Fisiologia vegetale appunti

Il processo di eccitazione degli elettroni nelle molecole

Quando un elettrone salta sull'orbitale più esterno, si dice che la molecola è eccitata. Vengono assorbite dalla molecola solo quelle lunghezze d'onda che hanno un contenuto energetico che corrisponde al contenuto energetico dello stato basale dell'elettrone. Questo stato eccitato è intrinsecamente uno stato instabile per la molecola, per cui l'elettrone tende a decadere allo stato basale. Il decadimento può avvenire in diversi modi.

Metodi di decadimento degli elettroni

Ieri abbiamo detto che se l'elettrone torna allo stato basale, libera tutta l'energia che aveva assorbito. Questa energia può essere emessa:

• Sotto forma di calore - decadimento termico.
• Sotto forma di luce a lambda maggiore di quella assorbita - fluorescenza. Evidentemente l'energia residua viene di nuovo emessa come calore.
• Passando l'energia a un'altra molecola, cioè trasmettendo l'energia per risonanza.

Affinché questo possa succedere, devono esistere particolari relazioni tra la molecola donatore e la molecola accettore:

• È necessario che gli spettri di assorbimento della molecola donatore e quella accettore siano parzialmente sovrapposti, quindi simili. Questo perché il contenuto di energia che viene ceduto dovrà essere tale da permettere all'elettrone dell'altra molecola di saltare sull'orbitale più esterno.
• Il tipo di decadimento dipende anche dalla velocità dei diversi processi di decadimento. Il più veloce sarà quello che ha la massima probabilità di verificarsi. La trasmissione dell'energia per risonanza può avvenire solo se è più veloce della fluorescenza e della dispersione termica.
• Il tempo di trasmissione dell'energia per risonanza dipende anche dalla relazione spaziale delle molecole. Più vicine sono e più è probabile che la trasmissione per risonanza possa avvenire velocemente. Affinché avvenga nel giro di nanosecondi o meno, bisogna che la distanza tra le due molecole sia dell'ordine dei nanometri. Inoltre, bisogna tenere conto anche dell'orientamento delle due molecole nello spazio.

Esempio pratico: cloroplasti

Se ho una soluzione diluita in un pigmento che assorbe le radiazioni del visibile, la probabilità che io abbia la trasmissione dell'energia per risonanza è bassa perché le molecole non sono vicine e il loro orientamento nello spazio non è funzionale. Se però ho dei pigmenti che sono ancorati a un supporto, per cui la loro posizione nello spazio è definita e sono abbastanza vicini ed orientati correttamente, la trasmissione dell’energia da una molecola all'altra per risonanza può avvenire in modo efficace. Questo come vedremo è la situazione che si verifica all'interno dei cloroplasti.

Confronto tra i processi di decadimento

La differenza tra questi tre processi è che:

• Decadimento termico e fluorescenza avvengono coinvolgendo soltanto la molecola che ha assorbito il fotone, cioè sono forme di decadimento intramolecolare. Di conseguenza, la velocità con cui avviene il decadimento dipende solo dalle caratteristiche intrinseche della molecola e dalla maggiore o minore instabilità del suo stato eccitato.
• Nella risonanza, invece, la cessione dell'energia avviene dandola a un altro pigmento. In questo caso, il decadimento della molecola eccitata avviene tramite un processo intermolecolare che coinvolge lei e l'accettore.

I pigmenti fotosintetici, in questo caso le molecole di clorofilla, non sono in soluzione nei cloroplasti ma sono legati a dei complessi proteici. Ciascuna clorofilla è legata in uno specifico sito di una specifica proteina che fa parte di questi complessi. Questo fa sì che la distanza fra le molecole di clorofilla sia definita e possa essere molto piccola. Ma anche l'orientamento nello spazio, una volta che la molecola di clorofilla è ancorata a una proteina, è definito. Quindi la trasmissione dell'energia per risonanza tra pigmenti può avvenire.

FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer

Questa caratteristica dei pigmenti di poter trasmettere l'energia per risonanza da una molecola all'altra, purché le molecole donatore e accettore siano vicine fra di loro, è stata ampiamente utilizzata per sviluppare una tecnica di indagine che prende il nome di FRET, che sta per Fluorescence Resonance Energy Transfer.

Utilizzo della FRET

La FRET si può usare sia in vivo che in vitro per analizzare l'interazione fra molecole analizzando la fluorescenza emessa. Attacco a una molecola un pigmento che possa fare da donatore dell'energia e ad un’altra molecola (che mi interessa) attacco un altro pigmento che faccia da accettore, ossia che sia in grado di ricevere l’energia assorbita dal primo pigmento. Dopodiché illumino il campione con una lunghezza d'onda che vada bene per eccitare il primo pigmento e vado a misurare la fluorescenza emessa.

Se le due proteine stanno ognuna per i fatti propri, la fluorescenza che verrà emessa avrà lo spettro del primo pigmento. Se invece la seconda molecola si lega alla prima, per cui i due pigmenti diventano molto vicini, misurerò anche la fluorescenza alle lunghezze d'onda tipiche del secondo pigmento. Quindi sono in grado di capire, semplicemente osservando la fluorescenza emessa, se e quando le due proteine sono separate o se e quando le due proteine si legano.

Conversione dell'energia luminosa in energia chimica

Tornando al problema: voglio capire come l'energia luminosa viene trasformata in energia chimica. In tutti e tre i casi sopra descritti, se considero la molecola che ha assorbito il fotone, la molecola ha cambiato stato energetico, ma questa energia viene dissipata senza che alla molecola succeda qualcosa. La molecola che per prima ha assorbito il fotone, in tutti e tre i casi, ritorna allo stato basale "buttando via" la sua energia. Resta però il fatto che in tutti e 3 questi casi l'energia assorbita da una molecola viene dispersa da quella molecola senza che avvenga alcuna trasformazione chimica. Quindi non può essere utilizzata per fare lavoro.

Il potenziale redox nella fotochimica

Per capire come questa energia luminosa possa essere convertita in modo stabile in energia chimica, dobbiamo ritornare ad analizzare lo stato eccitato. Quando un elettrone passa dal suo orbitale ottimale a un orbitale più esterno, la sua interazione con il nucleo diventa più debole. L'attrazione fra la carica negativa dell’elettrone e quella positiva del nucleo diminuisce per via dell'aumento della distanza. Se un elettrone è meno saldamente attaccato alla molecola, aumenterà la sua possibilità di essere ceduto a un'altra molecola.

Questo vuol dire che la molecola allo stato eccitato ha un potenziale redox più negativo di quando è allo stato basale. Diventa un riducente più forte, oppure da ossidante diventa riducente.

Di quanto varia il potenziale redox? Dipende da quanta è l'energia contenuta nel fotone che è stato assorbito. Quindi dipende dalla lunghezza d'onda del fotone assorbito. Maggiore è il contenuto energetico del fotone, maggiore sarà la variazione del potenziale redox tra stato basale ed eccitato. Questa variazione possiamo quantificarla dividendo il contenuto di energia di una mole di fotoni (energia assorbita) per la costante di Faraday, cioè per la carica di una mole di elettroni.

Il lavoro contro gradiente di potenziale redox

Per portare il potenziale redox da un valore di potenziale redox a un altro, devo fare un lavoro che è pari alla differenza di potenziale redox per la carica di una mole di elettroni. Quindi la differenza di potenziale redox tra lo stato basale e lo stato eccitato sarà uguale all'energia assorbita diviso la costante di Faraday. Come si vede dalla colonna destra della tabella, la variazione di potenziale redox che una molecola ha in seguito all'assorbimento di un fotone (cioè di una radiazione elettromagnetica nelle lunghezze d'onda del visibile) non è cosa da poco se teniamo conto che la differenza di potenziale redox tra la coppia acqua-ossigeno e la coppia NADH/NAD è circa 1 e 1.

A 400 nm siamo intorno a 3 elettronvolt. Anche con 700 nm (lunghezze d'onda più lunghe del visibile) il salto è di 1.76 elettronvolt. Questo significa che la variazione di potenziale redox di una molecola in seguito all'assorbimento di un fotone è una variazione molto grossa che può trasformare una molecola che ha un potenziale redox positivo, e che quindi è allo stato basale come ossidante, in buon riducente (potenziale redox negativo).

La fotossidazione

Un buon riducente, affinché possa agire come riducente, è necessario che trovi un accettore di elettroni che prenda il suo elettrone ad una velocità tale per cui questo succeda prima di una delle tre tipologie di decadimento. È possibile la fotossidazione solo se c'è disponibile un accettore di elettroni capace di reagire con il pigmento eccitato ad una velocità molto alta, ossia ad una velocità superiore alla velocità del decadimento termico, del decadimento per fluorescenza e dell'eventuale decadimento dell'energia per risonanza.

Se o quando la reazione di fotossidazione, in cui l'elemento eccitato cede il suo elettrone ad un accettore, avviene abbastanza rapidamente, prima che avvengano le altre forme di decadimento, abbiamo avuto la trasformazione stabile dell'energia radiante assorbita in energia chimica. L'energia è stata dunque utilizzata per fare il lavoro di riduzione dell'accettore.

Trasferire gli elettroni da un pigmento allo stato basale all'accettore (riduzione dell’accettore) sarebbe un lavoro contro gradiente di potenziale redox, e quindi la reazione non sarebbe spontanea. Ma siccome il pigmento è eccitato, il suo potenziale redox è cambiato e quindi il trasferimento dell'elettrone diventa una reazione importante.

L'accettore sarebbe più riducente del pigmento non eccitato, ma grazie all'energia assorbita con il fotone, il pigmento si è eccitato ed è diventato più riducente dell'accettore. Quindi una reazione redox che a condizioni basali non poteva avvenire, perché aveva un deltaG positivo, con l'input dell'energia luminosa, che ha cambiato il potenziale redox del pigmento, diventa possibile. Quindi l’accettore si può ridurre. Questa è il nocciolo della fotochimica, che non è altro che la conversione dell'energia luminosa in energia chimica.

Processi intermolecolari e intramolecolari

È vero che già il passaggio del pigmento dallo stato basale allo stato eccitato è una reazione di tipo chimico, ma è una cosa stabile, mentre quando il pigmento eccitato si fotossida su un accettore, che non avrebbe potuto ridurre senza l’eccitazione da parte della luce, abbiamo la conversione dell'energia luminosa in energia chimica. L'energia luminosa viene utilizzata da questa reazione per fare il lavoro di ridurre l'accettore.

Evidentemente, come nel caso della risonanza, anche la fotossidazione del pigmento è un processo intermolecolare perché richiede l'intervento di un pigmento e dell'accettore. Quindi la velocità di questo processo non dipenderà solo dalle caratteristiche intrinseche del pigmento, ma anche da quelle dell'accettore di elettroni e dalla relazione del pigmento con l'accettore di elettroni. Le reazioni intramolecolari dipendono solo dalle caratteristiche del pigmento e sono il decadimento termico e il decadimento per fluorescenza. Le reazioni intermolecolari dipendono sia dalle caratteristiche del pigmento, che dalle caratteristiche dell'accettore (dell'energia in un caso, dell'elettrone nell'altro) ed alla relazione fra pigmento ed accettore. La probabilità che avvenga uno di questi 4 processi dipende dalla cinetica di questi processi. Quello che ha parametri cinetici più veloci sarà quello che avrà la massima probabilità di avvenire.

Esempio: 100 molecole di pigmento

Immaginiamo 100 molecole di pigmento che assorbono un fotone contemporaneamente. Per ognuna di loro può succedere uno dei 4 processi. Alla maggior parte dei 100 pigmenti succederà quello che avviene più velocemente. La "magia" dell'evoluzione sta nel fatto di aver prodotto delle macchine in cui si ottimizza la possibilità di utilizzare l'energia luminosa per fare un lavoro chimico riducendo un accettore di elettroni. Ossia la possibilità di ottimizzare la conversione dell'energia luminosa in energia chimica. Dobbiamo quindi capire come questo è possibile nelle cellule vegetali.

Fotosintesi

Per capire come nelle piante, nei cloroplasti, avviene la conversione dell'energia luminosa in chimica, dobbiamo capire quali sono i pigmenti (molecole capaci di assorbire la luce nel visibile) che sono coinvolti in questo processo. Devo capire 3 cose:

• Le lunghezze d'onda utilizzate nella fotosintesi.
• Quali sono i pigmenti presenti nei cloroplasti.
• Quali sono gli spettri di assorbimento di questi pigmenti.

Devo poi mettere insieme queste informazioni per capire quali dei pigmenti presenti nei cloroplasti sono effettivamente implicati nella trasformazione dell'energia luminosa in energia chimica.

Quali sono le lunghezze d'onda utilizzate nella fotosintesi?

Devo fare uno spettro di azione, cioè devo illuminare i cloroplasti con luci monocromatiche a diverse lunghezze d'onda (cercando di usare la stessa intensità luminosa per ogni lunghezza d'onda) e per ogni lunghezza d'onda misurare la velocità della fotosintesi. Lo spettro di azione è quindi lo spettro in cui misuro come varia la velocità di fotosintesi al variare della lunghezza d'onda. Lo spettro di azione, nel grafico in alto, è quello disegnato con la linea tratteggiata. La linea continua è il risultato dell'interpolazione di 100000 misure fatte variando la lunghezza d'onda di tot. nm per volta. La velocità di fotosintesi è stata misurata come velocità di evoluzione di ossigeno. Quello che si vede è che fondamentalmente ci sono due zone dello spettro in cui la luce è efficace nel rendere possibile la fotosintesi: una nel blu e una nel rosso.

Sullo stesso campione si può fare anche uno spettro di assorbimento, ossia misurare come varia l'assorbanza del campione al variare della lunghezza d'onda. Lo spettro di assorbimento è rappresentato nel grafico dalla linea continua. Lo spettro di assorbimento ha anch’esso due zone in cui si verifica il massimo di assorbimento, che sono quelle nel blu e nel rosso. I due spettri sono dunque simili ma non sono uguali per due motivi:

• In particolare nella zona del blu lo spettro di assorbimento è sensibilmente più alto dello spettro di azione. Questo vuol dire che solo una parte della luce blu che viene assorbita viene effettivamente utilizzata nel processo fotosintetico.
• L'altra differenza sta nel fatto che al di sopra di 680-690 nm lo spettro di azione crolla molto più ripidamente dello spettro di assorbimento. La prima differenza ci dice che nei cloroplasti ci sono dei pigmenti che assorbono la luce blu e che non partecipano direttamente nel processo fotosintetico.

Quali sono i pigmenti presenti nei cloroplasti?

Per capirlo devo fare un'analisi chimica. Il risultato è che ci sono due tipi di pigmenti diversi nei cloroplasti:

• La clorofilla: la molecola di clorofilla è costituita da un anello tetrapirrolico, come quello dei citocromi. Il metallo che viene coordinato dall'anello tetrapirrolico nei citocromi è il ferro mentre nella clorofilla è il magnesio. Legato all'anello tetrapirrolico c'è un alcol a lunga catena che è il fitolo. Il fitolo è una catena di CH₂-CH₂ con pochissimi ossigeni, è quindi una molecola fortemente apolare (quindi idrofoba o lipofila). Questo è ciò che rende la clorofilla insolubile in acqua. Quella disegnata nel lucido è la clorofilla a. Nei cloroplasti delle piante superiori sono presenti sia clorofilla a che clorofilla b. La clorofilla b è identica alla a eccetto per un atomo di carbonio che nella clorofilla a è un CH₃, mentre nella clorofilla b è un carbonio aldeidico o carbonilico (COOH). Quindi la clorofilla b è un po' più ossidata della clorofilla a. Una volta che ho purificato le clorofille posso fare il loro spettro di assorbimento: analizzare come varia la loro assorbanza al variare della lunghezza d'onda: se guardiamo i due spettri vediamo che basta l'ossidazione di un unico atomo di carbonio dal CH₃ al carbonio carbonilico per cambiare in modo significativo lo spettro di assorbimento. Sia la clorofilla a che la clorofilla b hanno un picco di assorbimento nel blu (400/500 nm) e uno nel rosso (650/700 nm). I due picchi però non sono uguali nelle due molecole. La clorofilla b assorbe la luce a lunghezze d'onda un po' più lunghe della clorofilla a nel blu e a lunghezze d'onda un po' più corte della clorofilla a nel rosso.
• I carotenoidi: il precursore dei carotenoidi è il carotene. Il beta-carotene è una serie di gruppi CH legati tra loro.