Genetica: corso di genetica

Genetica

La cellula

Unità principale della vita, ogni essere vivente è formato da una o più cellule. Il nome deriva dallo scopritore Hook che per la prima volta vide con il microscopio ottico tali unità in sezione di sughero. Diede questo nome poiché tali strutture somigliano a celle.

Esseri viventi

• Procarioti (DNA libero nel citoplasma)
  • Batteri
  • Archei
• Eucarioti
  • Animali
  • Piante
  • Funghi
  • Protisti
  • Cromisti

Caratteristiche principali

Metabolismo: insieme di reazioni chimiche attraverso le quali si ha una trasformazione di una sostanza (substrato) in un'altra. Tali reazioni, che avvengono all'interno di una cellula, sono catalizzate da enzimi (molecole generalmente proteiche che si attaccano a un substrato e favoriscono/accelerano la trasformazione in un determinato prodotto).

• Anabolismo: sintesi delle molecole necessarie sfruttando energia;
• Catabolismo: demolizione delle molecole per la produzione di energia che poi verrà usata per l'anabolismo.

Presenza di un'informazione genetica (DNA-RNA): presenza di molecole di carattere informazionale che regolano il metabolismo della cellula;

Riproduzione: processo attraverso il quale si ha la generazione di individui simili o uguali all'organismo progenitore;

Evoluzione biologica: gli organismi viventi sono tali perché possiedono queste caratteristiche a differenza del non vivente che ne può possedere solo alcune.

Cellula eucariote

Si deve immaginare una struttura dinamica in cui i vari componenti non sono fissi ma, svolgendo le proprie funzioni, hanno un determinato moto.

Animale

• Membrana plasmatica o cellulare: è l'involucro esterno della cellula che delimita l'ambiente esterno da quello interno e le fornisce una forma. È l'interfaccia con l'ambiente esterno e dalla quale si ha lo scambio di informazioni tra i due ambienti. È formata da un doppio strato fosfolipidico nel quale tali lipidi si posizionano avente la parte idrofoba all'interno e quella idrofilica all'esterno. Tale struttura si rinnova continuamente poiché ogni fosfolipide ha una sua emivita e quando comincia a denaturare e quindi a perdere la propria funzione verrà sostituito. La membrana non è costituita solo da fosfolipidi ma anche da proteine intermembrana e oligosaccaridi che si ancorano su di essa donandole una forma discontinua.
• Citoplasma: è il contenuto interno della cellula, costituito dal citosol che è la matrice liquida con carattere viscoso/gelatinoso e i vari organuli che si trovano al suo interno. All'interno della cellula le varie molecole si trovano ammassate nel citoplasma che con la sua componente viscosa ne limita il movimento e la diffusione. Tali molecole andranno quindi a collidere con le altre e alcune di queste collisioni possono portare alla formazione di nuovi legami (questo avviene solo se determinate molecole si "riconoscono" attraverso la loro forma e interagendo possono incastrarsi. Maggiore è il grado di riconoscimento maggiore sarà il legame che si instaurerà).
• Organelli: sono tutte quelle strutture in cui avvengono determinate funzioni (Golgi, RER, centrioli, mitocondri che hanno un DNA proprio).
• Nucleo: determinato da una membrana nucleare che è in continuità con il RE, su tale membrana sono presenti i pori nucleari che permettono un passaggio delle molecole in entrambe le direzioni. All'interno è presente il DNA che si trova in una struttura che è la cromatina (eucromatina ed eterocromatina). Il DNA è composto da due filamenti che si avvolgono uno sull'altro e sono composti da una ripetizione di unità dette nucleotidi.

Nucleotidi

• 1 zucchero (desossiribosio);
• Base azotata;
• Gruppo fosfato derivante dall'acido ortofosforico;

DNA: Acido Desossiribonucleico

Presenza del desossiribosio e scoperto nel nucleo di un eucariote.

Vegetale

Presenta strutture simili alla cellula animale ma ha degli organuli in più:

• Vacuolo: funzioni di riserva d'acqua e deposito di sostanze di riserva.
• Parete cellulare: si posiziona sopra la membrana plasmatica e rappresenta l'interfaccia con l'esterno. Rappresenta una barriera e filtra le sostanze che devono entrare nella cellula, dà resistenza meccanica e capacità di mantenere una certa forma.
• Cloroplasti: plastidi/strutture dove avviene la fotosintesi clorofilliana ossigenica cioè la sintesi di sostanze attraverso l'uso di fotoni (luce) che come scarto produce ossigeno.

6CO₂ + 6H₂O → C₆H₁₂O₆ + 6O₂

I primi organismi poiché vivevano in un ambiente anaerobico, svolgevano una fotosintesi non ossigenica. Solo con la comparsa dei cianobatteri si ha una produzione di ossigeno che incrementando diventa tossico per gli altri organismi anaerobici. La presenza di questo conflitto ha portato a due diverse strade:

• Morte degli organismi;
• Evoluzione / adattamento;
• Spostarsi in una nicchia ecologica dove non vi è O₂ e quindi mantenere le proprie caratteristiche anaerobiche;
• Modificarsi utilizzando l'O₂ prima tossico per il processo di respirazione cellulare e quindi per produrre energia con il proprio metabolismo.

La riproduzione cellulare è quel processo attraverso il quale si dà origine a nuovi individui identici alla cellula progenitrice. Quindi da un'unica cellula si ha la formazione di due cellule figlie con lo stesso patrimonio genetico (negli eucarioti è la mitosi). Questo processo va a mantenere l'identità biologica della cellula ma va a contrastare l'evoluzione del sistema poiché sono presenti individui tutti uguali. Si ha quindi un conflitto con l'evoluzione cioè con il concetto di variabilità genetica (negli eucarioti con riproduzione sessuale è la meiosi).

Mitosi & Meiosi

Mitosi: si ottengono 2 cellule con lo stesso patrimonio genetico. Affinché da una cellula se ne origino 2 identiche l'informazione genetica deve essere duplicata prima della divisione. Noi abbiamo 46 lunghe molecole di DNA, ognuna di esse ad un certo punto inizia a duplicarsi all'unisono, grazie a un segnale. La doppia elica si deve aprire e verrà ricreata la parte mancante della divisione. Il tutto poi si raggomitola a formare i cromosomi → la molecola figlia di DNA (quella riformata) sta attaccata a quella madre dando cromatidi perfettamente identici.

Affinché le 2 cellule figlie abbiano la stessa informazione genetica i cromatidi si devono dividere a livello del centromero, così che uno vada a una cellula e uno all'altra. Ai poli i centrioli iniziano a sintetizzare delle fibre contrattili che dividono i cromatidi, che devono stare sullo stesso piano. Le fibre poi si contraggono, sia a un polo che all'altro, simultaneamente tramite un impulso, quindi ai poli della cellula arriva la stessa informazione genetica. I cromosomi vengono poi racchiusi nell'involucro nucleare.

Meiosi: 4 cellule aploidi con patrimonio genetico diverso. Si è originata dalla mitosi, ma è più complessa e avviene negli organi riproduttori. Viene dimezzata l'informazione genetica (da 2n a n) e si hanno 4 cellule ognuna delle quali con 23 cromosomi. È un meccanismo che permette di aumentare la variabilità genetica, dato che si hanno due tipi di ricombinazione:

• Intercromosomica: tra cromosomi, intuita da Mendel (crossing-over);
• Intracromosomica: legata a elementi di scambio fisico di pezzi di DNA;

Vanno in meiosi le cellule diploidi (2n) cioè le cellule con coppie di cromosomi omologhi (non identiche) che portano l'informazione genetica e svolgono la stessa funzione. Da una cellula diploide se ne hanno 4 aploidi, quindi le cellule devono prima duplicarsi.

Il primo passaggio è identico alla mitosi, dato che c'è la duplicazione. I cromosomi omologhi (1 maschile e 1 femminile) si mettono uno accanto all'altro per formare delle coppie. Quindi il fuso mitotico si lega ai cromosomi di una sola parte e questi ultimi dopo la contrazione si spostano a coppie. Prima che le fibre del fuso si contraggano però avviene uno scambio di materiale genetico. Quando il cromosoma si rompe, la molecola di DNA si rompe in più punti e così il cromosoma omologo si rompe negli stessi punti. Questo è possibile grazie alla proteina RecA, che si mette a "ponte" tra i cromatidi, tagliando il DNA in un punto di un cromosoma e nello stesso punto nell'altro, ricucendo poi il tutto.

Quando avviene la rottura e la riunione di questi frammenti possono generarsi degli errori (mutazioni) che possono rivelarsi dannose per la cellula. Serve quindi qualcosa che le renda innocue. Quella del crossing-over è una tappa necessaria, ma non sempre è detto che dia origine a ricombinazione (se si scambiano cromatidi uguali per esempio non si ha ricombinazione).

RecA: prima proteina scoperta coinvolta nel crossing over (ce ne sono molte altre).

Genoma: insieme di tutta l'informazione genetica di un determinato organismo o cellula (da non confondere con il codice genetico che invece è universale). Nel caso di batteri, archei e eucarioti il genoma è costituito da molecole di DNA. Nel caso dei virus l'informazione genetica può essere contenuta o in molecole di DNA o di RNA.

La struttura del DNA è stata scoperta nel 1953. Nei decenni precedenti sono stati fatti una serie di esperimenti che suggerivano che l'informazione genetica fosse contenuta nel DNA. Si sapeva però che il DNA era costituito da elementi di base:

• Desossiribosio (zucchero a 5 atomi di carbonio);
• Un gruppo fosfato (acido ortofosforico);
• 1 base azotata tra Adenina, Timina, Citosina e Guanina;

Si sapeva anche che le proteine erano costituite da 20 tipi di amminoacidi (gruppo amminico + gruppo carbossilico): si pensava quindi che fossero le proteine a contenere l'informazione genetica.

Esperimento di trasformazione di Griffith (1928)

Batteri virulenti (S) e non virulenti (R) di Streptococcus. Quello virulento produce una capsula polisaccaridica responsabile della virulenza. Griffith prende dei batteri del tipo S, li inietta in un topo e vede che questo muore e sezionandolo ritrova i batteri capsulati. Iniettando i batteri del tipo R il topo sopravvive e sezionandolo non ritrova i batteri (l'organismo li aveva uccisi). A questo punto Griffith prende i batteri di tipo S e li scalda, uccidendoli. Poi li inietta nel topo: vede che questo sopravvive e non li ritrova nell'organismo. Fa un ultimo esperimento: mette insieme in una stessa provetta batteri non virulenti e batteri virulenti uccisi con il calore e li inietta nel topo. Si aspetta che il topo sopravviva: invece il topo muore e sezionandolo ritrova dei batteri virulenti capsulati. Dai batteri virulenti morti è passato un principio trasformante a quelli non virulenti capace di trasformarli in batteri virulenti (processo di trasformazione).

Esperimento di Avery, MacLeod e McCarty (1942)

In una cellula ci sono quattro tipi di macromolecole:

• Lipidi
• Zuccheri
• Proteine
• Acidi nucleici

Ognuna di queste 4 macromolecole poteva essere il principio trasformante di Griffith.

6 provette: in ognuna di queste provette ci mettono la stessa quantità di un estratto cellulare dei batteri di tipo S. Ad ognuna queste provette (tranne 2) viene aggiunta una miscela di uno stesso enzima: nella prima delle nucleasi, nella seconda proteasi, nella terza lipasi e nella quarta enzimi che distruggono gli zuccheri. Nella quinta provetta vengono aggiunti tutti questi enzimi e nella sesta nessuno di questi. A questo punto in ognuna di queste provette viene aggiunta la stessa quantità di batteri R. Dopo aver incubato (mantenuto) i batteri non virulenti in presenza di questi estratti cellulari prendono ognuna di queste miscele e le iniettano in 6 topi differenti. Si aspettano, dai risultati di Griffith, che il topo nel quale è stato iniettato il contenuto della provetta 6 muoia e che quello nel quale è stata iniettata la miscela con anche tutti gli enzimi sopravviva. Il topo con il contenuto della provetta 2 muore, quindi le proteine non sono la molecola trasformazionale. Idem i topi nei quali erano state iniettate le miscele delle provette 3 e 4. Il topo con il contenuto della provetta 1 invece sopravvive: questo significa quindi che il DNA (o l'RNA) è la molecola informazionale. Per decidere se fosse l'RNA o il DNA prepararono altre due provette, ognuna con l'enzima che distrugge o il DNA (DNAasi) o l'RNA (RNAasi). Quella con la RNAasi fa morire il topo mentre quella con la DNAasi invece lo fa sopravvivere.

Questo però non dimostra che il DNA è la molecola informazionale. Questo perché la proteasi che avevano usato (tripsina) formava dei frammenti proteici più o meno lunghi. Non si può quindi escludere a priori che questi frammenti possano mantenere un'attività biologica (possano ancora trasformare le cellule).

1952 - Esperimento di Hershey e Chase

Si ha la conferma sperimentale che il DNA è la molecola che contiene l'informazione genetica.

Utilizzano i batteriofagi T2 (virus che mangiano i batteri).

Schema di un Batteriofago T2

• Capside: di natura proteica dovuta all'assemblaggio di subunità identiche di una proteina. All'interno c'è il materiale genetico (DNA/RNA a singola o doppia elica).
• Guaina: è contrattile.

Si calcola che esistono 10 virus per ogni cellula sulla Terra. I virus cercano il proprio ospite. Non sono organismi viventi, non si riproducono ma si moltiplicano. Per potersi moltiplicare devono sfruttare i sistemi metabolici di una cellula (vegetale, animale, batterio, archeo) ospite. Lo scopo di un virus è di moltiplicarsi. Se non trova il batterio giusto continua a vagare nello spazio. Per farlo il virus deve entrare in contatto con la cellula (attaccarsi). Deve esserci un incastro perfetto con delle molecole con struttura complementare (la loro struttura tridimensionale delle fibre del virus si adatta perfettamente a specifiche proteine sulla superficie del batterio recettore). I legami che si formano sono deboli, ma se ne formano così tanti che il contatto è stabile.

Paradosso: dopo essersi moltiplicato nella cellula il virus la fa scoppiare: perché la cellula ospite ha dei recettori per qualcosa che può portarla alla morte? Il virus interagisce con cellule/batteri che si sono evoluti per poterlo accogliere, ossia che possiedono dei recettori sulla superficie della membrana. Il virus dopo essersi ancorato a tali recettori inietta il proprio materiale genetico all'interno della cellula per farlo duplicare (questo infatti non possiede gli enzimi necessari). Quindi fa sintetizzare le proteine che formeranno la capside, la guaina e le fibre. Nel frattempo il DNA batterico sta degenerando ossia si sta frammentando: può capitare quindi che all'interno della capside venga inserito un tratto di DNA batterico anziché virale. Dopo che si sono formati i cosiddetti virioni (generazione di cellule virali uguale a quella da cui si sono originati), dal DNA virale vengono sintetizzati gli enzimi litici che distruggono l'involucro cellulare e causano quindi la fuoriuscita dei virioni e dei virus contenenti DNA batterico (se si sono formati).

Ciclo litico: per permettere un'espressione ordinata dell'informazione genetica (prima la formazione dei virioni poi quella degli enzimi litici) devono esserci dei segnali e dei meccanismi che rendono possibile il fluire dell'espressione sia dal punto di vista temporale che spaziale. Affinché si possa svolgere un ciclo litico prima c'è bisogno di energia. Se la cellula ospite non ha energia per fare una sintesi proteica attiva il virus non può andare incontro a un ciclo litico. Il DNA virale quindi o viene distrutto oppure "si nasconde" in quello della cellula batterica (attraverso il crossing-over). In questo modo la cellula batterica quando dovrà duplicare il proprio DNA dovrà duplicare anche quello virale. Non si ha una lisi immediata della cellula batterica infetta.

Ciclo lisogeno: il virus può scegliere se andare incontro a un ciclo litico o a uno lisogeno a seconda dei segnali che riceve a livello della cellula. Alcuni virus possono scegliere tra un ciclo litico e uno lisogeno (es: batteriofago λ), altri, come il batteriofago T2, entrano solo nella via litica.

Esperimento di Hershey e Chase: presupposto: il DNA è costituito da C, H, N, O e P. Quest'ultimo elemento non è presente nelle proteine. Le proteine a loro volta sono costituite da C, H, N e S che invece non è presente nel DNA. Si era a conoscenza di due isotopi radioattivi: l'³⁵S e il ³²P.

Hershey e Chase presero due beute e ci versarono un terreno di coltura (liquido) che conteneva le sostanze nutritive per la crescita dei batteri. Inoltre aggiunsero la stessa quantità di cellule di Escherichia coli (sensibili al fago T2).

• Nella prima beuta aggiunsero l'isotopo ³⁵S e nella seconda il ³²P. Dopo averle fatte incubare (mantenere a 37° in agitazione per fare entrare l'ossigeno nel liquido) gli isotopi avrebbero potuto marcare le molecole specifiche (l'³⁵S nelle proteine e il ³²P nel DNA).

A questo punto aggiunsero la stessa quantità di batteriofagi T2 in entrambe le beute. La progenie originata risulterà quindi marcata (a livello delle proteine nella prima beuta e del DNA nella seconda) dall'isotopo contenuto nella coltura.