Fisiopatologia

DIAGNOSTICA NEL CANCRO

E’ una diagnostica integrata

- diagnosi dal punto di vista morfologico

osservando le cellule al microscopio è possibile capire se sono neoplastiche

possono essere utilizzate delle colorazioni particolari che mettono in risalto la presenza o l’assenza di determinati

enzimi o proteine

- diagnosi genetica

utilizzo di tecniche di citogenetica e di genetica molecolare

indagano il corredo genetico a DNA e l’RNA

Le neoplasie sono malattie che hanno cause genetiche

uno o più geni sono alterati nel loro funzionamento, per questi motivi la cellula assume un fenotipo neoplastico

Studiando il genoma interamente (genomica) è possibile

Capire quali sono le mutazioni che causano il cancro e capire come lo causano

⇾ Utilizzare questa conoscenza per fare test diagnostici e prognostici

⇾ Capire l’evoluzione clonale per monitorare la malattia

⇾ i tumori sono malattie clonali perché sono un insieme di cellule che derivano da un’unica cellula mutata

ma all’interno di un tumore non sono tutte uguali tra loro, derivano da singole cellule che sottoposte a pressione

selettiva hanno acquisito nuove mutazioni e si sono replicate, il tumore è una massa eterogenea

Capire come ideare nuove strategie terapeutiche

⇾

Principali anomalie genomiche nel cancro

Riscontrabili con tecniche citogenetiche

- delezioni

- amplificazioni

- disomia uniparentale acquisita (aUPD)

ricombinazione mitotica

- traslocazioni bilanciate

Riscontrabili con tecniche molecolari

Possono rilevare anche variazioni di pochi o singoli nucleotidi

- variazioni di sequenza (sostituzioni, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni in tandem)

- cromotripsi

in una singola mitosi, parte del cromosoma viene frammentato in piccoli pezzi che possono essere persi (deleti)

amplificati e vengono ricollocati in maniera casuale nel cromosoma

si vede male con il bandeggio (pur essendo un danno citogenetico), viene visto meglio con tecniche genomiche (NGS)

• Cariotipo

Tecnica citogenetica Le cellule vengono messe in sospensione dopo essere state prelevate dal sangue

periferico

Viene aggiunta fitoemoagglutinina che induce la mitosi e le cellule vengono lasciate

crescere a 37°C per 3 giorni

A questo punto viene aggiunta la colchicina che blocca le cellule in metafase mitotica e

una soluzione salina ipotonica che provoca la rottura delle cellule che vengono fissate

su un vetrino

Digestione con tripsina e colorazione con Giemsa per poter visualizzare il bandeggio

al microscopio ottico

Non serve un’ipotesi a priori tecnica whole genome

⇾

Consente di vedere bene le anomalie clonali e della germline

Prima tecnica utilizzata per fare diagnosi di tumori

Scoperta del cromosoma Philadelpia che caratterizza la leucemia mieloide cronica LMC

Ha una bassa risoluzione (ordine delle poche Mb), alcune traslocazioni non vengono identificate se non avviene il

cambiamento del pattern di colorazione

Ha una bassa sensitività perché analizza poche cellule

• FISH

Detection delle anomalie cromosomiche

Non è necessario che le cellule siano in metafase, l’ibridazione avviene su cromosomi in interfase

Ha specificità e sensibilità (decine di kb) maggiori

E’ però necessario conoscere a priori quello che si vuole cercare bisogna disegnare una sonda

⇾

Permette una visione parziale del genoma e non vede riarrangiamenti complessi

Ibridazione di una sonda marcata con il genoma delle cellule che si devono analizzare ,utilizzate sonde per traslocazione

Se trovo segnale di fusione (es: BCR-ABL), i due cromosomi sono molto vicini, se molte cellule hanno

queste segnale significa che hanno la traslocazione

ABL marcato in arancio

BCR marcato in verde

Giallo proteina di fusione

⇾

MLL è un trascritto molto comune e con molti “partner”, le traslocazioni in cui è coinvolto danno origine

a prodotti di fusione che causano leucemie

utilizzata sonda break-apart marcate entrambe le estremità di un punto di rottura

⇾

una in verde e una in arancione

Se vedo giallo proteina è integra

⇾

Se vedo arancione e verde traslocazione di MLL, non si sa su quale cromosoma, si sa solo che il locus

⇾

è rotto

• CGH-array e SNP-array

Sono tecniche nate con il sequenziamento del genoma umano

Si basano sul fatto che delle sequenze complementari a determinate sequenze cromosomiche note del genoma vengono

fissate su chip (superficie solida), si conosce quale sonda è presente in una posizione e a quale sequenza è complementare

Le sequenze vengono inoltre legate a dei fluorocromi che emettono fluorescenza in caso di appaiamento output:

⇾

intensità di fluorescenza

- quanto DNA si lega con la sonda (CGH array)

- quanto DNA di ogni allele si lega con la dona (SNP array)

Detection di perdite o acquisizioni di DNA a livello genomico e di loss of heterozygosity (SNP array)

CGH Comparative Genomic Hibridization

Preso DNA del presunto tumore e DNA di controllo (germline) del paziente

Il DNA viene frammentato e legato a fluorocromi utilizzando due colori diversi in base all’origine

del DNA

I frammenti vengono fatti ibridare sul chip, si legano in quantità maggiore o minore a seconda

della loro rappresentazione

Delezione se segnale di controllo superiore a quello del DNA tumorale

Amplificazione se il segnale tumorale è superiore al controllo

Se il segnale è neutro, non c’è stata mutazione

LogR ratio (LR) intensità di fluorescenza rispetto al normale, ratio in scala logaritmica del rapporto rosso/verde

⇾

viene usato per determinare il copy number in caso di delezione il LogR scende, per amplificazioni sale

⇾

SNP Single Nucleotide Polimorfism

E’ allele specifico, l’output non è solo quanta fluorescenza, ma quale fluorescenza

E’ focalizzato su regioni polimorfiche (polimorfismo di un singolo nucleotide), sono regioni

diverse per ogni individuo, ma sono sempre le stesse

ci si concentra su queste aspettandosi che un determinato nucleotide sia variabile da un

individuo all’altro

Lo SNP-array dice quale allele è presente nel locus polimorfico e quale è maggiore

In questo caso, il DNA tumorale e il DNA controllo vengono messi su due chip separati

presenti sonde che legano i siti polimorfici

Possibile vedere quale e quanto DNA si lega (il numero di pallini indica la quantità di DNA legato)

Il colore della fluorescenza indica il legame dell’allele A o B (le delezioni omozigoti tendono ad essere poco tollerate)

Un locus SNP bi-allelico ha tre possibili configurazioni

- omozigote per l’allele maggiore AA

- eterozigote AB

- omozigote per l’allele minore BB

Ci si aspetta che la maggioranza degli individui siano eterozigoti o omozigoti per l’allele maggiore

Fluorescenza dell’allele minore BAF o MAF

⇾

si esprime in percentuale, ogni sonda è un pallino rosso che si colloca idealmente a 50 o

100 (eterozigosi e omozigosi), collocazioni diverse sono dovute a noise

Delezioni/amplificazioni variano sia il LogR che il BAF di quel locus

Si possono determinare anche perdite di eterozigosi (LOH)

Le copy-neutral LOH sono perdità di eterozigosità in cui non si presentano variazioni del

copy number (es: disomia uniparentale) due copie derivano dallo stesso allele

⇾

Lo SNP-array dà informazioni più raffinate rispetto al CGH-array

E’ una tecnica genome-wide analisi contemporanea di locus di SNP ordinati per posizione cromosomica

⇾

Queste tecniche hanno una sensibilità del 5-10%, la mutazione per essere percepita deve essere presentata nella maggior

parte delle cellule, sono standardizzabili e hanno risoluzione di 1 Mb che può essere aumentata a 10-100 kb

Sono tecniche però più costose e laboriose della FISH e non vedono traslocazioni bilanciate

• PCR

Tecnica che amplifica una porzione di DNA target (o cDNA) amplicone (lunghezza varia da 80 bp a qualche kb)

⇾

Necessari: primers forward e reverse, dNTPs, DNA polimerasi, buffer

In base a come vengono disegnati i primer, viene messa in mostra:

- presenza/assenza della banda (amplicone) nel gel di agarosio

- dimensioni della banda

dobbiamo conoscere le dimensione della sequenza di DNA che ci aspettiamo

se banda più grande o più piccola possibile inserzione o delezione

⇾

- proprietà fisiche dell’amplicone (come la temperatura di melting)

- sequenza della banda

mediante amplificazione

o mediante l’utilizzo di endonucleasi che tagliano il DNA in sequenze note (siti di restrizione), controllo creazione o

delezione di un sito di restrizione

In un laboratorio di ematologia, la PCR serve per la diagnosi e prognosi di MRD

DNA mutazioni puntiformi, inserzioni, delezioni, inversioni, traslocazioni, amplificazioni e delezioni (qPCR)

⇾

RNA espressione genica (qPCR)

⇾

Analisi di chimerismo nei trapianti: misuro quanto DNA c’è del paziente e quanto del donatore

Per analizzare le traslocazioni viene utilizzato il cDNA

Le traslocazioni sono eventi in cui il break-point può essere molto variabile

l’amplicone medio è lungo circa 1000 pb (10.000 con long-range), bisognerebbe disegnare moltissimi templati

Conviene piuttosto utilizzare il cDNA e primer esonici distanti nel genoma ma vicini nell’RNA maturo

senza ricercare il break-point genomico (spesso intronico)

- mutazioni puntiformi

sequenziamento del prodotto, digestione del prodotto e curva di melting

- inserzioni/delezioni

- traslocazioni

presenza del prodotto e misura del break-point

- espressione genica

intensità di fluorescenza (real-time)

- chimerismo nei riceventi dei trapianti

dimensione e quantità del prodotto

Esempio

I geni RAS sono oncogeni che se mutati in hot-spot fanno diventare la cellula tumorale

le mutazioni sono sempre puntiformi, mai traslocazioni

Per sapere se sono mutati, si può fare una end-point melt curve analysis misura dell’intensità di fluorescenza

⇾

utilizzando il syber-green, analisi dell’amplicone direttamente nel termociclatore

Analisi della curva di dissociazione del DNA wild-type e del DNA mutato

mutazioni diverse danno picchi diversi

In arancione mutazione in eterozigosi

⇾

In nero wild-type

⇾

Nelle leucemie mieloidi acute viene spesso mutato FLT3, il quale codifica per un recettore di membrana tirosin-chinasico

la mutazione conferisce al recettore un’attività ligando-indipendente

Due tipi di mutazioni:

- internal tandem duplication (ITD)

avviene nella regione peri-membrana e ha come conseguenza un’alterazione strutturale che lascia costitutivamente

attiva la porzione extracellulare (1/3 delle leucemie)

- point mutation del dominio intracellulare catalitico

E’ importante sapere se FLT3 è mutato o meno perché cambia la prognosi

• Pazienti con internal tandem duplication (A) hanno frammenti più lunghi c’è un doppietto con bande a peso

⇾

molecolare più elevato

Più grossa è la duplicazione, più indietro resta la seconda banda

Dalla a alla j blasti che non hanno ITD, l’amplicone corre all’altezza attesa

k doppietto molecole di DNA a peso atteso + altre a peso molecolare più alto

⇾

Dimensione della duplicazione: in k è corta, in m la seconda banda è più in alto,

quindi è di dimensioni maggiori

Rapporto tra il numero di molecole che hanno duplicazione e molecole che non la hanno

in casi di doppietto ci aspettiamo che abbia una luminosità uguale nelle due bande in caso di eterozigosi

è vero solo parzialmente: i frammenti più lunghi si amplificano con minore efficienza, dà un’intensità minore

50/50 vero solo se la duplicazione è presente nella prima cellula mutata e da lì nel 100% del tumore

Esistono però dei fattori confondenti: nel campione possono essere presenti delle cellule che non appartengono al clone

leucemico

In un tumore le mutazioni che corrispondono al fenotipo, non avvengono nella stessa cellula

una prima alterazione causa un’espansione sub-clinica cellula con mutazione viene selezionata positivamente ed

⇾

espande il suo clone

FLT3 è una mutazione tardiva, si sviluppa in un contesto permissivo quando il clone è già leucemico

Potrebbe essere sub-clonale presente solo in alcune cellule del campione, raro trovarla a livello clonale

⇾

Nel Gene Scan vengono rappresentate la dimensione (più a destra quanto più è grande) e la quantità di molecole (altezza

della banda) della banda

Ratio 0.13 vuol dire che l’allele mutato è presente nel 13% delle molecole analizzate

Fattore prognostico negativo se ratio è almeno 0.5 50% delle cellule mutate

⇾

Paziente con ratio = 21

sembra essere tutto duplicato, probabilmente è disomia uniparentale

crossing-over mitotico, preso tutto il materiale genetico da un solo genitore

La ITD fa proliferare di più le cellula mutata che soppianta le altre cellule, quindi è correlata a una prognosi negativa

• Mutazione puntiforme di FLT3

G diventa C nella regione del dominio citoplasmatico

La mutazione avviene in una regione palindromica GATATC sito di restrizione per l’enzima di restrizione Eco-RV

⇾

Per vedere se c’è la mutazione, l’amplicone viene digerito con l’enzima

Esempio: se banda amplificata sono 100 pb se avviene la digestione si formano due bande 60 pb + 40 pb

⇾

Paziente con mutazione non ha il sito di restrizione, enzima non taglia solo una banda

⇾

Ma può comunque avere il doppietto per via delle altre cellule non mutate presenti nel campione

Serve una doppia coppia di primer

PCR nelle traslocazioni BCR-ABL è una proteina di fusione presente nella leucemia mieloide cronica

E’ una proteina chimerica generata da una traslocazione e rappresenta uno dei

pochi esempi di lesione necessaria e sufficiente per la genesi di una neoplasia

Rappresenta un bersaglio terapeutico

Imatinib è un farmaco che targetta la chinasi e manda in apoptosi le cellule con

la traslocazione

Probabilità di cura è correlata alla presenza di cellule con la traslocazione

Ci sono vari break-point possibili su BCR p190, p210, p230

⇾

generazione di diverse proteine di fusione con un livello di attività diverso, per questo motivo è importante sapere il

break-point del paziente

I tre possibili break-point non sono vicini, uscirebbe un amplicone troppo grande

Si effettua una multiplex PCR Contiene più di 2 primer

aumentano le possibilità di dare un amplicone

identificazione della quasi totalità delle combinazioni di possibili

riarrangiamenti di BCR-ABL

Per BCR-ABL viene fatta una RT-PCR con 4 diversi primers

- standard interno (primer forward e reverse sono su BCR)

- 1 primer reverse su ABL e 2 primer forward su BCR

I due forward di BCR possono coniugarsi con il reverse di ABL in modi diversi rispetto al break-point

Controllo interno se non c’è la traslocazione avviene la duplicazione del frammento giallo

⇾

Imatinib manda in apoptosi le cellule con BCR-ABL

Ma è necessario sapere quante sono le cellule con la traslocazione che sono rimaste malattia minima residua

⇾

Viene utilizzata la PCR quantitativa

Se sia hanno 0 cellule su 1 milione, per mesi e mesi può essere sospesa la terapia metà di questi pazienti sono curati, metà

avranno una recidiva a lungo termine e riprenderanno la cura

Digital droplet PCR

Tecnica più sensibile della PCR quantitativa

Si mettono le molecole di DNA in delle beads (sfere di materiale oleoso), in ognuna delle quali si compie una reazione di

PCR separata

Read-out per ogni molecola: si possono contare quante molecole ci sono con mutazione

I polimorfismi vengono sfruttati per detectare il chimerismo

Un locus è polimorfico se vi sono due o più alleli che vengono mantenuti nella popolazione e in cui l’allele più raro ha una

frequenza di almeno l’1%

Esistono diversi tipi di polimorfismi

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism

⇾ modificazione di una sequenza rilevabili mediante una variazione della sua mappa di restrizione

i due alleli si differiscono l’uno dall’altro per la presenza/assenza di un sito di restrizione

VNTR Variable Number of Tandem Repeats (minisatelliti)

⇾ corte unità ripetute in tandem con sequenza variabile, ma con un motivo centrale conservato

famiglie telomeriche (6 pb) e famiglie ipervariabili (9-64 pb)

STR Short Tandem Repeats (microsatelliti)

⇾ blocchi inferiori a 150 nucleotidi dispersi in tutti in cromosomi, dimensione dell’unità ripetuta: 1-4 paia di basi

SNP Single Nucleotide Polymorphism

⇾ rappresentano la forma più comune di variazione genetica, possono essere esonici

Ogni sito polimorfico ha differenti versioni alleli

⇾

STR allelici possono essere analizzati dalla dimensione dell’amplicone

Nel trapianto di midollo osseo allogenico, il paziente diventa una chimera genetica in quanto contiene due tipi di materiale

genetico

Per sapere se il trapianto ha funzionato, si possono cercare le cellule leucemiche (complicato, bisogna trovare la lesione

che ha fondato il tumore, non quelle tardive) oppure si può controllare se il midollo osseo contiene materiale genetico del

donatore o del residuo del ricevente

Se c’è mismatch di sesso, controllo del cromosoma Y (ma è meglio se i trapianti vengono fatti tra persone dello stesso

sesso) facendo il cariotipo o utilizzando la FISH

Per indagare meglio, vengono utilizzate delle tecniche di biologia molecolare

Vengono utilizzate le differenze genomiche come i polimorfismi differenze di sequenza tra individui di una stessa specie

⇾

Esiste un genoma umano standard creato al computer in cui in ogni locus polimorfico è riportato quelle più frequente nelle

popolazione, senza alleli di malattia

Si guarda se il donatore e il rice