Funzioni e dinamica delle proteine intracellulari

Funzione e dinamica delle proteine intracellulari

L’insegnamento ripercorre il tragitto che le proteine compiono nella cellula dalla

loro sintesi alla loro secrezione e degradazione: “folding”, smistamento e

degradazione. Questo approccio offre la possibilità di trattare moltissimi eventi di

primaria rilevanza nella vita delle cellule e i meccanismi regolativi e adattativi che

esse attuano. Verrano considerati esiti patologici derivanti da malfunzionamenti di

questi fenomeni cellulari.

Il ciclo vitale delle proteine prevede:

• sintesi proteica a livello dei ribosomi —> folding (questo può causare malattie da

misfolding proteico come neurodegenerative) —> questo poi subiscono sorting,

quindi il loro destino viene determinato in modo tale che raggiungano il luogo in

cui possono svolgere la loro funzione

• degradazione delle proteine, importante che venga regolata la presenza di certe

proteine nella cellula es. proteine che controllano il ciclo cellulare, presenti

soltanto in certi momenti del ciclo cellulare in cui svolgono la loro funzione.

Questo meccanismo è ubiquitina dipendente

• l’autofagia è invece un secondo meccanismo di degradazione diverso dal

precedente che avviene a livello dei lisosomi negli eucarioti, ed ha un ruolo

importantissimo. Si tratta di un meccanismo fondamentale per mantenere la salute

della cellula.

Nel 99 viene dato un nobel a Blobel per la scoperta a livello delle proteine di

specifiche sequenze che definiscono il trasporto e la localizzazione delle proteine,

si parla di sorting, argomento che viene ulteriormente approfondito nel 2013 con

un nobel dato per la scoperta del meccanismo di regolazione del traffico

vescicolare, sistema di trasporto all’interno delle cellule che coinvolge le proteine.

Altri due premi Nobel riguardano la degradazione proteica, ottenuti da 3

ricercatori che scoprono nel 2004 il meccanismo dell’ubiquitina, che ha permesso

di comprendere un meccanismo conservato che regola in modo preciso la

degradazione delle proteine. Nel 2016, Ohsumi prende il nobel per la scoperta del

meccanismo dell’autofagia, perchè nel 1992 lui scopre che cellule di lievito in

carenza di ammonio avevano dei vacuoli (equivalenti dei lisosomi) molto grandi.

Prendendo alcuni mutanti della via dell’autofagia li mette in carenza di ammonio e

vede che questi muoiono, scoprendo che è importante questo meccanismo per la

vitalità delle cellule.

Prende il nobel solo nel 2016, in quanto nel frattempo si era scoperto che la

cellula degrada in maniera specifica proteine e componenti cellulari per

rispondere a delle situazioni di stress. Nel caso di Oshumi si trattava di uno

stress nutrizionale, mancanza di ammonio, poi si scopre che l’autofagia può

essere messa in atto dalla cellula in caso di proteine non correttamente foldate

che possono essere tossiche causare danni, o mitofagia degradando mitocondri

non funzionali. Si è quindi scoperto come questo processo è coinvolto nella

crescita tumorale e nella neurodegenerazione.

Il ripiegamento delle proteine (protein folding) nell’ambiente intracellulare

Nell’ambiente intracellulare, le proteine acquisiscono la loro conformazione

nativa in tempi normalmente brevi dopo la loro sintesi (o spesso anche durante).

La conformazione nativa è quella conformazione della proteina globulare,

compatta, che consente alla proteina di sostenere la sua funzione biologica

caratteristica di ciascuna proteina.

Nel 1957, Anfisen fa un esperimento, che porta a determinare che ogni proteina

contiene nella sua sequenza tutta l’informazione necessaria per assumere

spontaneamente la conformazione nativa. Prende in considerazione la

Ribonucleasi A composta da una singola catena polipeptidica di 124 aa e 4 ponti

disolfuro. Lo scopo dell’esperimento è quello di far perdere la struttura nativa

alla proteina e verificare se questa veniva successivamente ripristinata. La

proteina viene denaturata con urea e cloruro di guanidinio per rompere i legami

non covalenti e poi ridotta con 2- mercaptoetanolo per rompere i ponti

disolfuro. Se per dialisi venivano lentamente rimossi gli agenti denaturanti e

riducenti, la proteina riassumeva la sua funzionalità enzimatica. Tutte le sue

proprietà chimico–fisiche erano uguali a quelle dell’enzima nativo. La proteina

era in grado di ricostruire, fra i vari modi di accoppiare le sue 8 cisteine in 4

ponti disolfuro, l’unica combinazione corretta che la rendeva funzionale. Se

avvenisse casualmente, probabilità estremamente bassa (0,95%).

• La probabilità che uno degli 8 residui di cisteina formi casualmente un ponte

disolfuro con il corretto partner fra le 7 cisteine rimaste è 1/7.

• Uno dei sei residui di cisteina rimasti ha probabilità 1/5 di formare

casualmente un ponte disolfuro corretto e così via.

• La probabilità complessiva che la RNasi formi correttamente i suoi 4 ponti

disolfuro in modo assolutamente casuale è 1/105 (1/7 1/5 1/3 1/1)

× × ×

Questo dimostra il principio generale che le proteine possono ripiegarsi

spontaneamente nelle loro conformazioni native in condizioni fisiologiche

utilizzando solamente l’informazione codificata dalla loro struttura primaria.

Il normale ripiegamento può non aver luogo, sia in vivo sia in vitro, per due

ragioni:

1) trappole cinetiche: formazione di interazioni non-native intramolecolari

(diverse da quelle che sono caratteristiche della forma nativa), dotate di una

certa stabilità e capaci di prevenire il progresso del ripiegamento della proteina

verso la forma nativa. Si tratta tipicamente di interazioni idrofobiche.

2) aggregazione di proteine: nell’ambiente intracellulare, sovraffollato da

molecole e in particolare da proteine (concentrazione stimata: 300-400 g/L), la

probabilità di incontro e di associazione di molecole proteiche tra di loro

(attraverso interazioni idrofobiche) è elevatissima e porta alla formazione di

aggregati generalmente stabili.

Affinchè questo non succeda intervengono gli chaperoni molecolari, che

sfavoriscono l’aggregazione tra proteine e il ripiegamento scorretto dovuto a

trappole cinetiche.

A seguito della sintesi sui ribosomi come sequenze lineari di amminoacidi, la

stragrande maggioranza delle proteine deve piegarsi in strutture

tridimensionali ben definite (i loro stati nativi) per raggiungere la funzionalità.

Una sostanziale parte di proteine è meno efficiente nel raggiungere una

conformazione nativa e facilmente assumono uno scorretto folding, aggravato

anche dall'ambiente cellulare altamente affollato. Per esempio proteine di

grandi dimensioni con strutture complesse possono esporre residui di

amminoacidi idrofobici al solvente durante il ripiegamento, rendendoli

suscettibili a interazioni non native che portano all'aggregazione delle stesse.

Per contrastare queste interazioni non native, le cellule hanno una rete di

chaperoni molecolari che aiutano nel ripiegamento de novo e mantengono le

proteine preesistenti nei loro stati nativi. Garantiscono alle proteine fin dalla

loro nascita, il raggiungimento della conformazione nativa. Un ruolo chiave degli

chaperon molecolari è prevenire l'aggregazione proteica, specialmente in

condizioni di stress cellulare. Gli squilibri nell'omeostasi delle proteine

(proteostasi) sono stati osservati in diverse patologie, sottolineando l'importanza

del controllo della qualità delle proteine cellulari.

La caratteristica predominante di questi stati patologici è il folding errato delle

proteine manifestato dalla formazione di depositi intracellulari e/o extracellulari

di proteine aggregate.

Alcuni esempi includono la formazione di inclusioni intracellulari contenenti α-

sinucleina aggregata nella malattia di Parkinson o l'huntingtina nella malattia di

Huntington, così come le placche β- amiloidi extracellulari nella malattia di

Alzheimer. Queste proteine quando misfoldate causano la formazione di aggregati

e quindi ciò sfocia in patologie neurodegenerative, gli chaperoni possono

prevenire e revertire questi processi quando avvengono.

Gli Chaperoni

Si tratta di proteine che prevengono la formazione di interazioni non-native e di

aggregati e talvolta sono anche in grado di revertire tali fenomeni.

La loro scoperta:

• Laskey, 1978: scopre la nucleoplasmina, che assiste l’assemblaggio di istoni e

DNA a dare i nucleosomi. Per la prima volta viene introdotta la denominazione di

“molecular chaperone”.

• Barraclough & Ellis, 1980: dimostrano l’associazione di un fattore proteico alla

subunità maggiore della ribulosio bisfosfato carbossilasi (RuBisCo) del cloroplasto,

e il ruolo indispensabile di questo fattore per il corretto assemblaggio delle

subunità dell’enzima RuBisCo e il suo raggiungimento della conformazione nativa.

Detto fattore proteico fu successivamente identificato come Hsp60 (si chiamano

Hsp, in quanto se le cellule venivano messe ad alte temperature si vedevano

proteine ad alto peso molecolare chamate Heat Shock protein che si attivavano e

accumulavano in condizioni di stress termico).

• 1986 e anni seguenti: scoperta di GroEL da Escherichia coli. Fa seguito, nei

decenni successivi, l’identificazione di una numerosa popolazione di proteine che

assistono il folding in vivo, che sono le stesse Heat shock proteins che si

accumulano in caso di stress.

Chaperoni molecolari

Chaperone molecolare è una proteina che interagisce con una proteina e ne

facilita il ripiegamento o l'assemblaggio senza essere parte della sua struttura

finale nativa. Gli chaperoni sono presenti in tutti gli organismi, vengono prodotti

in modo costitutivo ma la loro concentrazione aumenta in seguito a stress. Gli

chaperoni sono classificati in diversi gruppi sulla base della loro omologia di

sequenza. Molte sono proteine dello stress o proteine da shock termico (Hsps),

poiché la loro sintesi è indotta in condizioni di stress (ad esempio shock termico o

stress ossidativo), che destabilizzano strutturalmente le proteine cellulari. I

membri dei vari gruppi di chaperoni sono stati inizialmente denominati in base al

loro peso molecolare: Hsp40s, Hsp60s, Hsp70s, Hsp90s, Hsp100s e le small Hsps.

Oltre al loro ruolo fondamentale nel ripiegamento delle proteine «de novo», gli

chaperoni sono coinvolti in vari aspetti del mantenimento del proteoma, come il

refolding di proteine che sono andate incontro a denaturazione, la formazione di

oligomeri, il mantenimento in forma estesa delle proteine che sono sintetizzate

nel citoplasma e devono essere trasportate negli organelli, il recupero di

polipeptidi da aggregati.

Sono proteine monomeriche o più spesso oligomeriche che assistono il folding in

vivo. Proteine evolutivamente conservate. Prevengono off-pathways (vie di

ripiegamento che allontanano dalla forma nativa, proteine misfolded o aggregate)

e in generale accelerano on-pathways (a partire dall’unfolded si raggiunge la

forma nativa corretta, evitando aggregati e recuperano i misfolded). Si tratta di

un meccanismo di controllo qualità della proteina, che fa in modo che se si creino

misfolded questi possono essere recuperati, si giunge sempre alla foma N delle

proteine. NON modificano il punto di arrivo del folding: la conformazione nativa (=

dotata di attività biologica) della proteina presa in carico dagli chaperoni è sempre

la stessa, in presenza e in assenza di chaperoni ed è stabilita dalla struttura

primaria (come dimostrato da Anfinsen). Però in assenza di chaperoni, una proteina

può aggregare e/o rimanere permanenetemente intrappolata in una

conformazione “misfolded” (=scorrettamente ripiegata).

Si dividono in due famiglie:

• Chaperonine: presentano una cavità in cui sono confinate le proteine in via di

ripiegamento, prevenendone così l’aggregazione.

• Chaperoni: che non presentano cavità, ma solo superfici idrofobiche esposte che

si legano a quelle delle proteine in via di ripiegamento.

Folding funnel

Durante il processo di ripiegamento ogni polipeptide passa da una forma più o

meno estesa, dotata di grande libertà conformazionale, a una più compatta. Nella

sua forma denaturata la proteina può adottare moltissime conformazioni diverse

essendo sostanzialmente libera la rotazione intorno ai legami fra l’azoto e il

e il carbonio α (angolo phi, Φ), e fra il carbonio α e il carbonio carbonilico (angolo

psi, Ψ) di ciascun amminoacido.

• Il processo di ripiegamento si basa sul paesaggio energetico (energy landscape)

della proteina, che descrive la dipendenza dell’energia libera di tutte le

coordinate che determinano la conformazione proteica.

• Il numero di stati conformazionali accessibili diminuisce durante il processo man

mano che ci si avvicina alla conformazione nativa, per questo il modello prende la

forma di un imbuto (folding funnel). Il processo di ripiegamento viene immaginato

come un imbuto tridimensionale in cui la proteina esplora varie conformazioni di

energia libera decrescente. Nella parte superiore dell’imbuto, che corrisponde alla

proteina non ripiegata, sono presenti molti stati a elevata energia libera, con alta

entropia conformazionale. Man mano che la proteina si ripiega passa a un numero

minore di stati caratterizzati da minore energia libera (parte più bassa

dell’imbuto). Lo stato più stabile si trova all’estremità inferiore dell’imbuto. Le

pareti lisce indicano che la proteina passa dalla forma

denaturata a quella nativa senza passare per la formazione di

intermedi. Le pareti possono essere frastagliate, indicando la presenza di

minimi locali più o meno profondi. Le conformazioni che si trovano in un minimo

locale possono uscirne oppure rimanere intrappolate ed essere escluse dal

processo di folding (trappole cinetiche). Riguardo bene da appunti biochimica.

Competizione tra ripiegamento intramolecolare e aggregazione intermolecolare

Le pareti dell’imbuto sono frastagliate a indicare la possibilità di intrappolamento

delle forme «misfolded» in minimi locali di energia libera. Le interazioni

intramolecolari (in verde) sono favorite dal punto di vista energetico ma portano a

conformazioni non native (« partially folded state»). Gli chaperoni assistono le

proteine in varie fasi della loro vita cellulare con lo scopo di impedirne

l’aggregazione ed eventualmente di liberarle da conformazioni non produttive

(trappole cinetiche). Gli chaperoni prevengono le interazioni intermolecolari che

portano ad aggregazioni («amorphous aggregates», «b-sheet-rich oligomers»,

and «amyloid fibrils»), promuovendo quindi il folding dello stato nativo della

proteina.

La concentrazione intracellulare delle proteine è elevatissima: 300-400 g/L. Il

processo di aggregazione avviene in seguito all’incontro di due molecole proteiche

(che indichiamo con A), la velocità del processo (v) è data da:

v = k [A]2

Secondo la cinetica chimica, si tratta di un processo del secondo ordine. La

velocità del processo quadruplica se raddoppia la concentrazione dei reagenti,

centuplica se decuplica la concentrazione dei reagenti. È un processo

drasticamente favorito dalla elevata concentrazione dei reagenti, e quindi

dal sovraffollamento di proteine presente nell’ambiente intracellulare.In alcuni

casi l’aggregazione potrebbe avvenire con una cinetica di ordine superiore al

secondo, e quindi essere ancora più stimolata dalla alta concentrazione.

Gli Chaperoni promuovono il folding corretto non solo prevenendo

l’aggregazione, ma anche abolendo le interazioni intra-molecolari scorrette.

Dopo la loro azione, la proteina può ricercare nuovamente (e iterativamente) le

interazioni corrette. Gli chaperoni che intervengono nel processo di folding «de

novo» e nel «refolding» (per esempio chaperonine, Hsp70s e Hsp90s) hanno una

regolazione ATP-dipendente e riconoscono sequenze idrofobiche che

normalmente non sono esposte nella stato nativo della propteina che assistono.

Il legame con queste sequenze idrofobiche permette agli chaperoni di

riconoscere gli stati non nativi o parzialmente foldati delle proteine. Il folding è

quindi promosso da una serie di cicli ATP/chaperone-dipendenti di binding e di

rilascio di proteine non native. La proteina in via di ripiegamento converge

ultimamente verso la conformazione nativa. Questa dinamica va sotto il nome di

kinetic partitioning (ripartizione cinetica).

Kinetic partitioning

In condizioni fisiologiche una proteina non foldata può rapidamente convergere

verso uno stadio intermedio, compatto e parzialmente foldato. Molti chaperoni

passano da uno stato di alta affinità verso uno stato a bassa affinità per le

proteine non foldate e parzialamente foldate in maniera ATP-dipendente (gli

chaperoni associati ad ATP sono molto affini per proteine non correttamente

foldate). L’idrolisi dell’ATP riduce l’affinità dello chaperone per le proteine non

foldate, che lascia la proteina non foldata che grazie al binding con lo

chaperone ha iniziato a foldarsi. Spesso non basta una sola interazione di una

proteina con uno chaperone per essere foldata, ma spesso c’è un ciclo di presa

in carico degli chaperoni. Il folding procede efficientemente quando la costante

di velocità di folding (Kfold) è maggiore delle costanti di binding per lo

chaperone con la proteina (Kon) e di aggregazione (Kagg). L’aggregazione porta

ad uno stato conformazionale aggregato in cui la cellula attiva lo stress

Response Pathway, il quale rappresenta un problema, l’aggregazione che è

tossica deve essere rimossa anche attraverso l’autofagia. Il «binding» e

«rebinding» della proteina non nativa allo chaperone permette la ripartizione

cinetica, prevenendo l’aggregazione e favorendo il folding. Quando Kon è