Fisiopatologia

Diagnostica nel cancro

Diagnostica integrata

La diagnosi dal punto di vista morfologico permette di osservare le cellule al microscopio per capire se sono neoplastiche. Possono essere utilizzate delle colorazioni particolari che mettono in risalto la presenza o l’assenza di determinati enzimi o proteine.

Diagnosi genetica

L'utilizzo di tecniche di citogenetica e di genetica molecolare indaga il corredo genetico a DNA e l’RNA. Le neoplasie sono malattie che hanno cause genetiche: uno o più geni sono alterati nel loro funzionamento e, per questi motivi, la cellula assume un fenotipo neoplastico. Studiando il genoma interamente (genomica), è possibile capire quali sono le mutazioni che causano il cancro e come lo causano.

• Utilizzare questa conoscenza per fare test diagnostici e prognostici
• Capire l’evoluzione clonale per monitorare la malattia
• Capire come ideare nuove strategie terapeutiche

I tumori sono malattie clonali perché sono un insieme di cellule che derivano da un’unica cellula mutata. Tuttavia, all’interno di un tumore non sono tutte uguali tra loro, poiché derivano da singole cellule che, sottoposte a pressione selettiva, hanno acquisito nuove mutazioni e si sono replicate. Il tumore è una massa eterogenea.

Principali anomalie genomiche nel cancro

Riscontrabili con tecniche citogenetiche:

• Delezioni
• Amplificazioni
• Disomia uniparentale acquisita (aUPD)
• Ricombinazione mitotica
• Traslocazioni bilanciate

Riscontrabili con tecniche molecolari:

• Variazioni di sequenza (sostituzioni, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni in tandem)
• Cromotripsi: in una singola mitosi, parte del cromosoma viene frammentato in piccoli pezzi che possono essere persi (deleti), amplificati e ricollocati casualmente nel cromosoma

Cariotipo

Tecnica citogenetica in cui le cellule vengono messe in sospensione dopo essere state prelevate dal sangue periferico. Viene aggiunta fitoemoagglutinina che induce la mitosi e le cellule vengono lasciate crescere a 37°C per 3 giorni. A questo punto viene aggiunta la colchicina che blocca le cellule in metafase mitotica e una soluzione salina ipotonica che provoca la rottura delle cellule che vengono fissate su un vetrino. La digestione con tripsina e colorazione con Giemsa permette di visualizzare il bandeggio al microscopio ottico.

Non serve un’ipotesi a priori. La tecnica whole genome consente di vedere bene le anomalie clonali e della germline. È stata la prima tecnica utilizzata per fare diagnosi di tumori e ha portato alla scoperta del cromosoma Philadelphia che caratterizza la leucemia mieloide cronica (LMC). Ha una bassa risoluzione (ordine delle poche Mb) e alcune traslocazioni non vengono identificate se non avviene il cambiamento del pattern di colorazione. Ha anche una bassa sensibilità perché analizza poche cellule.

FISH

La tecnica FISH permette la detection delle anomalie cromosomiche. Non è necessario che le cellule siano in metafase, poiché l’ibridazione avviene su cromosomi in interfase. Ha specificità e sensibilità (decine di kb) maggiori, ma è necessario conoscere a priori quello che si vuole cercare e bisogna disegnare una sonda. Permette una visione parziale del genoma e non vede riarrangiamenti complessi. L’ibridazione di una sonda marcata con il genoma delle cellule che si devono analizzare utilizza sonde per traslocazione. Se si trova un segnale di fusione (es: BCR-ABL), i due cromosomi sono molto vicini e, se molte cellule hanno questo segnale, significa che hanno la traslocazione. ABL è marcato in arancio, BCR è marcato in verde e il giallo indica la proteina di fusione.

MLL è un trascritto molto comune e con molti “partner”. Le traslocazioni in cui è coinvolto danno origine a prodotti di fusione che causano leucemie. Per questo motivo, si utilizza una sonda break-apart con entrambe le estremità di un punto di rottura marcate, una in verde e una in arancione. Se si vede giallo, la proteina è integra. Se si vede arancione e verde, c’è una traslocazione di MLL, anche se non si sa su quale cromosoma, ma solo che il locus è rotto.

CGH-array e SNP-array

Queste sono tecniche nate con il sequenziamento del genoma umano. Si basano sul fatto che delle sequenze complementari a determinate sequenze cromosomiche note del genoma vengono fissate su chip (superficie solida). Si conosce quale sonda è presente in una posizione e a quale sequenza è complementare. Le sequenze vengono inoltre legate a dei fluorocromi che emettono fluorescenza in caso di appaiamento. L'output è l’intensità di fluorescenza:

• Quanto DNA si lega con la sonda (CGH array)
• Quanto DNA di ogni allele si lega con la sonda (SNP array)

Questa tecnica permette la detection di perdite o acquisizioni di DNA a livello genomico e di loss of heterozygosity (SNP array).

CGH Comparative Genomic Hibridization: si prende il DNA del presunto tumore e il DNA di controllo (germline) del paziente. Il DNA viene frammentato e legato a fluorocromi utilizzando due colori diversi in base all’origine del DNA. I frammenti vengono fatti ibridare sul chip e si legano in quantità maggiore o minore a seconda della loro rappresentazione. Se il segnale di controllo è superiore a quello del DNA tumorale, si ha una delezione. Se il segnale tumorale è superiore al controllo, si ha un'amplificazione. Se il segnale è neutro, non c'è stata mutazione.

LogR ratio (LR) è l’intensità di fluorescenza rispetto al normale, ratio in scala logaritmica del rapporto rosso/verde. Viene usato per determinare il copy number: in caso di delezione il LogR scende, per amplificazioni sale.

SNP Single Nucleotide Polymorphism è allele specifico, l’output non è solo quanta fluorescenza, ma quale fluorescenza. È focalizzato su regioni polimorfiche (polimorfismo di un singolo nucleotide), che sono regioni diverse per ogni individuo, ma sono sempre le stesse. Ci si concentra su queste, aspettandosi che un determinato nucleotide sia variabile da un individuo all’altro. Lo SNP-array dice quale allele è presente nel locus polimorfico e quale è maggiore. In questo caso, il DNA tumorale e il DNA controllo vengono messi su due chip separati. Sono presenti sonde che legano i siti polimorfici, permettendo di vedere quale e quanto DNA si lega (il numero di pallini indica la quantità di DNA legato). Il colore della fluorescenza indica il legame dell’allele A o B (le delezioni omozigoti tendono ad essere poco tollerate).

Un locus SNP bi-allelico ha tre possibili configurazioni:

• Omozigote per l’allele maggiore AA
• Eterozigote AB
• Omozigote per l’allele minore BB

Ci si aspetta che la maggioranza degli individui siano eterozigoti o omozigoti per l’allele maggiore. La fluorescenza dell’allele minore BAF o MAF si esprime in percentuale, ogni sonda è un pallino rosso che si colloca idealmente a 50 o 100% (eterozigosi e omozigosi), collocazioni diverse sono dovute a noise. Delezioni/amplificazioni variano sia il LogR che il BAF di quel locus. Si possono determinare anche perdite di eterozigosi (LOH). Le copy-neutral LOH sono perdite di eterozigosità in cui non si presentano variazioni del copy number (es: disomia uniparentale) due copie derivano dallo stesso allele.

Lo SNP-array dà informazioni più raffinate rispetto al CGH-array. È una tecnica genome-wide che permette l'analisi contemporanea di locus di SNP ordinati per posizione cromosomica. Queste tecniche hanno una sensibilità del 5-10%, la mutazione per essere percepita deve essere presente nella maggior parte delle cellule. Sono standardizzabili e hanno risoluzione di 1 Mb che può essere aumentata a 10-100 kb. Sono tecniche però più costose e laboriose della FISH e non vedono traslocazioni bilanciate.

PCR

La PCR è una tecnica che amplifica una porzione di DNA target (o cDNA) amplicone (lunghezza varia da 80 bp a qualche kb). Necessari: primers forward e reverse, dNTPs, DNA polimerasi, buffer. In base a come vengono disegnati i primer, viene messa in mostra:

• Presenza/assenza della banda (amplicone) nel gel di agarosio
• Dimensioni della banda

Bisogna conoscere le dimensioni della sequenza di DNA che ci aspettiamo: se la banda è più grande o più piccola, è possibile che ci sia un'inserzione o delezione. Le proprietà fisiche dell’amplicone (come la temperatura di melting) e la sequenza della banda possono essere determinate mediante amplificazione o mediante l’utilizzo di endonucleasi che tagliano il DNA in sequenze note (siti di restrizione).

In un laboratorio di ematologia, la PCR serve per la diagnosi e prognosi di MRD. DNA mutazioni puntiformi, inserzioni, delezioni, inversioni, traslocazioni, amplificazioni e delezioni (qPCR). RNA espressione genica (qPCR). Analisi di chimerismo nei trapianti: si misura quanto DNA c’è del paziente e quanto del donatore. Per analizzare le traslocazioni viene utilizzato il cDNA. Le traslocazioni sono eventi in cui il break-point può essere molto variabile. L’amplicone medio è lungo circa 1000 pb (10.000 con long-range), quindi bisognerebbe disegnare moltissimi templati. Conviene piuttosto utilizzare il cDNA e primer esonici distanti nel genoma ma vicini nell’RNA maturo, senza ricercare il break-point genomico (spesso intronico).

• Mutazioni puntiformi: sequenziamento del prodotto, digestione del prodotto e curva di melting
• Inserzioni/delezioni
• Traslocazioni: presenza del prodotto e misura del break-point
• Espressione genica: intensità di fluorescenza (real-time)
• Chimerismo nei riceventi dei trapianti: dimensione e quantità del prodotto

Esempio: geni RAS

I geni RAS sono oncogeni che, se mutati in hot-spot, fanno diventare la cellula tumorale. Le mutazioni sono sempre puntiformi, mai traslocazioni. Per sapere se sono mutati, si può fare una end-point melt curve analysis che misura l’intensità di fluorescenza utilizzando il syber-green, analisi dell’amplicone direttamente nel termociclatore. Analisi della curva di dissociazione del DNA wild-type e del DNA mutato: mutazioni diverse danno picchi diversi. In arancione mutazione in eterozigosi, in nero wild-type.

Nelle leucemie mieloidi acute viene spesso mutato FLT3, il quale codifica per un recettore di membrana tirosin-chinasico. La mutazione conferisce al recettore un’attività ligando-indipendente. Due tipi di mutazioni:

• Internal tandem duplication (ITD): avviene nella regione peri-membrana e ha come conseguenza un’alterazione strutturale che lascia costitutivamente attiva la porzione extracellulare (1/3 delle leucemie)
• Point mutation del dominio intracellulare catalitico

È importante sapere se FLT3 è mutato o meno perché cambia la prognosi.

Pazienti con internal tandem duplication

Pazienti con internal tandem duplication (A) hanno frammenti più lunghi. C’è un doppietto con bande a peso molecolare più elevato. Più grossa è la duplicazione, più indietro resta la seconda banda. Dalla a alla j blasti che non hanno ITD, l’amplicone corre all’altezza attesa. K doppietto molecole di DNA a peso atteso + altre a peso molecolare più alto. Dimensione della duplicazione: in k è corta, in m la seconda banda è più in alto, quindi è di dimensioni maggiori. Rapporto tra il numero di molecole che hanno duplicazione e molecole che non la hanno: in casi di doppietto ci aspettiamo che abbia una luminosità uguale nelle due bande in caso di eterozigosi. È vero solo parzialmente: i frammenti più lunghi si amplificano con minore efficienza, dando un’intensità minore. 50/50 vero solo se la duplicazione è presente nella prima cellula mutata e da lì nel 100% del tumore.

Esistono però dei fattori confondenti: nel campione possono essere presenti delle cellule che non appartengono al clone leucemico. In un tumore, le mutazioni che corrispondono al fenotipo non avvengono nella stessa cellula: una prima alterazione causa un’espansione sub-clinica. La cellula con mutazione viene selezionata positivamente ed espande il suo clone. FLT3 è una mutazione tardiva, si sviluppa in un contesto permissivo quando il clone è già leucemico. Potrebbe essere sub-clonale, presente solo in alcune cellule del campione; raro trovarla a livello clonale.

Nel Gene Scan vengono rappresentate la dimensione (più a destra quanto più è grande) e la quantità di molecole (altezza della banda) della banda. Ratio 0.13 vuol dire che l’allele mutato è presente nel 13% delle molecole analizzate. Fattore prognostico negativo se ratio è almeno 0.5 (50% delle cellule mutate). Paziente con ratio = 21 sembra essere tutto duplicato, probabilmente è disomia uniparentale. Crossing-over mitotico, preso tutto il materiale genetico da un solo genitore. La ITD fa proliferare di più la cellula mutata che soppianta le altre cellule, quindi è correlata a una prognosi negativa.

Mutazione puntiforme di FLT3

G diventa C nella regione del dominio citoplasmatico. La mutazione avviene in una regione palindromica GATATC, sito di restrizione per l’enzima di restrizione Eco-RV. Per vedere se c’è la mutazione, l’amplicone viene digerito con l’enzima. Esempio: se banda amplificata sono 100 pb, se avviene la digestione si formano due bande 60 pb + 40 pb. Paziente con mutazione non ha il sito di restrizione, enzima non taglia, solo una banda. Ma può comunque avere il doppietto per via delle altre cellule non mutate presenti nel campione. Serve una doppia coppia di primer.

PCR nelle traslocazioni BCR-ABL

BCR-ABL è una proteina di fusione presente nella leucemia mieloide cronica. È una proteina chimerica generata da una traslocazione e rappresenta uno dei pochi esempi di lesione necessaria e sufficiente per la genesi di una neoplasia. Rappresenta un bersaglio terapeutico. Imatinib è un farmaco che targetta la chinasi e manda in apoptosi le cellule con la traslocazione. La probabilità di cura è correlata alla presenza di cellule con la traslocazione. Ci sono vari break-point possibili su BCR p190, p210, p230, generazione di diverse proteine di fusione con un livello di attività diverso, per questo motivo è importante sapere il break-point del paziente. I tre possibili break-point non sono vicini, uscirebbe un amplicone troppo grande. Si effettua una multiplex PCR che contiene più di 2 primer, aumentando le possibilità di dare un amplicone, identificazione della quasi totalità delle combinazioni di possibili riarrangiamenti di BCR-ABL.

RT-PCR per BCR-ABL

Per BCR-ABL viene fatta una RT-PCR con 4 diversi primer:

• Standard interno (primer forward e reverse sono su BCR)
• 1 primer reverse su ABL e 2 primer forward su BCR

I due forward di BCR possono coniugarsi con il reverse di ABL in modi diversi rispetto al break-point. Controllo interno: se non c’è la traslocazione, avviene la duplicazione del frammento giallo. Imatinib manda in apoptosi le cellule con BCR-ABL. È necessario sapere quante sono le cellule con la traslocazione che sono rimaste (malattia minima residua). Viene utilizzata la PCR quantitativa; se si hanno 0 cellule su 1 milione, per mesi e mesi può essere sospesa la terapia. Metà di questi pazienti sono curati, metà avranno una recidiva a lungo termine e riprenderanno la cura.

Digital droplet PCR

Tecnica più sensibile della PCR quantitativa. Si mettono le molecole di DNA in delle beads (sfere di materiale oleoso), in ognuna delle quali si compie una reazione di PCR separata. Read-out per ogni molecola: si possono contare quante molecole ci sono con mutazione. I polimorfismi vengono sfruttati per rilevare il chimerismo. Un locus è polimorfico se vi sono due o più alleli che vengono mantenuti nella popolazione e in cui l’allele più raro ha una frequenza di almeno l’1%.

Tipi di polimorfismi

• RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: modificazione di una sequenza rilevabile mediante una variazione della sua mappa di restrizione
• VNTR Variable Number of Tandem Repeats (minisatelliti): corte unità ripetute in tandem con sequenza variabile, ma con un motivo centrale conservato
• STR Short Tandem Repeats (microsatelliti): blocchi inferiori a 150 nucleotidi dispersi in tutti i cromosomi, dimensione dell’unità ripetuta: 1-4 paia di basi
• SNP Single Nucleotide Polymorphism: rappresentano la forma più comune di variazione genetica e possono essere esonici

Ogni sito polimorfico ha differenti versioni alleliche. STR allelici possono essere analizzati dalla dimensione dell’amplicone. Nel trapianto di midollo osseo allogenico, il paziente diventa una chimera genetica in quanto contiene due tipi di materiale genetico. Per sapere se il trapianto ha funzionato, si possono cercare le cellule leucemiche (complicato, bisogna trovare la lesione che ha fondato il tumore, non quelle tardive) oppure si può controllare se il midollo osseo contiene materiale genetico del donatore o del residuo del ricevente. Se c’è mismatch di sesso, controllo del cromosoma Y (ma è meglio se i trapianti vengono fatti tra persone dello stesso sesso) facendo il cariotipo o utilizzando la FISH. Per indagare meglio, vengono utilizzate delle tecniche di biologia molecolare. Vengono utilizzate le differenze genomiche come i polimorfismi, differenze di sequenza tra individui di una stessa specie. Esiste un genoma umano standard creato al computer in cui in ogni locus polimorfico è riportata quella più frequente nella popolazione, senza alleli di malattia. Si guarda se il donatore e il ricevente condividono questi polimorfismi per monitorare il successo del trapianto.