Fisiopatologia Umana

Fisiopatologia 13/03/17

Patologie legate alla mancata adesione leucocitaria

Ci sono patologie che presentano un difetto nella mancata sintesi delle molecole di adesione → deficienza di adesione dei leucociti.

LAD: Leukocyte Adhesion Deficiency

LAD I → Mancanza della catena di integrine (permettono il passaggio della diapedesi leucocitaria) – non si assembla la molecola di adesione e la cellula non può svolgere la sua funzione. Non migra sull'endotelio, non avviene la diapedesi e se avviene l'extravasazione non si ha più movimento chemiotattico e le cellule non arrivano al sito di lesione. Non svolgono la loro funzione.

LAD II → Alterata espressione delle secretine (il leucocita è riconosciuto dalla cellula endoteliale e ne – permette il legame) manca un'adeguata risposta flogistica. Causa diversa ma problematica uguale.

LAD III → Attivazione, il meccanismo di trasduzione del segnale non viene attivato. – L'integrina può esserci ma non riesce a trasmettere il segnale e le vie sono interrotte. Non basta solo avere l'espressione della proteina, ma anche le vie a valle devono funzionare.

Selectine

Selectine (ieri).

Caderine

Altra famiglia di molecole di adesione. Catena transmembrana, che per funzionare devono integrarsi → legame tra cederine delle due cellule. Ad esempio, legame all'actina. Oppure possono legarsi a "cerniera" con connessione più stretta, legate alle strutture citoscheletriche. Legame al citoscheletro mediante filamenti intermedi → tipiche delle cellule epiteliali.

Classi di caderine

• Classiche – Desmosomiali (desmocolina, demoglina)
• Protocaderine
• Molecole caderino-simili (proteina fat in Drosophila)

Diverse tipologie di caderine a seconda del tipo di cellula che le secerne: Epiteliali, neurali, placentali, vascolare endoteliale, retinale.

L'adesione caderino-mediata è regolata da fattori di crescita, ormoni, segnali dalle gap-junctions, agonisti dei recettori colinergici che inducono la fosforilazione delle caderine. Nel processo tumorale (carcinoma tumori solidi) invade i tessuti → le cellule epiteliali invadono il tessuto arrivando al tessuto connettivo passando la membrana basale. Anziché salire verso la superficie ed andare a costituire lo strato corneo della pelle che viene eliminato e quindi muoiono, sono cellule modificate che riescono a procedere verso il basso ed invadere lo strato connettivo costituito da fasci e collagene molto forte.

Transizione epitelio-mesenchimale

Le cellule cambiano le loro caratteristiche:

• Non esprimono più le molecole di adesione → perdita caderine
• Esprime integrina → facilitato movimento
• Per addentrarsi nel connettivo transizione epitelio-mesenchimale (quindi diventa cellula mesenchimale)
• Degrada la matrice con attività proteolitica → proteasi

In questo modo riesce ad insinuarsi meglio. Le attività proteolitiche della matrice possono avere un ruolo sulla funzione delle cellule perché rilasciano ad esempio fattori di crescita.

Quando si parla di molecole di adesione non si fa solo riferimento all'adesione perché sono coinvolti altri processi tra cui modulazione del segnale (vie di trasduzione). La proliferazione e le caratteristiche delle cellule vengono bloccate e modificate. Queste alterazioni impattano anche sulla risposta immunocompetente.

Le caderine permettono di scambiare segnali con: CD4, CD8, Treg subset, NK. Se non abbiamo espressione delle caderine anche i segnali di attivazione vengono meno e quindi le cellule tumorali possono sfuggire al sistema immunitario, esprimono antigeni tumorali che attivano il sistema immunitario ma se il sistema immunitario fosse efficace eliminerebbe la cellula tumorale ma quando si instaura il tumore, significa che la cellula tumorale riesce a sfuggire al sistema immunitario → con le molecole di adesione può fare questo.

La perdita delle caderine porta alla transizione epitelio-mesenchima e quindi non sono più adese alla membrana basale ma iniziano a muoversi. Modificano componenti citoscheletriche e prendono diversi contatti con la matrice. A seguito di questo processo se riescono ad entrare nel circolo queste cellule tumorali, danno origine a metastasi.

La cellula tumorale interagisce con le cellule endoteliali, e considerato che le cellule endoteliali non sono tutte uguali ed esprimono molecole di adesione differenti. Per questo alcuni tumori preferiscono le molecole di adesione espresse dal polmone, più che pancreas etc. Oppure anche preferenza di organi vascolarizzati. Una volta che aderiscono a queste cellule endoteliali e tra una cellula endoteliale e l'altra passano modificando la loro forma.

Le metallo-proteasi (enzimi litici) possono determinare la liberazione di fattori di crescita che possono sostenere l'angiogenesi, la produzione di nuovi vasi favorisce la crescita delle cellule tumorali.

Trattamenti per limitare la crescita dei tumori

• Bloccare il fenomeno neoangiogenesi → farmaci che inibiscono la crescita di nuovi vasi per ridurre massa tumorale

La condizione di ipossia HIF è un fattore di trascrizione che viene degradato ma se c'è mancanza di ossigeno viene attivato e va ad attivare dei geni/fattori di trascrizione che servono per produzione di nuovi vasi, ad esempio stimolano il VEGF. Per bloccare la neogenesi si va a colpire VEGF e cercare di inibire il legame al recettore. Vengono utilizzati anticorpi monoclonali anti-VEGF. Non funziona sempre perché i tumori non sono tutti uguali, possono essere in grado di adattarsi e sopravvivere in condizioni di ipossia.

Integrine

Integrine: molecole di adesione. Sono dimeri composti da catena alfa e catena beta. Non sono identiche:

• Beta → permette collegamento con strutture citoscheletriche

Insieme sono indispensabili per costituire "tasca" che permette il legame con le molecole della matrice. Nelle selectine e caderine le interazioni sono cellula-cellula. Nelle integrine le interazioni possono essere cellula-cellula ma anche cellula-matrice. A livello di cellula siamo nell'ordine dei 12 nm della tasca. Il legame con molecole della matrice avviene tramite RGD: tre amminoacidi che sono presenti sulla molecola della matrice (ad esempio fibronectina una delle prime molecole studiate) che permettono il riconoscimento delle molecole ad esempio fibronectina. Non interazione specifica perché può legare meglio alcune molecole piuttosto che altre. A seconda delle molecole della matrice con cui vuole interagire perché si ha ambiente extracellulare variabile→ plasticità e adattabilità delle cellule.

Durante l'interazione le due catene si estendono e si modificano permettendo meglio il legame con il ligando e questa conformazione permette di trasdurre segnali al citoscheletro (effettuato dalla catena beta). Le informazioni passano poi dal citoscheletro al nucleo. Sono necessarie molte molecole per la trasduzione del segnale e per questo si tratta di complessi proteici che agiscono in maniera sincrona per attivare o spegnere una serie di geni. La catena alfa serve per la formazione della tasca e quindi la capacità di legame con le molecole della matrice. Possiamo anche avere le due catene ma se non si assemblano in modo corretto la funzione dell'integrina non serve.

Analisi di espressione e funzione delle integrine

Come possiamo capire se c'è un difetto nella espressione o funzione di una integrina in laboratorio?

• Western Blot con anticorpo specifico per catena specifica alfa5 (sequenza specifica della catena alfa 5), questa catena però se può interagire con qualcos'altro non è specifico. Quindi con un WB non mi dice se la proteina funziona ma solo se la proteina è presente. Mi dà informazione che la proteina viene prodotta ma non so se funziona.
• Tecniche di immunofluorescenza per vedere dov'è posizionata la catena dell'integrina, ma è un'informazione sempre solo di una catena ma l'integrina è un dimero. Dobbiamo creare un anticorpo che riesca a riconoscere entrambe → creare un modello in silico e poi far produrre l'anticorpo in vivo. L'anticorpo mi riconosce la sequenza di amminoacidi quando le due catene sono in quella conformazione → determinante conformazionale. Ci permette di vedere se c'è il complesso proteico e possiamo capire se in una dett patologia non si assembla in modo corretto.

Quindi le catene alfa sono indispensabili per il legame con molecole della matrice e sopravvivenza cellulare, espressione di metallo proteasi ed interazione con le catene beta.

La cellula attiva una serie di meccanismi che permettono di controllare l'ambiente extracellulare. Segnali per controllare sintesi di collagene oppure legame metallo-proteasi che vanno a degradare matrice per garantire il turn over. Le catene beta servono per molecole di aggancio con il citoscheletro importante altrimenti se non rimane legata muore. Il complesso va a costituire le FA (Focal Adhesion) con le strutture citoscheletriche.

Componenti di adesione focali

• Transmembrana → integrine e proteoglicani. Interagiscono con molecole della matrice, regolano i tipi di collagene espressi ed i segnali espressi all'interno della matrice stessa. La composizione della matrice è importante per far arrivare dei segnali alla cellula.
• Citoplasmatiche → actina, vinculina, filamina etc → complessi di molecole che devono essere espresse in quantità giusta nel momento e posto giusto.

Le integrine mediano una serie di meccanismi che hanno impatto sul tessuto, organo ed organismo ad esempio crescita, apoptosi, differenziamento. (principali) Ma anche attivazione di chinasi, pathway degli inositoli, organizzazione del citoscheletro.

Espressione integrine

• Livelli di proteina
• Splicing alternativo mRNA
• Mobilizzazione sedi di accumulo → se le integrine che sono presenti all'interno della cellula vengono portate in superficie.
• Controllo conformazionale → per formazione tasca

In laboratorio se voglio fare analisi citofluorimetrica per staccare le cellule devo staccarle meccanicamente perché la tripsina rompe proprio le integrine. Se non voglio utilizzare questa tecnica differente con legame all'anticorpo posso permeabilizzare la membrana per far entrare l'anticorpo e favorire il legame di questo. 19/03/18

Modulatori delle integrine

Le integrine cooperano in maniera sinergica con altre molecole:

• Citochine
• Agenti farmacologici
• Agenti meccanici
• Agenti infettivi

Interagiscono con le stesse vie di trasduzione del segnale delle citochine per contribuire alla sopravvivenza, migrazione e proliferazione cellulare. Le integrine e stress meccanico interessano diversi tipi di cellule del tessuto muscolare, sanguigno, osseo. Lo stress e le attività meccaniche, pur essendo segnali fisici, si traducono in un segnale molecolare con le integrine. A seconda quindi della elasticità/rigidità del tessuto si avrà una diversa capacità di esprimere il segnale.

Integrine, selectine e caderine sono connesse in una rete all'interno della nostra cellula che connette con la lamina nucleare. Tutte le cellule risentono delle caratteristiche del substrato e di ciò che hanno intorno sia che sia fisiologico che sintetico. Le cellule sulla loro superficie presentano strutture tra cui canali e recettori, che permettono di legarsi alle strutture citoscheletriche ed attivare fattori di trascrizione che regolano l'espressione genica.

Le integrine possono mediare l'ingresso di batteri e Mo all'interno della cellula. Il legame con l'integrina modifica il citoscheletro e superficie membrana con formazione di invaginazione che permette l'ingresso nella cellula. Le molecole della matrice che si legano all'integrina servono da ponte e permettono l'ingresso del Mo, altrimenti non entrerebbe.

Integrine in concomitanza con farmaci: ad esempio la Talidomide → inibisce la chemiotassi nei siti di infiammazione, riduce la fagocitosi dei polimorfo nucleati, interagisce con citochine e fattori di crescita e regola il processo di angiogenesi. Questo farmaco agisce e promuove la degradazione di TNF, gli effetti del fattore di crescita sulla cellula comportano una differente espressione di enzimi metallo proteasi (degradare matrice) che vanno a colpire le integrine e queste ultime colpire l'angiogenesi andando a prendere contatti con VEGF. Oppure migrazione dei leucociti attraverso l'endotelio e questo comporta ad una disfunzione endoteliale portando angiogenesi.

Strutture citoscheletriche

Le strutture che possiamo trovare in una cellula sono molto diverse anche a seconda della funzione che svolgono.

• Ciglia
• Microvilli
• Stereociglia
• Anelli contrattili
• Centrioli e microtubuli
• Filamenti sottili
• Filamenti intermedi spessi
• Citoscheletro nucleare
• Flagelli
• Complesso giunzionale
• Sarcomeri

Funzioni cellulari dipendenti dal citoscheletro

• Contrazione muscolare → alterazione del sarcomero porta a patologie muscolari
• Contrazione non muscolare → piccoli movimenti di contrattilità che permettono l'adattamento del cristallino per ottimizzare la visione

Anche coagulazione dovute alle piastrine. Le piastrine si uniscono e si aggregano formando un complesso impermeabile per chiudere la ferita, modificano la struttura della cellula modificandosi e compattandosi con fenomeni di micromobilità per formare il coagulo. Se questo non avviene non si ha successo dell'emostasi.

• Movimenti cellulari polarizzanti → trasporto a livello vescicolare intracellulare.
• Fagocitosi ed endocitosi modificando la membrana, ma anche mitosi per proliferazione cellulare. Se non si forma il fuso mitotico (assemblaggio queste strutture) la cellula non si moltiplica.
• Movimenti delle cilia → Orientamento delle cellule embrionali e l'assenza porta patologie nello sviluppo. Movimento spermatozoi, se non avviene non riescono a raggiungere il sito di destinazione.
• Organogenesi e istogenesi → Adesione e contatti ma soprattutto morte programmata.

Apoptosi nella separazione delle dita delle mani, anche le cavità organiche si formano perché le cellule vanno in apoptosi. Perdita delle connessioni e formazione di blebs. Se si staccano queste aree si ha perché si modificano le strutture citoscheletriche della membrana.

Microtubuli → definiti filamenti spessi. Hanno un diametro 25nm e sono i più grandi. Actina → filamenti sottili 7nm. Filamenti intermedi → 10nm. Tutte queste strutture sono un insieme di subunità che partono da sub singole che poi si aggregano perché presentano un capo di polimerizzazione e depolimerizzazione. Tutte queste strutture sono sempre dei complessi di molecole di proteine (filamento di actina da solo non farebbe nulla, interagisce con altre strutture). Tutto questo garantisce alla cellula di connettersi con la matrice e con altre cellule adiacenti e di trasmettere segnali al nucleo.

Patologie dell'actina e filamenti sottili

• Alterazioni genetiche → mutazioni dove viene meno la funzione del citoscheletro (trombastenia, leucociti pigri)

Le piastrine si aggregano e possono formare trombi. Per garantire processo emostasi devono modificarsi per formare un aggregato, se ci sono difetti a livello del citoscheletro non formano l'aggregato perché non cambiano la loro forma, oppure lo fanno più lentamente. Quindi si hanno emorragie prolungate in presenza di un numero normale di piastrine ma minore adattabilità di queste. I leucociti pigri non fuoriescono in numero adeguato dai tessuti, ma sono un numero corretto nel sangue. Non sono in grado di migrare ed arrivare nel sito di infezione. Si hanno quindi infezioni ricorrenti o che guariscono lentamente.

• Ipertrofia e atrofia cellulare → Adattamenti cellulari perché sono reversibili.

Quando si ha freddo si vasocostringe in periferia in modo da concentrare il calore all'interno dei vasi più grandi. L'esercizio fisico aumenta il volume della cellula ipertrofia e quindi il muscolo diventa più grande, inteso anche come muscolo cardiaco.

• Agenti anti-actina → Falloidina è una molecola che si lega alle strutture citoscheletriche con una specificità elevata, utilizzata al posto di utilizzare anticorpi per legare ed evidenziare il citoscheletro.

Si lega all'estrattore di actina e cristallizza la cellula e rimane immodificata, a questo punto non riesce a dividersi, trasportare molecole all'interno della cellula.

• Autoanticorpi anti-actina → Ab che vanno a determinare miositi, ovvero patologie del tessuto muscolare.

Colestasi si accumulano le sostanze tossiche che non vengono eliminate e ciò provoca la morte del tessuto. Abbiamo patologie che coinvolgono organi che dipendono solo dalle alterazioni della morfologia scheletrica.

CAP: Cyclase Associated Protein

Permette di mettere assieme le strutture di actina e miosina tramite actinina. Interazione per costruire envelope/struttura che si lega strettamente alla lamina nucleare. Quindi le strutture citoscheletriche si connettono con altre proteine accessorie a quella che è la lamina nucleare, coinvolta nell'apertura della cromatina e quindi trascrizione genica. La fosforilazione della cofilina la rende inattiva, la sua defosforilazione permette di averla attiva e regolare quella che è il processo di depolimerizzazione e riassemblaggio delle strutture citoscheletriche. Il diverso comportamento delle cellule può essere legato a un co-fattore delle strutture citoscheletriche in patologia.

Patologie dei filamenti intermedi

Necessario il meccanismo di fosforilazione per avere srotolamento di questi filamenti. La disposizione di questi filamenti deve seguire una geometria particolare, devono disporsi uno parallelo all'altro per permettere l'aggancio di molecole accessorie che stabilizzano. In questo modo vengono costruiti dei filamenti stabili che prendono il nome di fibrille.

• Cheratine → tipiche delle cellule epiteliali
• Vimentina → cellule mesenchimali
• Proteina fibrillare gliale
• Tripletta proteica dei neurofilamenti

Abbiamo una serie di patologie in cui si ha una diversa espressione di questi filamenti intermedi. Ipercheratosi → aumento dello strato corneo superficiale, in alcune aree localizzate oppure generale. Tumori di origine ep.