Fisiologia Vegetale (Prof.ssa Gonnelli)

Fisiologia vegetale

Appunti di Leandro Bruno

Integrazione di discipline (chimica, fisica, matematica, biochimica, botanica, fisiologia) per lo studio di processi che permettono alle piante di vivere, svilupparsi, riprodursi.

Cellula vegetale

• Cloroplasti
• Parete cellulare
• Vacuolo (Il volume è generalmente occupato al 90% dal vacuolo e questo permette un volume minore di citoplasma)

Parete cellulare

Struttura poligonale che delimita e dà forma alla cellula. Le sue funzioni principali sono:

• Supporto strutturale e meccanica
• Resistenza alla pressione di turgore
• Controlla la crescita
• Architettura e forma (la parete è permeata da sostanze idrofile)
• Regolazione della diffusione delle sostanze attraverso l’apoplasto
• Protezione da patogeni e disidratazione ambientale
• Fonte di molecole segnale
• Interazione cellula-cellula

La parete non è continua ma comunica con le altre cellule tramite i plasmodesmi. La composizione è molto eterogenea. La parete è costituita da vari tipi di molecole, quindi è molto eterogenea.

Distinguiamo una fase:

• Microfibrillare costituita da cellulosa, glicosidici per sottrazione di una molecola di acqua. È pensata come una lunga catena con i monomeri legati tra loro. Un glucosio è ruotato di 180 gradi l’uno rispetto agli altri e questo fa sì che entrambi le facce della molecola siano uguali e in questo modo la cellulosa è lineare. In questo modo si organizza in microfibrille. Questo sistema è resistente alla trazione e agli attacchi enzimatici. Nello spazio le molecole sono legate in modo molto ordinato perché ci sono tanti gruppi ossidrilici che possono svolgere legami a idrogeno. In tal modo cementano le varie microfibrille rendendola molto resistente.
• Matrice: le microfibrille di cellulosa si trovano nella matrice. La matrice è costituita da emicellulosa, sostanze pectiche e proteine. Le emicellulose sono costituite da polimeri di zuccheri ramificati (e non lineari come nella cellulosa). Fra le emicellulose abbiamo gli xilani, i glucani, xiloglucani. Sono molecole idrofile (i gruppi OH legano l'acqua). Le pectine sono un gruppo acido: il gruppo carbossilico. Sono polimeri ricchi di polisaccaridi acidi (ci sono monomeri di acido galatturonico). I gruppi carbossilici possono essere associati oppure dissociati (a seconda del pH: se è acido il gruppo carbossilico si dissocia). Quindi questo si aggira a 4,5. Le pectine sono cariche negativamente perché il pH dell’apoplasto è intorno a 4,5. Il fatto di avere il gruppo carbossilico dissociato può permettere ad esso di legarsi ad uno ione positivo. Il calcio (ione bivalente insieme al magnesio) può legarsi rendendo la parete più rigida.

La dinamicità della parete prende il nome di reostasi e dipende da come sono assemblate le pectine con gli ioni bivalenti. Nella parete vi sono degli enzimi che operano un sacco di cose come, per esempio, le HRGPs, ricche di idrossiprolina, che attraverso i loro legami contribuiscono a formare lo scheletro della parete stessa. L’estensina è coinvolta nell’estensione e coinvolta nella difesa dei patogeni. La parete è sintetizzata dalle vescicole, esclusa la cellulosa che invece è sintetizzata sulla parete dall'enzima cellulosa-sintasi che si trova sulla membrana plasmatica. Tutti questi componenti sono assemblati attraverso legami covalenti con sottrazione di una molecola di acqua e tra legami a idrogeno, o tra legami ionici (il calcio monovalente) oppure per interazione idrofobiche. Esiste anche la parete secondaria dove è presente la lignina per la formazione del legno. La lignina dà resistenza a compressione e tensione (costituito da cellule morte) ed è un polimero di natura fenolica con sottrazione di una molecola di acqua.

Tra le varie funzioni della parete bisogna ricordare il trasporto intercellulare dell’acqua e di soluti attraverso le vie:

• Apoplastica: tutto l’insieme delle pareti e degli spazi intercellulari del tessuto può trasportare per semplice diffusione piccole molecole idrofile (zuccheri, proteine ormoni, gas)
• Simplastica: comunicazione del citosol tramite i plasmodesmi con scambio di piccole sostanze (ioni, peptidi, amminoacidi lineari, virus). I plasmodesmi sono soluzioni di continuità del citosol attraversati da reticolo endoplasmatico (funziona tipo filtro).

Plasmalemma

Barriera selettiva che delimita la cellula costituita da lipidi, proteine e zuccheri. I lipidi presenti nella membrana sono i fosfolipidi. Essi sono costituiti da glicerolo esterificato con 2 molecole di acidi grassi e un gruppo fosfato (con perdita di 3 molecole di acqua). In questo caso gli acidi grassi sono di tipo insaturo (caratteristica delle cellule vegetali). Questi grassi insaturi garantiscono la fluidità delle cellule. Vi sono anche i glicolipidi in cui la parte polare è lo zucchero. Sono presenti anche gli steroli (colesterolo che in questo caso si chiamano fitosteroli). Tutte le parti polari sono rivolte verso l’acqua mentre le code idrofobe sono rivolte una verso l’altra.

Le proteine possono essere integrali (sono transmembrana e si legano tramite legami covalenti) o periferiche (cioè si legano con legami deboli ai fosfolipidi). Le proteine hanno un orientamento caratteristico (i fotosistemi funzionano solo e soltanto se si trovano in una determinata posizione), che ne pregiudica la funzione della proteina stessa. La posizione è garantita dalla presenza delle doppie eliche transmembrana e da inserzioni di polisaccaridi. Le membrane biologiche hanno una permeabilità selettiva alle differenti molecole; le molecole di natura lipidica passano direttamente le membrane mentre le molecole idrofile hanno bisogno di trasportatore:

• Diffusione semplice: ossigeno, anidride carbonica, azoto, benzene (idrofobe lipofile), piccole molecole polari non cariche (acqua, glicerolo, etanolo). Gli ioni richiedono la presenza di canali
• Diffusione facilitata: amminoacidi, zuccheri e nucleoridi non passano e richiedono la presenza di trasportatori detti carriers

Una membrana riesce a scambiare quello che la cellula desidera solo se ai due lati della membrana esiste una differenza di potenziale (altrimenti non funzionano). La differenza di potenziale è generata dalla distribuzione asimmetrica (poco dentro la cellula e molto fuori dalla cellula o viceversa) di una molecola con carica elettrica. Per calcolare la differenza di potenziale e il potenziale di membrana abbiamo bisogno di 2 cose:

Potenziale chimico dei soluti

Esso (energia (Joule/mole)) di qualsiasi soluto "i" è definito dalla seguente formula:

*E_i = E_i + RTlnC_i + zFE_i

• RTlnC_i = componente della concentrazione del soluto
• ZFE_i = componente della carica elettrica del soluto

Il potenziale chimico quindi dipenderà da questi 2 fattori: concentrazione e carica. Come il potenziale chimico influenza il movimento netto di una molecola? Il movimento va da un potenziale chimico maggiore a un potenziale chimico minore. Se la specie è neutra sarà solo il gradiente di concentrazione (diversa concentrazione ai 2 lati) a influire sul passaggio delle molecole. All'equilibrio i due flussi (sostanza in A passa in B) sono uguali (B va in A) e essendo questi proporzionali alle forze motrici, saranno uguali anche i potenziali. Se eguagliamo i potenziali chimici di A e B otteniamo l'equazione di Nerst.

Equazione di Nerst

E_i^A - E_i^B = (RT/zF) x ln(C_B/C_A)

C’è quindi una proporzionalità tra la differenza di potenziale e di concentrazione. All’equilibrio la differenza di concentrazione di uno ione fra i due scomparti è bilanciata dalla differenza di voltaggio fra gli scomparti stessi. La distribuzione di una sostanza dipenderà quindi dal suo gradiente di concentrazione e dalla differenza di potenziale ai capi della membrana. Nelle piante la differenza di potenziale è data dallo ione H⁺ (NON C'È POMPA SODIO/POTASSIO), quindi l’Equazione di Nerst a condizioni standard sarà:

ΔE = 59 log(H^+o/H⁺ⁱ) = 59 ΔpH

Se c’è una distribuzione asimmetrica del protone fra interno ed esterno c’è qualcuno che fa il lavoro e questo qualcuno è la proteina H⁺-ATPasi: questa, scindendo ATP, sposta controgradiente gli ioni idrogeno fuori dalla cellula (il quale tende a tornare all’interno). Si trova sul plasmalemma e riesce a creare una differenza di potenziale di -120 mV (interno negativo ed esterno positivo).

H⁺-ATPasi ha un sito di affinità per il protone in cui ci si lega. Utilizza l’ATP e si autofosforila, cioè utilizza un fosfato dall’ATP che diventa ADP. Questo porta a un cambiamento conformazionale che porta al rilascio dell’idrogeno fuori dalla cellula (non è più affine). Dopodiché, la proteina idrolizza il proprio fosfato (fosfatasi) e lo rilascia tornando alla conformazione iniziale.

La pompa protonica è costituita da 5 domini:

• N: che funge da chinasi su se stessa (quindi lega l’ATP al sito P e lo scinde in ADP, che viene rilasciato, e gruppo fosfato che si lega al dominio P)
• P: ha attività di fosfatasi cioè rimuove il gruppo fosfato da se stessa per tornare allo stato conformazionale iniziale (lo lega nel primo stato conformazionale prima di legarsi con ATP)
• M: sito di legame dello ione idrogeno
• A: permette l’ingresso (questo è chiuso quando lo ione idrogeno deve essere rilasciato all’esterno)
• R: sito regolatore che, se fosforilato da una chinasi, permette la funzione della proteina, altrimenti rimane attaccato alla proteina inibendola (la proteina è chiusa su se stessa)

H⁺-ATPasi si trova anche sulla membrana del tonoplasto (la V) detta H⁺-PPasi in quanto utilizza il pirofosfato scindendolo in fosfato inorganico come fonte di energia per svolgere la sua funzione che è quella di portare gli ioni idrogeno dentro il vacuolo generando una differenza di potenziale di -90 mV (2 per ogni PPi e non uno per ogni ATP come nel caso dell’H⁺-ATPasi della membrana plasmatica).

A livello di mitocondri e nei plastidi vi sono le ATPsintasi, che utilizzano i protoni per sintetizzare ATP. H⁺-PPasi è una proteina dimerica che ad ogni ciclo scambiano 2 protoni. Allo stato di partenza vi sono vari amminoacidi negativi. Quando arriva il pirofosfato e il primo protone, il secondo protone si lega a 2 residui di aspartato e in questo modo cominciano a disassemblarsi le attrazioni tra i residui positivi e H⁺. L’idrogeno legato al glutammato viene espulso perché esso viene coordinato dalla carica positiva della lisina. Il protone legato al primo aspartato passa all’aspartato precedente che è coordinato da un'arginina. Tutto questo grazie al glutammato e il ciclo si ripete (all’idrolisi del pirofosfato il fosfato non si sa ancora dove si lega).

Nelle cellule vegetali vi sono altre ATPasi tra cui quella del calcio (sia sul plasmalemma sia sul vacuolo). Queste hanno il compito di portare fuori il calcio oppure portarlo all’interno del vacuolo con utilizzo di ATP e questo perché il calcio risulta molto tossico perché può precipitare sotto forma di fosfato di calcio e togliere il fosfato libero alla cellula è pericoloso perché è coinvolto nella sintesi dell’ATP.

La presenza quindi di vari tipi di pompe permette il trasporto di membrana e può essere di tipo passivo, secondo il gradiente di concentrazione (segue la legge di Fick) in cui la velocità di trasporto dipende dal gradiente di concentrazione della sostanza fra i 2 punti. Poi abbiamo la diffusione facilitata che segue la legge di Fick ma in questo caso vi sono i trasportatori che facilitano il trasporto (carrier, canali). Il trasporto passivo è molto minimo rispetto a quello attivo che va controgradiente di concentrazione con spesa di ATP. Se queste lo scindono in modo diretto si chiama trasporto attivo primario, mentre il secondario utilizza ATP in modo indiretto: le molecole che devono passare utilizzano il gradiente di concentrazione della sostanza che è passata per trasporto attivo primario.

Il trasporto attivo secondario può essere effettuato da canali (proteine transmembrana) che permettono il trasporto di molecole cariche! (solo loro) secondo il loro gradiente elettrochimico. Possono essere sempre aperti oppure possono essere regolati da meccanismi di fosforilazione o cambiamenti di voltaggio. Il canale è un poro selettivo che lega un determinato ione per lasciarlo passare. I carriers trasportano molecole non cariche secondo gradiente o controgradiente attraverso delle pompe (spesa diretta di energia) o attraverso i meccanismi di simporto e antiporto (spesa indiretta di energia). In questo sistema una molecola si muove controgradiente (trasporto attivo secondario) mentre un’altra secondogradiente.

Traducendo il tutto nella cellula vegetale

H⁺-ATPasi porta fuori gli ioni idrogeno controgradiente (con spesa diretta di ATP trasporto attivo primario). Questo genera una differenza di potenziale che provoca il movimento di molecole cariche attraverso i canali (i cationi entrano (K⁺) in quanto l’interno cellulare è negativo e gli anioni escono) e di conseguenza il trasporto di molecole neutre attraverso gli antiporti o i simporti con le cariche stesse. Nel tonoplasto succede la stessa cosa ma in modo inverso. La cinetica del trasporto di carriers segue la cinetica enzimatica. Il trasporto di tutti questi scambi di ioni idrogeno fuori dalla cellula porta a variazioni di pH che il citosol non può sopportare; la cellula quindi ha creato un sistema di tamponamento del pH in cui l’acido fosfoenolpiruvico viene carbossilato ad acido ossalacetico che poi viene ridotto dal NADH trasformandosi in acido malico che poi rilascia 2 ioni idrogeno nel citosol. La fosfoenolpiruvato carbossilasi e la malato-deidrogenasi si attivano solo se il pH del citosol si alza in risposta all’uscita degli ioni H⁺. Il pH viene mantenuto a 7.0-7.5.

Potenziale idrico

È il potenziale chimico dell’acqua nella pianta che si differenzia nelle varie parti della stessa e determina il movimento dell’acqua nelle varie parti della pianta (compresa l’atmosfera).

Se prendiamo 2 compartimenti contenenti una soluzione dove la concentrazione di soluto è maggiore in B rispetto ad A, il potenziale chimico dell’acqua pura è zero (non di più); quindi essendoci un potenziale chimico di acqua maggiore in B, essa si sposta da A a B fino ad avere una condizione di equilibrio dinamico data da 2 fattori: la concentrazione dell’acqua e la pressione. Via via che la soluzione B aumenta di volume, vi è una pressione che si oppone al passaggio dell’acqua. Se B è più concentrato ma io voglio impedire il passaggio di acqua da A a B devo esercitare una pressione a B che è uguale al potenziale osmotico della soluzione. Esso è generato dalla forza con cui l’acqua lega un soluto e dipenderà dalla concentrazione molare del soluto, dal coefficiente di Van’t Hoff (numero di atomi), per R e per T. Se ci applichiamo una pressione uguale ma di segno opposto al potenziale osmotico non si ha il passaggio di acqua. Tale pressione (di segno positivo) è detta pressione osmotica. Dato che le membrane cellulari hanno permeabilità selettiva e scelgono cosa far passare avremo una concentrazione di soluti diversa da quella dell’apoplasto e questo genererà il movimento dell’acqua per differenza di concentrazione tra l’interno e l’esterno (questa differenza è mantenuta dall’H⁺-ATPasi).

Nel caso di una cellula vegetale il movimento dell’acqua attraverso la membrana dipende da 2 cose:

• Gradiente di concentrazione dell’acqua (inversamente proporzionale a quello dei soluti)
• Gradiente di pressione (dovuto alla presenza della parete)

Questi 2 fattori si combinano per dare il potenziale idrico dell’acqua e i movimenti dell’acqua stessa.

Ψ = Ψ^* + f(conc) + f(press)

• Ψ = potenziale idrico
• Ψ^* = potenziale idrico a condizioni standard che per l’acqua pura è uguale a zero per convenzione (lo eliminiamo)

Il potenziale idrico si misura in megapascal (MPa). L’atmosfera ha 0,1 MPa di pressione. Gli altri 2 fattori che determinano la natura del potenziale idrico sono il fattore concentrazione (concentrazione dell’acqua - ragionando in termini di concentrazione dei soluti che ovviamente sono inversamente proporzionali) e anche il fattore pressione (per la presenza della parete). Il fattore concentrazione rappresenta l’effetto della concentrazione dell’acqua: cioè se la concentrazione dell’acqua aumenta, Ψ va verso lo zero (verso valori positivi). Ma abbiamo appena detto che non andiamo a misurare la concentrazione dell’acqua ma quella dei soluti in essa disciolti (che quindi saranno inversamente proporzionali ad essa). Quindi più questi aumentano, più fanno abbassare Ψ (lo portano verso valori negativi) e quindi il fattore concentrazione non è altro che il valore della pressione osmotica. Il fattore pressione è rappresentato dalla pressione esercitata dalla parete sul potenziale idrico. Se questa preme lo riporterà verso lo zero (esclusiva dei vegetali). La parete si oppone quindi all’entrata dell’acqua generando la pressione di turgore.