Genetica base

Genetica e struttura del DNA

Il DNA è un polimero dato dalla ripetizione di monomeri di base il cui nome è nucleotidi. Ogni nucleotide è dato da tre elementi:

• 1 zucchero pentoso (ribosio/RNA o desossiribosio/DNA);
• 1 base azotata (A, C, G e T/U);
• 1 gruppo fosfato (determina la carica negativa del DNA).

Nucleoside: base azotata più zucchero.

Zucchero pentoso: zucchero a 5 atomi di carbonio.

Basi azotate

Distinte in:

• Purine (adenina e guanina);
• Pirimidine (citosina, timina e uracile).

Gruppo fosfato: gruppo che dà la carica all’intera molecola e che ne determina il nome di acidi.

La scoperta del DNA

La scoperta del DNA è sempre associata a J. Watson e F. Crick. Essi furono i primi ricercatori a svolgere un lavoro di modellistica in modo da unire coerentemente tutti i dati che erano stati ottenuti fino ad allora. Grazie a Watson e Crick noi oggi sappiamo che il DNA è una doppia elica formata da due filamenti tenuti insieme da legami chimici chiamati “legami ad idrogeno”. Altre persone che diedero un contributo furono R. Franklin e M. Wilkins.

Struttura del DNA

Il DNA ha una struttura ordinata in cui si distingue una parte elettrondensa all’esterno e una parte più vuota all’interno dove si trovano le basi azotate. Le basi si legano l’un l’altra grazie a legami a idrogeno (legami deboli che possono essere facilmente alterati).

La differenza tra DNA ed RNA (oltre allo zucchero pentoso e a una base azotata) è che il DNA è una molecola a doppia elica mentre l’RNA è una molecola formata da un solo filamento.

In una molecola di DNA/RNA i nucleotidi sono legati tra di loro grazie a un legame covalente tra il carbonio 5’ del nucleotide più in basso e il carbonio 3’ del nucleotide più in alto. Questo legame viene chiamato legame 3’-5’ fosfodiesterico, questo significa che è un legame che unisce l’estremità 5’ di un nucleotide all’estremità 3’ del nucleotide successivo con un gruppo fosfato che fa da ponte. È importante distinguere le due estremità in quanto il DNA ha una polarità e decorre sempre dall’estremità 3’ a quella 5’.

Elica e legami del DNA

Entrando più nel dettaglio, il DNA è un’elica destrorsa data da 2 catene antiparallele ed ha un diametro di 2 nm. Lo scheletro è dato dagli zuccheri e dai gruppi fosfato legati tra di loro dal legame 3’-5’ fosfodiesterico, mentre le basi sono rivolte verso il centro della molecola. Le basi non si appaiano casualmente ma T con A e C con G. Gli spazi vuoti sono occupati da molecole di acqua.

A causa del tipo di legame tra le basi, la doppia elica non è regolare ma presenta un solco maggiore e un solco minore. Il DNA considerato finora viene chiamato B-DNA.

DNA come materiale genetico

DNA: materiale genetico (molecola che porta le informazioni).

Genoma: complesso di geni di una cellula o organismo.

Il materiale genetico deve avere le seguenti proprietà:

• Deve avere una forma stabile (la molecola deve essere stabile nel tempo);
• Deve replicare accuratamente (le cellule devono ricevere la stessa qualità e la stessa quantità di materiale genetico);
• Deve essere in grado di cambiare e stabilizzare tali cambiamenti (deve poter mutare, una mutazione è una variazione del materiale genetico che permette all’organismo di avere qualche forma di innovazione).

Sino al 1928 il materiale genetico sembrava essere dato da proteine o meglio, le proteine erano ottime candidate poiché l’elevato numero di amminoacidi rendeva possibile codificare anche messaggi complessi.

Esperimento di Griffith (1928)

Nel 1928 Griffith svolse un esperimento che coinvolgeva topi da laboratorio e due ceppi di un batterio chiamato Streptococcus pneumoniae.

• Ceppo R: ruvido e non virulento
• Ceppo S: liscio e virulento (ambedue le proprietà derivano dall’involucro saccaridico)

L’esperimento prevedeva l’iniezione dei batteri nei topi secondo queste modalità:

1. Topo + ceppo R = topo vivo e no batteri
2. Topo + ceppo S = topo morto e batteri del ceppo S
3. Topo + ceppo S inattivato = topo vivo e no batteri
4. Topo + ceppo R + ceppo S inattivato = topo morto e batteri del ceppo S

La terza modalità ci fa capire che questi batteri sono virulenti solo se sono in grado di produrre alcune molecole. Nell’ultimo caso si può dedurre che ci sia stato un principio trasformante ovvero un passaggio di una molecola che ha fatto sì che i batteri non virulenti si siano “trasformati” in batteri virulenti.

Esperimento di Avery (1944)

Per cercare di identificare la molecola in questione nel 1944 Avery ripeté l’esperimento di Griffith però anziché iniettare il ceppo virulento ucciso dal calore Avery iniettò nei topi altre molecole (lipidi, polisaccaridi, proteine e acidi nucleici) derivanti dal ceppo virulento.

1. Topo + ceppo R + lipidi = topo vivo
2. Topo + ceppo R + polisaccaridi = topo vivo
3. Topo + ceppo R + proteine = topo vivo
4. Topo + ceppo R + acidi nucleici = topo morto e batteri di tipo S

Per individuare quale molecola tra DNA ed RNA fosse la causa della trasformazione Avery trattò una miscela di acidi nucleici con un enzima detto RNasi (rimane DNA) e l’altra con un enzima detto DNasi (rimane RNA). Il risultato dell’unione di queste due soluzioni fu:

1. Topo + ceppo R + RNA = topo vivo
2. Topo + ceppo R + DNA = topo morto e batteri di tipo S

Da questo esperimento Avery concluse che il principio trasformante doveva essere il DNA (non è ancora confermato in quanto la soluzione contenente DNA è sempre "contaminata" da proteine perciò non si può dire per certo che il cambiamento sia dato dal DNA).

Esperimento di Hersy e Chase (1953)

La conferma venne data successivamente da Hersy e Chase (1953) che decisero di lavorare con i virus anziché con topi e batteri. Il modello del virus da loro usato è quello del fago ovvero un virus che per completare il suo ciclo vitale deve necessariamente infettare una cellula ospite. Il fago utilizzato nell’esperimento è il fago T2 che è in grado di svolgere il ciclo litico.

Il ciclo litico è un ciclo che inizia con il virus che si lega sulla superficie di una cellula batterica e inietta il proprio materiale genetico all’interno della cellula stessa. Successivamente il materiale genetico viene replicato e viene utilizzato per produrre proteine fagiche che verranno assemblate per dare la progenie fagica.

L’esperimento viene svolto in questo modo:

1. Alcuni fagi T2 vengono fatti crescere in un terreno arricchito con zolfo radioattivo in modo da marcare radioattivamente il capside;
2. Altri fagi T2 vengono fatti crescere in un terreno arricchito con fosforo radioattivo in modo da marcare radioattivamente il DNA;
3. Le due popolazioni virali così ottenute vengono aggiunte a due popolazioni batteriche distinte.

Nel primo caso la radioattività non passa alla progenie in quanto le proteine del capside non vengono trasmesse, nel secondo caso la radioattività passa alla progenie in quanto il DNA viene trasmesso. Si usa la radioattività perché ci permette di rilevare i segnali con precisione e facilità. Con questo esperimento possiamo affermare che il principio trasformante è il DNA.

L'organizzazione del DNA

DNA: molecola nuda

Cromatina: DNA + proteine

Il DNA viene compattato all’interno della cellula per motivi di spazio. La compattazione avviene grazie all’intervento di alcune proteine. Le prime proteine che intervengono sono gli istoni, queste proteine vengono identificate dalla lettera H seguita da un numero (H1, H2A, H2B, H3 e H4). Gli istoni hanno in comune il fatto di essere proteine basiche ovvero proteine che hanno una carica positiva (data dal maggior numero di amminoacidi basici quali arginina e lisina). È necessario che queste proteine siano basiche in quanto devono reagire con il DNA che è una molecola acida.

Tutti gli istoni hanno una struttura globulare che permette di formare dei complessi attorno a cui il DNA si lega. Dei 5 tipi di istoni solo 4 iniziano subito a interagire con il DNA (H2A, H2B, H3 e H4) formando un ottamero (ottamero istonico) in cui sono presenti due molecole per ogni tipo di istone coinvolto. Il DNA si avvolge all’ottamero istonico con 1 giro e ¾ formando una struttura detta nucleosoma. Quindi avremo tratti nucleosomici e tratti di DNA nudo, quest’ultimo viene chiamato DNA-linker.

Gli istoni non sono completamente circolari poiché possiedono delle code proteiche che fuoriescono dalla struttura. Queste code vengono chiamate ammino o carbossi-terminali e sono in grado di subire delle modifiche di tipo chimico (ad esempio può essere aggiunto un gruppo metilico che possiede una carica positiva che aiuta le proteine istoniche a neutralizzare ancora meglio le cariche negative del DNA al fine di migliorare la compattazione del DNA).

Una modifica chimica importante è l’acetilazione degli istoni, per acetilazione si intende l’aggiunta di gruppi acetilici (CH₃COO) in modo covalente con lo scopo di neutralizzare le cariche positive degli amminoacidi basici. Così facendo si eliminano le interazioni tra DNA e istoni e diminuisce la compattazione del DNA, in questo modo viene agevolata la trascrizione del DNA.

Al contrario, se noi prendiamo un istone acetilato e rimuoviamo il gruppo acetilico andremo a provocare la condensazione del tratto di DNA coinvolto. I processi di acetilazione e deacetilazione non sono processi spontanei ma sono regolati da enzimi. L’enzima che aggiunge i gruppi acetilici è chiamato acetil-transferasi istonica (HAT) mentre l’enzima che rimuove il gruppo acetilico prende il nome di deacetilasi (HDAC). Quando acetiliamo attiviamo un gene, quando deacetiliamo disattiviamo un gene. Quando metiliamo silenziamo un gene.

Una volta che il DNA si è avvolto attorno all’ottamero istonico entrano in gioco gli istoni H1 che si legano con il DNA linker. In questo modo si verifica la neutralizzazione del DNA linker. Grazie a questa neutralizzazione il DNA può avvolgersi senza alcuna repulsione formando una sorta di spirale schiacciata con i nucleosomi rivolti verso l’esterno. Ora la fibra di cromatina (cambia nome in questa conformazione) è larga 30 nm (prima il DNA legato ai quattro istoni era largo 11 nm).

Adesso il DNA non ha più una carica negativa e può essere compattato da proteine non basiche dette proteine non-istoniche (o proteine della matrice), queste proteine legano alcuni tratti del filamento alla matrice, in questo modo si formano delle anse (i tratti legati vengono chiamati regioni MAR) o domini ad ansa. Il ripiegamento del DNA non è casuale poiché facilita l’espressione di alcuni geni piuttosto che altri. Si forma così la fibra di 300 nm.

Cromosoma

Rappresenta la forma massima di impacchettamento della cromatina. In questa forma il genoma è inattivo. Per passare dalla fibra di 300 nm al cromosoma è necessaria un’impalcatura proteica data da proteine chiamate proteine dello scaffold (lo scaffold è letteralmente lo scheletro di un cromosoma ed è dato da proteine acide) sulle quali il DNA si avvolge. In pratica le fibre ad anse vengono utilizzate per avvolgere lo scheletro del cromosoma (le anse sono rivolte verso l’esterno).

I cromosomi si formano perché le cellule hanno la necessità di segregare in modo corretto il DNA nelle cellule figlie. I cromosomi metafasici sono costituiti da due strutture identiche dette cromatidi (ogni cromatidio è formato da due bracci divisi da una regione detta centromero). Il centromero unisce i due cromatidi ed è formato da cromatina estremamente condensata che prende il nome di eterocromatina cioè “altra cromatina” (il resto del cromosoma è formato da eucromatina cioè cromatina poco o non condensata).

Nella maggior parte dei casi il centromero non si trova precisamente a metà del cromosoma, perciò si identificano delle braccia corte (sopra al centromero) e delle braccia lunghe (sotto al centromero). I centromeri vengono anche chiamati costrizione primaria perché qui i cromatidi sono più condensati. Il centromero serve:

• A tenere uniti i cromatidi;
• Come punto di aggancio (la parte specifica si chiama cinetocore) al fuso mitotico (struttura che permette il movimento dei cromosomi per trascinamento).

Se un cromosoma dovesse avere un centromero non funzionante non potrebbe prendere contatti con il fuso mitotico e non potrebbe essere diviso e spostato durante la mitosi. Le estremità dei cromosomi vengono chiamate telomeri dal greco telos “fine” e meros “parte”. Queste regioni sono molto importanti poiché se una cellula rileva che un cromosoma non ha più i telomeri smette di replicarsi e prova a riparare i telomeri, se ci riesce continua a replicarsi se invece non riesce va incontro all’apoptosi (morte cellulare programmata).

DNA nel nucleo

Nucleo: struttura ordinata presente in tutte le cellule (tranne i globuli rossi) delimitata da una membrana nucleare. Questa membrana è data da un doppio strato fosfolipidico e va a delimitare e definire il nucleo rispetto al citoplasma. All’interno di questa struttura si trova il genoma cellulare. Sulla membrana sono presenti dei pori detti pori nucleari che rappresentano il punto di scambio di molecole tra nucleo e citoplasma.

Il DNA si trova legato alla matrice nucleare nel nucleo. La matrice dà forma al nucleo essendo formata da un reticolo di fibre. Il DNA che deriva da ogni cromosoma va ad occupare uno spazio preciso nel nucleo chiamato territorio di competenza (in tutte le cellule di quell’organismo gli stessi territori sono occupati dallo stesso tratto di DNA). Importante notare che i cromosomi ereditati dai due genitori occupino due territori di competenza differenti.

All’interno di ogni territorio di competenza troviamo delle regioni in cui la cromatina ha dei livelli di compattazione diversi, in questo modo si formano zone più dense e colorate composte da eterocromatina costitutiva (è presente in tutte le cellule di tutti gli organismi) e zone meno dense e poco colorate composte da eucromatina (presenta tratti di DNA a diversi livelli di condensazione).

In ogni cellula cambiano le zone eterocromatiche e eucromatiche in base ai geni che servono allo specifico tipo cellulare. Quindi la posizione di un tratto di DNA nel nucleo varia l’espressione dei geni contenuti in quel tratto di DNA (effetto di posizione).

Cromosoma batterico

Lo studio del DNA batterico ci può aiutare a comprendere come essi funzionano e come possono essere neutralizzati. All’interno di una cellula batterica vi sono due diverse strutture date da DNA ovvero:

• Cromosoma batterico: costituito da una doppia elica di DNA che si dispone in maniera circolare e che ospita i geni fondamentali per le funzioni cellulari e metaboliche;
• Plasmidi: forma di materiale genetico che porta informazioni accessorie. Sono filamenti bicatenari di DNA circolarizzati di dimensioni minori rispetto al cromosoma. I geni accessori sono geni ugualmente importanti rispetto a quelli contenuti nel cromosoma ma non sono alla base del funzionamento ordinario del batterio. Per esempio i plasmidi portano i geni per la resistenza agli antibiotici, aspetto fondamentale solo quando i batteri si trovano minacciati da quell’antibiotico e non in condizioni normali.

Se il genoma batterico fosse linearizzato esso sarebbe circa 1.000 volte più lungo della cellula batterica e quindi deve essere compattato mediante superavvolgimento. Il DNA batterico può subire due tipologie di avvolgimento:

• Positivo (viene girato nello stesso senso in cui è spiralizzato il DNA, cioè verso destra): non avviene compattazione;
• Negativo (viene girato verso sinistra, opposto al senso dell’elica): avviene la compattazione.

Il processo di superavvolgimento è mediato da enzimi il cui nome è topoisomerasi. La topoisomerasi I decondensa il DNA mentre la topoisomerasi II condensa il DNA. Oltre ai superavvolgimenti si formano delle strutture ad anse. Le anse sono stabilizzate da proteine basiche chiamate H e HU.

I plasmidi sono più piccoli e portano meno geni dei cromosomi ma anche loro subiscono dei superavvolgimenti. I plasmidi sono molecole di origine citoplasmatica e sono capaci di autoreplicarsi. Si possono trasmettere alle altre cellule tramite coniugazione, tramite fagi trasducenti o attraverso la trasformazione. I plasmidi sono mezzi utilissimi nelle tecniche del DNA ricombinante perché permettono di amplificare un segmento di DNA anche un milione di volte tramite un processo chiamato clonazione del DNA.

I plasmidi possono essere divisi per funzione:

• Plasmide F (fertilità): permette ai batteri di costruire un ponte citoplasmatico detto “pilo” che consente a una cellula batterica di prendere contatto con un’altra cellula batterica. Per convenzione si chiama F⁺ la cellula che ha il plasmide F e che forma il pilo e si chiama F^- la cellula che riceve il materiale. Questo processo di scambio si chiama coniugazione. Durante la coniugazione le cellule si possono scambiare il plasmide F o porzioni del proprio genoma;
• Plasmide R (resistenza): porta i geni che permettono ai batteri di resistere a uno o più antibiotici;
• Plasmidi di virulenza: plasmidi che permettono al batterio di produrre tossine.

Dagli anni '70 siamo stati in grado di aggiungere materiale genetico ai plasmidi. Sono serviti due strumenti importanti quali gli enzimi di restrizione (o endonucleasi) cioè enzimi in grado di tagliare il DNA in specifiche sequenze bersaglio (oggi note). Per legare i nuovi tratti di DNA al DNA del plasmide bisogna utilizzare degli enzimi chiamati ligasi (enzimi in grado di catalizzare la formazione di un legame 3’-5’ fosfodiesterico). Una volta che le cellule batteriche internalizzano il nuovo frammento di DNA iniziano subito a produrre le proteine codificate da quel frammento.