Fisiologia Vegetale (Prof.ssa Gonnelli)

CICLO DI CALVIN

il ciclo catalitico della fissazione della CO

E‘ , detto anche Ciclo C3 o Ciclo riduttivo die

2

Pentosi Fosfati, e si distingue in 3 tappe:

carbonica e legata a

1) Carbossilazione (entra l’anidride qualcosa)

2) Riduzione carbonica , che

(l’anidride ha formato un gruppo carbossilico viene ridotta con formazione di zuccheri con

ATP e NADPH)

3) Rigenerazione ( di colui che aveva accettato la CO )

2

Per funzionare, il ciclo ha bisogno di:

- CO

2

- Un accettore della CO 2

- NADPH

- ATP capace di prendere la CO

Nella prima tappa l’enzima e fissarla al primo accettore è una

2

carbossilasi: è definita fra il mondo dei viventi e dei non viventi (fa entrare una molecola

è rappesentato da uno zucchero

inorganica nelle molecole organiche). L’accettore a 5 atomi di

carbonio con 2 fosfati (in posizione 1 e 5), detto Ribulosio e quindi la carbossilasi si chiamerà

Ribulosio-1,5-bifosfato carbossilasi-ossigenasi (in alcune condizioni può inserire un ossigeno sul

una proteina molto grossa, ottamero, formato

substrato). Questo enzima è anche detto Rubisco. E‘

da 8 subunità grandi dette L e 8 subunità piccole dette S: L8S8. Queste subunità vengono fatti dai

geni per la rubisco detti rbc, si trovano nel genoma plastidiale, per quelli che codificano le subunità

L, mentre si trovano nel genoma nucleare quelli che codificano le subunità S e quindi, una volta

formati vengono portati dentro il cloroplasto.

il cloroplasto, in attesa delle subunità S, iniza la sintesi di subunità

Per iniziare l’assemblamento,

simili a quelle S. Le subunità S entrano grazie ad un peptide di transito. Perchè geni del cloroplasto

al cloroplasto nel momento in cui si è

si sono trasferiti nel nucleo? Per togliere l’autonomia

verificata la simbiosi assicurandosi la simbiosi stessa. Tutto questo in piante, alghe e cianobatteri.

Vi sono delle isoforme della Rubisco (L8S8 è caratteristica della fotosintesi ossigenica): L2 e L10.

dall’altro posti all’interfaccia fra le

Vi sono 8 siti catalitici che lavorano indipendentemente l’uno

subunità L. Le S hanno ruolo regolativo e lavorano, attraverso i loro 8 siti catalitici,

dall’altro all’interfaccia

indipendentemente l‘uno fra le subunità L. Il sito catalitico della rubisco è

organizzato attorno ad uno ione magnesio. Lo ione magnesio coordina tutto ciò che presenti cariche

negative e in particolare lega 3 amminoacidi: asparato, glutammato e la lisina (che però è un

+

amminoacido basico ed è carico positivamente per la presenza di -NH ). Essa è in grado di

3

il gruppo amminico terminale ma c’è legata

coordinare il magnesio perchè , in questo caso, non c’è

una moleocola di anidride carbonica (non è quella che poi verrà inserita sul ribulosio). Il

gruppo terminale della lisina subisce una reazione di carbamilazione spontanea: l’anidride

carbonica si lega al gruppo amminico terminale e una lisina del genere si dice carbamilata. Il

gruppo carbossilico di tale ammina si dissocia (carbammato), diventa negativo ed è in grado di

cooridinare il ione magnesio. Il magnesio coordina anche la CO che deve essere attacata al

2

Ribulosio-1,5-bifosfato e il Ribulosio-1,5-bifosfato. Quando il sito catalitico è attivo, esso lega il

substrato, si ha un cambiamento conformazionale che chiude il sito attivo sul substrato, espelle tutte

le molecole di acqua forchè una che sarà coinvolta nella catalisi. Quindi una volta legato il

inizia a processarci l’anidride carbonica.

ribulosio, l’enzima La rubisco è un enzima lento:

carbossila solo 3 molecole al secondo. La cellula supplisce a questo inconveniente facendone tante

copie (è la proteina più abbondante sulla terra). In oltre è poco specifica: il sito di legame lega sia

carbonica sia l’ossigeno

l’anidride ( ed è bene che ci sia). Il rapporto di frequesza tra anidride

dell‘

carbonica e ossigeno è 3:1 (ogni 3 CO uno Ossigeno). Questo non significa che l’affinità

2 La concentrazione atmosferica

anidride carbonica è 3 volte quella dell’ossigeno. della CO è

2

ma i

0,039% mentre quela dell’O è 21% ; è chiaro che la rubisco non prende i gas dall’atmosfera

2

gas che si sono sciolti nello stroma che sarà direttamente proporzionale alla loro concentrazione.

Con questa differnza di concentrazione l’affinità nella CO aumenta perchè la pianta sente che c’è

2

Quindi la Km per la CO

meno anidride carbonica rispetto all’ossigeno. è 9 microMolare mentre per

2

è 350 microMolare (Km=corrisponde alla concentrazione di substrato per avere la

l’ossigeno dell’enzima per il substrato; bassa Km, maggiore

velocità semimassimale e quindi indica l’affinità

affinità)

- REAZIONE DI FISSAZIONE DELLA CO 2

di una CO

La rubisco catalizza l’addizione sul RuBP con la formazione di un composto

2

instabile e che si divide in 2 molecole a C3: 2 molecole di 3 fosfoglicerato (acido organico).

Avviene in 3 tappe principali:

1) Enolizzazione (1-2): passaggio dal RuBP dalla forma chetonica alla forma enolica. Il

ribulosio è uno zucchero a 5 atomi di carbonio (essere uno zucchero significa avere una

funzione aldeidica o chetonica). Il ribulosio è un chetone. Il carbonile è un posizione 2.

–OH

Gli altri carboni portano tutti un e in questo caso in posizione 1 e 5 vi è un gruppo

fosfato con legame ester con l’-OH del carbonio (l’esterificazione è il legame trau n

stato scelto questo zuchero

alcol e un acido con sottrazione di una molecola di acqua). E‘

perchè: non poteva non essere qualcosa con i 2 fosfati perchè se deve arrivare una

molecola di CO dovrò in qualche modo destabilizzare il substrato e quindi avere una

2

molecola attivata, niente di meglio che metterci 2 fosfati che si repingono per la

sterico: una molecola in tensione è più

presenza di cariche negative e per l’ingombro

l’idrogeno del C3 viene

facilmente maneggiabile. Nell’enolizzazione rimosso e posto nel

enolico (endiolica in questo caso). La tautomeria è

carbonile formando l’intermedio

spontanea ma ci sono degli ambienti che li favoriscono. L’equilibrio è quindi spostato

verso la forma enolica e questo perchè nel sito attivo dell’enzima Ribulosio-1,5-bifosfato

carbossilasi-ossigenasi, il magnesio, che era coordinato dai 3 amminoacidi, coordina

bene gli ossigeni posti in C2 e C3. Quando lo lega in questo modo, l’idrogeno in

parte) si trova accanto all’ossigeno

posizione C3 (dalla’altra del carbammato della lisina,

è libero (si trova vicino

di cui 1 viene coordinato dal Magnesio mentre l’altro

nel C3). Quindi la sottrazione dell’idrogeno inC3 è favorita perchè

all’idrogeno

è parzialmente negativo e chindi si favorisce la formazione

l’ossigeno enolica. Si ha

in

quindi la protonazione dell’ossigeno C2. permette la successiva

2) Carbossilazione e Idratazione: la formazione dell’endiolo

reazione di carbossilazione e seguente idratazione. Il magnesio coordina anche un

carbonica

ossigeno dell’anidride che deve essere legata al Rb1,5DP. L’anidride

carbonica si trova in una posizione favorevole: il carbonio della CO attacca il C2 e va a

2

legarsi su di esso e questo perchè nella CO i doppietti di non legame sono tutti spostati

2

e quindi

verso l’ossigeno il carbonio sarà un parziale positivo (elettrofilo) e quindi

cercherà un carbonio complementare a lui (neutrofilo, ricco di elettroni). Si ha quindi

della CO

l’accatto su tale carbonio (il C2 in forma chetonica sarebbe stato molto meno

2 e quindi era necessario

neutrofilo per la presenza del doppio legame con l’ossigeno

portare alla forma enolica). Ma perchè si lega proprio in C2 e non in C3, essendo

entrambi degli enoli? Perchè C2 ha il gruppo fosfato più vicino e quindi (essendo

della molecola di Acqua

elettronegativo) la CO si attacca in C2. Segue poi l’addizione

2

in C3 con formazione della forma idratata a 6 atomi di carbonio: 2-carbossi-3-

una CO

chetoarabinitolo-1,5-bisfosfato. Dato che c’è in C3 , questa rende la molecola

2 si rompe in 2

instabile ed ha quindi vita brevissima. Succede quindi che l’intermedio

molecole

3) Rottura del legame tra C2 e C3.

Si formano 2 molecole di Acido-3-fosfoglicerico. I 3 C superiori (reazione in cima) si

il protone e perde

trovano nella forma di carbanione e la parte inferiore perde anch’essa

il gruppo carbossilico ed è questa che lascia per prima il gruppo carbossilico. Quella

rimasta sottoforma di carbanione. Essa forma la seconda molecola di 3 fosfoglicerato (il

cui gruppo carbossilico è formato dalla CO che stava legata al C2 ed è quella che è

2

con attacco del protone

entrata dall’atmosfera) sul doppietto di non legame che si era

preso dalla rottura precedente. Ia rottura del legame C2-C3 è il segnale per il sito attivo

di aprirsi. Il rilascio della seconda molecola lascia il sito aperto e disposto a legare un

altro substrato.

Regolazione della Rubisco: per far avvenire tutto questo processo, la lisina del sito

attivo deve essere carbamilata. La carbamilazione e la decarbamilazione sono spontanee

della rubisco implica un

e dipendono dalle condizioni ambientali. L’attivazione

cambiamento conformazionale di L stabilizzato dal magnesio. In questa forma l’enzima

è attivo. Quando non è carbamilata, il sito attivo non funziona ma può sempre ospitare il

ribulosio ma non lo processa (si chiude su se stesso ma non funziona). La

carbamilazione è favorita dalla luce. La rubisco sta nello stroma. Per far avvenire la

terminale della lisina si devono staccare

carbamilazione: 2 ioni idrogeno dell’ammoniaca

per far avvenire il legame con la CO e la coordinazione col magnesio. Durante la fase

2

luminosa il pH dello stroma aumentava, perchè gli ioni idrogeno erano continuamente

immessi dentro il lume. Quindi la reazione di carbamilazione se posta in ambiente basico

(e quindi libera ioni idrogeno) si sposterà verso destra. La concentrazione di magnesio

durante il giorno trovo una concentrazione di magnesio superiore nello stroma perchè il

trasporto degli elettroni nello schema Z ha portato tutti gli ioni idrogeno dentro il lume e

dell’idrogeno, veniva portato fuori lo ione potassio e lo

per