Genetica dei microorganismi

La mappatura genica mediante trasformazione

Se due geni a e c sono lontani sul cromosoma del DNA donatore, poiché esso tipicamente si rompe in piccoli frammenti, i due geni saranno posti su frammenti diversi di DNA. La cotrasformazione è la probabilità di trasformazione contemporanea da una cellula ricevente a c in una cellula selvatica a c, tale probabilità è pari a 10^-3. Ciò significa che si avrà una cellula trasformata a c, ovvero una cellula assume due geni diversi dai suoi contemporaneamente, ogni 10 cellule riceventi, questo nel caso i due geni fossero posti su frammenti del DNA diversi.

Se invece due geni a e b sono sufficientemente vicini da essere presenti sullo stesso frammento di DNA del donatore, allora la frequenza di cotrasformazione sarà simile alla frequenza di trasformazione del gene singolo, ovvero 10^-3. Quindi, più la frequenza di cotrasformazione è maggiore, minore sarà.

utilizzando il processo di coniugazione batterica. Durante questo processo, il plasmide F viene trasferito da una cellula F (donatrice) a una cellula F- (ricevente). La coniugazione batterica è mediata dalla presenza del plasmide di fertilità (plasmide F), che è un tipo particolare di diplasmide. Il plasmide F è un grande plasmide di circa 100.000 nucleotidi, che si presenta come una molecola circolare. Ogni cellula batterica può contenere un basso numero di copie di questo plasmide e lo replica solo una volta per ciclo cellulare. Le cellule batteriche che contengono il plasmide F sono chiamate cellule F, mentre quelle prive di questo plasmide sono chiamate cellule F-. Il plasmide F contiene una regione chiamata regione tra, che occupa circa un terzo della sequenza del plasmide. In questa regione sono presenti circa una ventina di geni che consentono al plasmide di essere trasferito da una cellula all'altra. Questi geni sono responsabili del meccanismo di coniugazione del plasmide. Il trasferimento del plasmide F tra due cellule batteriche avviene attraverso il processo di coniugazione batterica. Durante questo processo, la cellula F (donatrice) forma un ponte citoplasmatico chiamato pilo con la cellula F- (ricevente). Attraverso questo pilo, il plasmide F viene trasferito dalla cellula donatrice alla cellula ricevente, consentendo così il passaggio dei geni contenuti nel plasmide.

Attraverso una struttura tubulare chiamata pilus, e il processo attraverso il quale avviene l' scambio di materiale genetico è chiamato appunto coniugazione. I plasmidi che possono essere trasferiti tramite coniugazione sono detti plasmidi coniugativi, la maggior parte dei piccoli plasmidi però non è di questa tipologia, in quanto, per definizione, ha dimensioni troppo piccole per tale processo.

Il meccanismo della coniugazione:

1. Prima del trasferimento, un complesso di proteine, detto relaxosoma, si lega all'origine del fattore F, chiamata oriT.
2. L'enzima relaxase taglia, in un unico punto, il fattore F e si lega covalentemente all'estremità 5' del DNA e ne srotola circa 200 nucleotidi, tale porzione di DNA a singola elica è la prima ad essere trasferita attraverso il pilo nella cellula F.
3. Si parla di un meccanismo di replicazione a cerchio rotante, infatti il trasferimento di DNA è sempre accompagnato alla replicazione del plasmide F.

secondo la modalità "a cerchio rotante", chiamato in questo modo perché quando il trasferimento è completo la molecola lineare F diventa circolare nella cellula ricevente. Al termine della coniugazione, si dovrebbero ottenere una cellula F e una cellula F trasformata in F+, entrambe le quali contengono una copia completa del plasmide F, perché ciò si realizzi deve avvenire una sintesi semi-conservativa del plasmide F, sia nella cellula donatrice che nella cellula ricevente. Le cellule che si sono formate, contengono il plasmide F e possono fungere da donatrici. Dopo il trasferimento, entrambe le cellule contengono il plasmide F e possono fungere da donatrici, infatti, la cellula ricevente F è stata convertita in cellula F+.

Il trasferimento del DNA che avviene tramite il processo di coniugazione batterica occupa un tempo di circa 2 minuti. Infatti, in condizioni di laboratorio poche cellule donatrici sono in grado di convertire a F un grande numero.

di cellule F, tutto ciò in poche ore. È presente un'altra modalità di coniugazione batterica, tale tipologia si verifica nelle cellule hfr. In alcune cellule, infatti, il fattore F non è presente come plasmide F, ma si integra nel cromosoma batterico mediante ricombinazione a livello di sequenze omologhe, è questo un caso in cui i plasmidi possono essere definiti episomi. Le cellule hfr, ovvero high frequency of recombination, in quanto si osserva un'alta frequenza di trasferimento di geni da una cellula hfr donatrice a un batterio ricevente. Le sequenze di inserzione, dette elementi IS, presenti sul cromosoma batterico e sul fattore F mediano l'integrazione di quest'ultimo. La replicazione e il trasferimento del DNA cromosomico ad esso associato sono controllati dal fattore F e hanno origine dal sito oriT. Nell'incrocio tra Hfr e F, la prima ad essere trasferita sarà una parte di F, poi il cromosoma batterico e solamente in

fine la rimanente parte di F. In questa tipologia di accoppiamento, il DNA che si trasferisce non diventa circolare perché il fattore F non si trasmette completamente, infatti le due cellule si allontanano prima del completamento del trasferimento dell'intero cromosoma batterico e della parte finale di F. Inoltre, l'inserzione del DNA donatore nel cromosoma ricevente richiede due eventi di ricombinazione omologa nella cellula ricevente. Le differenze tra le due tipologie di coniugazione batterica sono:

• Teoricamente, occorrono circa 100 minuti per il trasferimento di un intero cromosoma batterico tra le cellule Hfr e le cellule F, mentre tra cellule F- e cellule F il tempo di trasferimento è di circa 2 minuti.
• Durante il trasferimento di DNA da parte di un Hfr, l'accoppiamento si interrompe prima che l'intero cromosoma sia trasferito, ciò nonostante, possono essere trasferiti comunque molti geni. Nel caso del passaggio tra cellule F e cellule F

però il cromosoma riesce ad essere trasferito+ -completamente, mentre nel caso delle cellule Hfr no.- In un accoppiamento tra Hfr e F la cellula ricevente rimane F , mentre tra- -cellule F e F la cellula ricevente diventa F .+ - +- Nel trasferimento di un Hfr alcune regioni del DNA trasferito possonoessere incorporate nel cromosoma ricevente. Il risultato è che alcunecellule F diventano ricombinanti, ma in ogni caso il genoma Hfr rimane-inalterato.Analisi genetica dei ricombinanti in unincrocio tra Hfr e F :-Per identificare i riceventi ricombinati èopportuno eliminare le cellule donatriciHfr, a tal fine è utile usare delle celluleF che abbiano un marcatore-selezionabile, come ad esempio laresistenza ad un antibiotico.La coniugazione batterica è statasfruttata dai ricercatori per creare unamappa genica in cui sono presenti igeni presenti sul cromosoma batterico.Tale mappa genica può essere ottenutain base all’ordine di trasferimento

deigeni da una cellula Hfr ad una cellula F-,ciò tramite la tecnica dell'accoppiamento interrotto, il quale consiste nell'interruzione volontaria, tramite agitazione violenta della coltura, a intervalli di tempo definiti durante gli incroci. Tramite le mappe geniche si può dedurre che i tempi d'ingresso possono essere riassunti in una mappa lineare, i cui numeri espressi in minuti rappresentano le distanze genetiche tra i marcatori. Per ogni marcatore c'è un tempo di ingresso prima del quale non si osserva alcun ricombinante, il numero di ricombinanti aumenta con il tempo, in quanto diverse coppie di cellule iniziano la coniugazione in tempi leggermente diversi. Dalla combinazione di varie mappe genetiche è stato possibile ottenere l'intera mappa del cromosoma circolare di E. Coli, la cui lunghezza totale è di 100 minuti, ovvero il tempo teorico necessario per il completo trasferimento di un cromosoma. Nel 1958, il premio Nobel per la

medicina fu vinto da George Wells Beadle, Edward Lawrie Tatum e Joshua Lederberg per i loro studi sulla sessualità batterica. 3 dicembre 2021

Gli elementi trasponibili sono delle sequenze di DNA in grado di muoversi da un punto ad un altro del genoma, tali elementi possono causare mutazioni o promuovere riarrangiamenti cromosomici, possono inoltre intervenire nella regolazione dell'espressione genica. Solitamente questa tipologia di elementi contiene l'informazione che dona la resistenza agli antibiotici, quando la sequenza si mobilizza, porta con sé il tratto di DNA del plasmide, il quale poi potrà essere veicolato in altre cellule, donando così anche ad essa la resistenza all'antibiotico in questione. Gli elementi trasponibili sono molto presenti nelle cellule batteriche, ma si possono trovare anche nelle cellule eucariotiche, infatti, circa il 45% del nostro organismo è composto da sequenze che rientrano nella

categoria di elementi trasponibili. Il loro spostamento è comunque abbastanza raro. Gli elementi trasponibili possono essere distinti in:

• Sequenze di inserzione -> dette anche elementi IS, sono la tipologia di elementi trasponibili più piccola, hanno infatti una lunghezza che va da 1 a 3 kilo basi, che solitamente codificano per una trasposasi, necessaria per la trasposizione. Le sequenze di inserzione possiedono brevi sequenze ripetute alle estremità utilizzate dalla trasposasi per il riconoscimento e la mobilizzazione dell'elemento IS. La frequenza di trasposizione è approssimativamente 1 evento su 10^5-10^7.
• Trasposoni -> sono un'altra tipologia di elementi trasponibili, contengono, oltre alla trasposasi, uno o più geni addizionati che possono essere trasferiti assieme all'elemento trasponibile. Tali geni vengono chiamati Tn+numero (ad esempio Tn5). I trasposoni assomigliano alle sequenze di inserzione, ma la lunghezza tipica di un trasposone è maggiore.

trasposone è di qualche kilobase, la diffusione dellaresistenza agli antibiotici tra i batteri è dovuta anche alla mobilitazione ditrasposoni che contengono geni per la resistenza agli antibiotici.- Retrotrasposoni.

Esistono due diversi meccanismi di trasposizione deli elementi mobili:

• La trasposizione conservativa - è un meccanismo del tipo "taglia e incolla", ovvero un meccanismo non replicativo. Tale procedimento prevede un'excisione dell'elemento trasponibile che, successivamente, viene integrato nel sito bersaglio.
• La trasposizione replicativa -