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Fisiologia Generale, appunti su trasporti di membrana, trasporto epiteliale, sistema nervoso centrale e periferico, fisiologia del muscolo

Appunti di fisiologia generale su trasporti di membrana, trasporto epiteliale, sistema nervoso centrale e periferico, fisiologia del muscolo basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Lionetto dell’università degli Studi del Salento - Unisalento. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Fisiologia generale docente Prof. M. Lionetto

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Omeostasi .

Nel 1929 Walter Cannon coniò il termine omeostasi (ossia la tendenza dell’organismo a mantenere

lo stato stazionario).

In particolare definiamo omeostasi la capacità di un organismo di mantenere condizioni costanti

del proprio ambiente interno rispetto alle variazioni dell’ambiente esterno. L’omeostasi richiede

una spesa energetica all’organismo. Grazie ai processi omeostatici eventuali variazioni dei

parametri interni vengono prontamente rilevate e vengono prontamente attuate opportune azioni

compensatorie.

Omeostasi cellulari: ioni, pH, acqua, glucosio, potenziale di membrana.

Omeostasi sistemiche:

• regolazione della temperatura corporea

• regolazione concentrazione di acqua e soluti

• regolazione della concentrazione di O2nel sangue

• regolazione della concentrazione ematica di glucosio

• regolazione della concentrazione ematica di calcio

Affinché possa realizzarsi omeostasi è necessario ci siano centri di controllo che possano

comunicare con le varie parti del sistema.

Ad esempio la temperatura corporea è regolata a 37 gradi. Se ci sono discostamenti da questo

valore, il sistema di controllo rappresentato dall’ipotalamo riceve informazioni dai tessuti periferici

e invia segnali agli organi effettori (ad esempio le ghiandole) per ripristinare la condizione iniziale.

Il controllo può essere a livello locale o a livello sistemico, cioè a livello di più parti distanti

nell’organismo collegate dal sistema nervoso ed endocrino.

Proprietà dei processi omeostatici.

Indipendentemente dal particolare meccanismo di regolazione, ogni forma di omeostasi presenta

le proprietà di un sistema a retroazione negativa (o feedback negativo).

La retroazione (o feedback) negativa si verifica quando influenze esterne fanno variare lo stato

normale o desiderato di un sistema e i meccanismi interni di risposta agiscono in modo da

ripristinare lo stato normale.

La risposta allo stimolo iniziale, attraverso l’azione del sistema di controllo e del sistema effettore,

porta ad un cambiamento nello stato interno del sistema. Tale cambiamento agisce a monte sul

sistema tendendo ad annullare l’effetto dello stimolo iniziale (feed-backnegativo).

Gli elementi essenziali di un sistema di retroazione negativa sono: n sensore, come ad

- Un meccanismo di rivelazione dello stato interno dell’organismo, e cioè u

esempio i termo recettori. Se osserviamo una variazione della temperatura il termo

recettore si attiva perché ad esempio percepisce il freddo ed invia questo segnale al

cervello attraverso l’ipotalamo alla nostra corteccia. istema

- Un sistema di controllo che confronti lo stato interno effettivo con lo stato desiderato: un s

di controllo è rappresentato dall’ipotalamo che attiva il brivido, dà il comando ai muscoli di

contrarsi per produrre calore. Anche la vasocostrizione serve per mantenere il calore

all’interno ed evitarne la dissipazione. La ghiandola tiroide interviene per aumentare il

metabolismo basale per bruciare di più.

- Un effettore che consenta di variare lo stato interno del sistema al fine di raggiungere lo stato

in modo tale che non ci sia una differenza tra la temperatura di set point e la

desiderato

temperatura reale. 04/10/17, seconda lezione

Le membrane cellulari.

La sopravvivenza della cellula dipende dagli scambi che avvengono a livello della membrana

plasmatica con l'ambiente circostante; la membrana plasmatica costituisce un elemento

strutturale fondamentale per comprendere le funzioni della cellula stessa.

Un altro importante principio della fisiologia è il legame struttura – funzione: la funzione è

condizionata dalla struttura.

Le cellule possono avere forme e dimensioni diverse, ma TUTTE sono accomunate dall'avere una

membrana plasmatica essenziale per la sua sopravvivenza e la sua integrità; una lesione a livello

della membrana porterebbe alla fuoriuscita del materiale citoplasmatico e di conseguenza alla

morte cellulare.

La membrana plasmatica in termini di spessore si misura in nanometri. Siamo nell'ordine di 100

angstrom.

Al microscopio elettronico la membrana appare con un profilo scuro chiaro scuro. Questo sottile

profilo non è altro che l'espressione della struttura della membrana stessa. Il modello di

membrana introdotto di Singer e Nicholson è quello del mosaico fluido ed è quello più accreditato.

Secondo questo modello, la membrana plasmatica è formata da un bilayer fosfolipidico, cioè un

doppio strato di fosfolipidi; questi ultimi sono dei lipidi che hanno un paio di code idrofobe rivolte

verso l'interno e teste polari idrofile.

Nel bilayer fosfolipidico osserviamo molecole di colesterolo che si inseriscono come se fossero

delle forcine tra i fosfolipidi di membrana. Inoltre ci sono proteine che possono attraversare la

membrana che possono essere intrinseche o estrinseche. Fuoriescono dalla membrana catena

carboniose di carboidrati che possono legarsi sia ai protidi che ai lipidi e questi servono per il

riconoscimento di elementi extracellulari.

Elementi costitutivi della tela fosfolipidica.

La tela fosfolipidica è formata da fosfolipidi costituiti da:

• testa polare idrofila formata da glicerolo legato ad un fosfato che si lega a sua volta alla colina. Si

ottiene in questo caso la fosfatidilcolina; si potrebbe ottenere anche fosfatidilserina o

fosfatidiletanolammina se si cambiassero le basi legate al fosfato.

• Le code idrofobe sono formate da acidi grassi. Sono dette catene aciliche perché hanno una

ripetizione di CH2.

In base alla geometria dei legami carbonio - carbonio, possiamo avere una catena dritta o ripiegata

a gomito (legami semplici o doppi). I fosfolipidi della membrana cellulare si dispongono in

doppio strato con le terminazioni idrocarburiche

rivolte all’interno e quelle polari verso le fasi acquose

(foglietto bimolecolare a doppio strato lipidico). Ciò

accade perché le code idrofobe evitano il contatto

dell'acqua per via della presenza di una repulsione; ne

deriva che la struttura tridimensionale più stabile è

quella del doppio foglietto.

Possiamo trovare fosfolipidi in acqua sia sotto forma di micelle che di foglietto.

Le membrane biologiche contengono colesterolo. Il colesterolo contribuisce a

determinare la struttura della

membrane plasmatica

intercalandosi tra le molecole

dei fosfolipidi. Il nucleo

steroideo del colesterolo ha una

struttura planare relativamente

rigida, che è in contatto con i

gruppi -CH2 prossimali (C1-C10)

delle catene alifatiche dei fosfolipidi, mentre il suo gruppo idrossilico in posizione 3 è in contatto

con il mezzo acquose extracellulare in prossimità delle teste polari dei fosfolipidi.

.

Lipidi di membrana e fluidità

Normalmente i lipidi di membrana esistono in uno stato “cristallino liquido”, cioè intermedio tra

una struttura altamente fluida e una abbastanza rigida, tale da garantire una viscosità della

membrana che consenta il funzionamento ottimale della componente proteica di membrana

(enzimi, proteine di trasporto, recettori, ecc).

La fluidità della membrana è essenziale affinché essa possa svolgere le sue funzioni. Le proteine di

trasporto presenti in essa sono spesso soggette a cambi conformazionali per consentire appunto il

trasporto di sostanze all'interno. Ma il cambio conformazionale della proteina deve essere anche

consentito da un adeguato microambiente lipidico.

Quindi, qualora la membrana plasmatica risultasse poco o troppo fluida, porterebbe ad uno scarso

ripiegamento delle proteine di trasporto ed inficiare il trasporto stesso.

I fattori che influenzano la fluidità della membrana sono:

- Temperatura. È il fattore più importante. È un indice dello stato di agitazione termica di un

corpo. Un aumento della temperatura si associa ad un aumento dei movimenti vibrazionali

e quindi della fluidità della membrana. Un suo abbassamento alla riduzione dei movimenti

vibrazionali e quindi si riduce la fluidità di membrana.

- Colesterolo. In genere l'aumento della quantità di colesterolo si associa alla riduzione della

fluidità di membrana in conseguenza alla sua struttura rigida.

- Insaturazione acidi grassi aumenta la fluidità di membrana perché il doppio legame crea

un gomito nella molecola andando a turbare la struttura ordinata cristallina delle catene di

acido grasso. Aumenta l’entropia e il disordine della membrana plasmatica stessa

facendone aumentare la fluidità.

- Lunghezza catene aciliche. Maggiore è la lunghezza delle catene aciliche, minore è la

fluidità di membrana poiché esse tendono a creare un maggiore impacchettamento.

- Le proteine anche diminuiscono la fluidità di membrana. Infatti, la fluidità di membrana

dipende essenzialmente dal contenuto in fosfolipidi e non da quello proteico.

Il passaggio dallo stato paracristallino allo stato fluido per effetto termico determina il

movimento delle catene idrocarburiche del fosfolipide e la diffusione laterale nel piano

del bilaterali. La diffusione da un monolayer all’altro di un fosfolipide “ flip flop “ è accelerato

dall’enzima flippasi. Ciò richiede un consumo di energia.

La distribuzione dei fosfolipidi e dei glicolipidi nel doppio strato lipidico è

asimmetrica. Si ritiene che il colesterolo sia distribuito in modo quasi uguale nei due monostrati.

Membrane cellulari: la componente fosfolipidica.

Analizzando la componente fosfolipidica nei due foglietti della membrana plasmatica, si nota che

la sfingomielina e la fosfatidilcolina si trovano principalmente a livello del foglietto esterno anziché

a livello di quello interno. La fosfatidilcolina è distribuita invece prevalentemente all'interno, così

come anche la fosfatidilserina.

Ruolo dei glicolipidi.

I glicolipidi sono fosfolipidi che hanno attaccato sulla porzione esterna catene carboidratiche.

Questi si trovano solo nel foglietto esterno perché le catene carboidratiche sono importanti nei

processi di riconoscimento cellulari con la matrice extracellulare e con eventuali ligandi.

Uno dei glicolipidi più diffusi è il galattocerebroside che entra nella composizione delle membrane

mieliniche; il ganglioside GM1 è anch'esso molto abbondante a livello delle membrane del SNC:

presenta tante molecole di galattosio ed una molecola di acido sialico.

Questi glicolipidi facilitano l’isolamento elettrico nella membrana mielinica e, nel caso dell'acido

sialico, questo protegge la membrana da condizioni estreme (basso pH, enzimi degradativi) grazie

alla presenza di una carica negativa che respinge tutto ciò che potrebbe attaccare la membrana

plasmatica.

Esso è presente anche a livello dei globuli rossi ed impedisce che essi si addensino anche laddove

ci siano capillari troppo stretti.

Le membrane cellulari hanno differente composizione in base alla funzione che devono svolgere.

Ad esempio nel caso della mielina la componente lipidica è maggiore rispetto a quella glucidica o

proteica perché svolge una funzione isolante a livello del sistema nervoso.

Le proteine di membrana possono essere intrinseche cioè attraversano da parte a parte il bilayer

fosfolipidico oppure possono essere periferiche, cioè ancorate solo ad un foglietto e protrudere

verso una sola estremità: citoplasmatica o extracellulare.

Nel caso A e nel caso B le proteine attraversano solo un

lato del doppio strato e il resto si estende o

nell'ambiente intra o extracellulare. Nel caso C la

proteina attraversa il doppio strato da parte a parte e si

inserisce anche in uno dei due strati fosfolipidici. Nel

caso D abbiamo due proteine: una integrale di

membrana (attraversa completamente il doppio strato) e

l'altra che interagisce non covalentemente con la prima

formando un complesso proteico. Nel caso E la proteina

attraversa più volte il bilayer fosfolipidico.

05/10/17, terza lezione

I diversi casi dell'interazione di una proteina con il bilayer fosfolipidico.

L’attraversamento delle proteine integrali di membrana attraverso il doppio strato fosfolipidico da

parte a parte avviene tramite un’alfa elica che viene graficamente rappresentata da un cilindro.

Esistono casi in cui la proteina presenta un solo attraversamento. La stessa proteina nel secondo

caso attraversa 7 volte il doppio strato (si dice che è una proteina a 7 domini transmembrana): le

anse sono localizzate nel citoplasma, l'estremità amminica nel lato extracellulare, quella carbossi-

terminale nel lato intracellulare.

L’attraversamento di una proteina integrale di membrana può avvenire non solo tramite alfa elica,

ma anche con foglietti beta.

Ci sono anche proteine adese alle superficie della membrana oppure proteine che si estendono

prevalentemente nella parte extracellulare.

Esistono programmi che consentono di esprimere con modelli quello che è il comportamento della

proteina attraverso il bilayer fosfolipidico.

Cosa vuol dire? Prendiamo in considerazione la glicoforina.

La glicoforina è una proteina integrale di membrana caratteristica dei globuli rossi: essa presenta

un solo attraversamento a livello del bilayer.

Una porzione protrude dal lato intracellulare, l’altra porzione dal lato extracellulare.

Questa proteina serve a rivestire i globuli rossi di carica negativa grazie alla presenza di acido

sialico legato alla catena amminoacidica impedendo ai globuli rossi di addensarsi tra loro,

essenziale per lo scorrimento dell'emazie nel circolo sanguigno.

Ad ogni amminoacido (aa) può essere associato un indice di idrofobia, cioè la sua affinità per un

ambiente acquoso o oleoso. Esistono aa più idrofobi (che tendono a respingere l'interazione con

l'acqua) o altri più idrofili (che cercano l'interazione con l'acqua).

Leucina isoleucina e valina sono 3 aa che hanno un elevato indice di idrofobia. Asparagina e acido

glutammico sono 2 aa che hanno un basso indice di idrofobia.

Esistono, quindi, modelli matematici che analizzando la sequenza di aa possono risalire ad un

indice di idrofobia medio: di conseguenza, si può anche stabilire quali segmenti attraversano il

doppio strato (quelli idrofobi) e quali invece si trovano nell'ambiente citoplasmatico o

extracellulare (idrofili).

I picchi negativi nel grafico corrispondono agli aa idrofili (basso indice di idrofobia), quelli positivi

agli aa idrofobi (alto indice di idrofobia).

Nel caso specifico della glicoforina, si ottiene un solo picco di positività: ciò vuol dire che questo

rappresenta il segmento di aa che attraversa il bilayer.

Le proteine della membrana interagiscono con il citoscheletro.

Alcune proteine integrali di membrana interagiscono con il citoscheletro; esso tiene la membrana

plasmatica attraverso l’aggancio con le proteine stesse.

Nei globuli rossi questi agganci sono stati ampiamente studiati poiché essi sono cellule molto

semplici, data l'assenza di nucleo e senza molti organuli.

Il globulo rosso ha una forma di disco schiacciato proprio a causa degli elementi citoscheletrici che,

ancorandosi alla membrana, ne determinano la sua conformazione.

Le proteine possono diffondere lateralmente nel doppio strato (che gode di una certa fluidità) e

ciò consente loro di potersi muovere nel bilayer fosfolipidico.

Ciò è stato dimostrato con un esperimento.

Sono state fuse tra loro cellule provenienti da due organismi diversi: una cellula umana e una

cellula di topo (cellula murina). Gli antigeni della cellula murina sono diversi dagli antigeni della

cellula umana.

Le due cellule vengono fuse e si ottiene una nuova cellula detta chimera.

La chimera è stata trattata con anticorpi fluorescenti diversi: infatti, gli anticorpi che riconoscono

gli antigeni della superficie umana sono diversi da quelli che riconoscono gli antigeni della cellula

murina. Le proteine di membrana umana e murine all’inizio sono separata, poi il marcaggio tende

ad assumere un aspetto casuale.

Ciò dimostra che le proteine possono muoversi liberamente nel bilayer.

Non sempre però queste proteine possono muoversi in maniera incondizionata. A volte questo

movimento non avviene affatto, come nel caso delle cellule epiteliali che svolgono la funzione di

barriera tra ambiente esterno e interno.

Le cellule epiteliali sono tenute insieme dalle giunzioni tight, una sorta di cerniere che

impediscono la diffusione delle proteine su tutta la membrana tra la zona apicale e quella

basolaterale. Questo è importante per mantenere la polarità strutturale e funzionale della cellula

epiteliale.

I microdomini raft sono regioni in cui predominano alcuni lipidi ed in cui il movimento delle

proteine è molto limitato, se non del tutto assente. Raft vuol dire zattera: queste sono zone

specializzate della membrana che presentano un'elevata concentrazione di colesterolo che porta

ad un elevato impacchettamento delle porzioni del bilayer.

Nelle "zattere" a volte abbiamo una concentrazione di proteine di membrana che possono essere

recettori o trasportatori. Sono legati insieme colesterolo e proteine a formare queste zattere.

Questi domini sono coinvolti in processi di segnalazione del segnale o trasduzione del segnale.

L’intero processo si basa sulla sequenza ordinata di eventi che richiedono l'attività coordinata di

più proteine; il processo risulta essere più funzionale e veloce se queste proteine sono messe

vicine tra loro.

In alcune zone della membrana, esistono delle regioni, le caveole (invaginazioni delle membrane

plasmatiche) caratterizzate dalla presenza di proteine denominate caveoline.

Si ritiene che le caveole siano implicate nel processo di endocitosi.

Tra le proteine integrali di membrana coinvolte nell’interazione tra cellule o con elementi del

sistema immunitario abbiamo:

- Le integrine, formate da due subunità alfa e beta: a livello della subunità alfa si legano gli ioni

calcio importanti nell'adesione cellulare.

- La caderina, la cui porzione che protrude all’esterno e lega 4 ioni calcio.

- Le proteine N CAM, che hanno una struttura a serpentello simile alle immunoglobuline in cui i

ponti disolfuro contribuiscono a legarsi a diverse zone della membrana.

- Le selectine, che legano uno ione calcio e legano anche catene carboidratiche della cellula

adiacente.

Aspetto funzionale delle proteine di membrana.

Le proteine di membrana possono essere:

- proteine strutturali: esse si ancorano al citoscheletro.

- Enzimi;

- Recettori: riconoscono segnali extracellulari per poi trasdurli nella cellula.

- Canali e trasportatori: un gruppo molto cospicuo che mediano il trasporto di ioni e soluti

attraverso la membrana.

Riassumendo:

Funzioni svolte della membrana plasmatica.

Funzione contenitiva: impedisce ai contenuti cellulari di mescolarsi con i componenti

dell’ambiente esterno.

Funzione biochimica: offre sulla sua superficie interna ed esterna siti di trasporto per enzimi che

così possono lavorare in modo ordinato e sequenziale.

Funzione fisiologica di barriera selettiva: seleziona e controlla il transito di diverse molecole e ioni

tra esterno ed interno.

Funzione fisiologica di comunicazione: presenta sulla superficie recettori per segnali chimici e

marcatori per farsi conoscere dalle cellule vicine.

I trasporti attraverso le membrane biologiche.

Il movimento di piccoli soluti attraverso le membrane può avvenire mediante diverse modalità di

trasporto. In base alla modalità di attraversamento del bilayer fosfolipidico si distinguono 2

categorie generali di trasporto:

- Diffusione semplice

- Trasporto carrier mediato.

In base alla richiesta energetica del trasporto si distinguono 2 categorie generali di trasporto:

- Trasporti passivi: sono quei fenomeni di trasporto in cui la cellula non fornisce energia alla

molecola che permeano in quanto le molecole si muovono secondo il loro gradiente di

concentrazione. I trasporti passivi sono spontanei ed equilibranti in quanto le molecole

rendono a distribuirsi uniformemente nei due ambienti separati dalla membrana.

- Trasporti attivi: sono quei fenomeni di trasporti in cui l’organismo spende energia

metabolica per far avvenire il a passaggio in quanto la sostanza si muove contro gradiente

di concentrazione. I trasporti attivi sono disequilibranti, perché le particelle vengono

accumulate da un lato e non sono spontanei in quanto richiedono energia dall’esterno.

Trasporti passivi.

Il trasporto passivo attraverso la membrana può avvenire attraverso tre modalità basilari a

seconda delle caratteristiche molecolari della sostanza da trasportare:

- Diffusione semplice attraverso lo spessore della membrana: la sostanza passa

direttamente attraverso il doppio strato fosfolipidico.

- Diffusione attraverso canali acquosi :costituito da proteine integrali di membrana che

organizzate in subunita attraversano da parte a parte la membrana determinando pori

proteici attraverso di essa.

- Trasporto facilitato, secondo cui la molecola da trasportare si combina con una proteina

carrier che ne facilita il passaggio attraverso la membrana.

Diffusione semplice.

In questo tipo di trasporto le molecole attraversano le membrane biologiche semplicemente

diffondendo tra le molecole costitutive della membrana stessa (trasporto passivo non mediato).

Molecole che utilizzano questo meccanismo di trasporto sono:

- Alcuni gas come ossigeno, anidride carbonica.

- Molecole liposolubili (cioè sostanze che si sciolgono nei lipidi) come vitamina A, D, E, K,

ormoni steroidei.

- Piccole molecole idrosolubili prive di carica con peso molecolare inferiore a 100 120

daltons (etanolo).

Sono escluse glucosio, amminoacidi e ioni.

Le sostanze, in base alla loro natura chimica, possono avere affinità per la fase acquosa o per fasi

oleosa. Per capire per quali delle due fasi una sostanza ha maggiore affinità, si fa un esperimento

mettendo in una beuta per metà acqua e per metà ottanolo (che costituiscono una fase acquosa

ed una oleosa immiscibili). Si introduce poi nella beuta la sostanza di interesse, si agita, si aspetta

un po' di tempo e poi si misura la concentrazione della sostanza in fase acquosa e in fase ottanolo.

Se il rapporto tra le due concentrazioni è pari ad 1, vuol dire che la sostanza di mio interesse avrà

un uguale propensione a sciogliersi nelle due fasi.

Se il rapporto è maggiore di 1, vuol dire che la sostanza è più affine per la fase non acquosa, quindi

la sostanza è idrofoba.

Se il rapporto è minore, la sostanza è idrofila perché la sua concentrazione è maggiore nella fase

acquosa.

La diffusione si verifica quando tra due regioni di una soluzione esiste una differenza di

concentrazione. In tal caso si ha un flusso di particelle dalle regioni a concentrazione maggiore

verso quelle a concentrazione minore, finché le particelle non siano distribuite in modo omogeneo

in tutto lo spazio disponibile.

Esempio: una zolletta di zucchero o una goccia di colorante che si scioglie in un bicchiere d’acqua.

Pertanto la diffusione è il processo fisico attraverso il quale molecole in soluzione o in sospensione

dotate di moto casuale termico (moto browniano) si disperdono da regioni a concentrazione più

elevate a regioni a concentrazione più bassa fino ad annullare le differenze di concentrazione tra

le due parti dello stesso ambiente. La diffusione è un processo causato dall’agitazione termica

della materia. 10/10/17, quarta lezione

Leggi fisiche che regolano la diffusione.

Se immaginiamo di porre una soluzione di saccarosio nella metà di un recipiente, separata con un

setto dall’altra metà piena di acqua, e successivamente di togliere il setto, il processo diffusivo

immediatamente ha inizio. Un certo numero di molecole passa casualmente per effetto

dell’agitazione termica casualmente nel compartimento 2. Con il passare del tempo la probabilità

del passaggio da 1 a 2 diminuisce e aumenta la probabilità di un passaggio di molecole con

movimenti browniani da 2 a 1 fino a quando le molecole risulteranno distribuite uniformemente in

tutto il recipiente. I due flussi diverranno uguali. In un sistema di assi

cartesiano notiamo

che la concentrazione

nell’ambiente 1

continua a diminuire

esponenzialmente e

parallelamente quella

nell’ambiente 2

continua ad

aumentare con

andamento esponenziale fino al raggiungimento dell’uniformità di concentrazione con

l’annullamento della differenza di concentrazione. Si quantifica il fenomeno della

diffusione della prima legge di

Fick con la seguente relazione:

Dn/dt= -AD dc/dx

ossia se esiste un gradiente di

concentrazione per ogni tratto

infinitesimo dx ci sarà una

caduta infinitesima di

concentrazione dc che dà

luogo al flusso infinitesimo dn/dt .

Il flusso è tanto maggiore:

- quanto maggiore è l'area (A) della sezione attraverso cui esso si verifica: potranno passare un

maggior numero di molecole;

- quanto maggiore è la diffusibilità delle molecole, espressa dal coefficiente di diffusione (D).

Pertanto, il flusso è direttamente e linearmente proporzionale al gradiente di concentrazione. Il

flusso è anche direttamente proporzionale alla superficie

Il segno “-” indica che il flusso procede dalla zona a concentrazione maggiore verso quella a

concentrazione minore. Volendo esprimere la prima legge di Fick in una forma non infinitesimale,

integrando l’equazione differenziale otteniamo:

F = D(C1-C2)

dove F è il flusso espresso in moli che diffondono al minuto per unità di superficie.

La prima legge di Fick non è altro che la legge di Torelli (legge generale che spiega qualsiasi flusso)

riarrangiata in modo da esplicitare la «forza» (driving force) come una differenza di

concentrazione.

Il flusso sarà proporzionale alla forza che lo genera (in questo caso il gradiente di concentrazione)

per il coefficiente di proporzionalità. La costante di proporzionalità è nel caso della legge di Fick il

coefficiente di diffusione.

Cos è il coefficiente di diffusione?

Il coefficiente di diffusione D della molecola in esame dipende dalle caratteristiche fisico chimiche

della sostanza che diffonde ed inoltre dalla viscosità del mezzo in cui avviene la diffusione. Esso

tiene conto sia dell’energia cinetica delle molecole sia degli attriti che esse incontrano

muovendosi.

Dimensionalmente [D] = [cm]2 [sec]-1, una sorta di superficie che si muove nel tempo.

Il coefficiente di diffusione è pari a: D = RT/Nf

dove R è la costante generale dei gas, T è la temperatura assoluta (entrambi i termini sono

espressioni del moto di agitazione termica) N è il numero di Avogadro (numero di particelle

contenute in una mole, pari a 6,023x10^23), f è il coefficiente di attrito che dipende sia dalle

dimensioni della molecola che dalla viscosità del mezzo.

Quindi la diffusione dipende essenzialmente dalla temperatura, dal numero di particelle in gioco e

dal coefficiente di attrito.

Se la molecola che diffonde è sferica f è espresso dalla legge di Stokes:

f = 6(pi greco)η(epsilon)r

dove η è la viscosità del mezzo (esprime l’attrito nel mezzo) ed r è il raggio della molecola che

diffonde.

Quindi, il coefficiente di diffusione è proporzionale alla temperatura (e quindi all’energia cinetica

posseduta dalle molecole) e inversamente proporzionale all’attrito, il quale dipende sia dalle

caratteristiche del mezzo (η) sia dalle dimensioni della molecola (r).

2° Legge di Fick:

stabilisce che il tempo necessario affinché la concentrazione del soluto raggiunga una certa

percentuale della concentrazione iniziale (es. 75%) ad una certa distanza dalla sorgente di

diffusione cresce con il quadrato della distanza.

Ne consegue che il trasporto di materia per diffusione è efficiente e rapido (dell’ordine dei

millisecondi) su distanze molto piccole (dell’ordine dei µm) mentre esso diventa lentissimo su

scale macroscopiche.

Consideriamo il glucosio che scorre nei capillari. Su una distanza da pochi micron (che è quella che

separa ogni capillare dalle singole cellule) il tempo necessario affinché il glucosio diffonda dal

capillare nello spazio interstiziale è di 3,5 secondi consentendo un trasporto di glucosio efficiente.

Se il glucosio dovesse percorrere uno spessore di 10 cm ci impiegherebbe 11 anni. Se le cellule

fossero distanti 10 cm dai capillari il glucosio non lo riceverebbero mai!

Come avviene la diffusione attraverso la membrana? La legge di Fick descrive la

diffusione libera anche in

ambienti non acquosi come

lo spessore di un di una

membrana biologica.

Il soluto passa per diffusione

dall’ambiente 1 all’ambiente

2 attraverso una membrana

di spessore d.

Cs1 è la concentrazione del

soluto nell’ambiente 1,

Cs2 è la concentrazione

nell’ambiente 2.

Cs1 > Cs2

Cm1 è la concentrazione di

soluto nella membrana all’interfaccia con l’ambiente 1 e Cm2 è la concentrazione di soluto nella

membrana all’interfaccia con l’ambiente 2.

Per la prima legge di Fick il flusso netto di soluto, definito come differenza tra i due flussi

unidirezionali (da 1 a 2 e da 2 a 1 rispettivamente) è pari a:

J = J1→2 – J2→1 = ADr(Cs1-Cs2)/d

dove A è l’area della superficie di scambio, D è il coefficiente di diffusione, r è il coefficiente di

ripartizione del soluto considerato tra membrana (fase lipidica) e acqua.

Il flusso è quindi direttamente proporzionale alla superficie, al gradiente di concentrazione e al

coefficiente di ripartizione della molecola.

Il coefficiente di ripartizione è l’espressione della lipofilicita’ o meno di una sostanza, è cioè di

quanto una sostanza sia affine a sciogliersi nei lipidi.

Più elevato è il coefficiente di ripartizione, maggiore è la lipofilicità. Più basso è il coefficiente di

ripartizione, maggiore sarà l’idrofilicità (tendenza a sciogliersi nella fase acquosa).

Il coefficiente di ripartizione r applicato alla membrana biologica è il rapporto della concentrazione

del soluto nella membrana e nella soluzione alle interfacce , ossia Cm1/Cs1 che è pari a Cm2/Cs2.

Se, ad esempio r vale 1 (e quindi si tratta di una molecola che ha uguale tendenza a sciogliersi in

acqua e nei lipidi) Cm1 (cioè la concentrazione della sostanza all’interfaccia della membrana) è pari

a Cs1 e Cm2 è pari a Cs2.

Se, invece, r≠1, ad esempio è pari a 2, vuol dire che il soluto preferisce ripartirsi nell’ambiente

della membrana piuttosto che in quello acquoso. In questo caso sulla superficie della membrana a

contatto con l’ambiente 1 ci sarà una concentrazione doppia rispetto a quella nell’acqua

bell’ambiente 1 e così dicasi per l’ambiente 2.

Quindi: la concentrazione effettiva che diffonde attraverso la membrana non è quella del

compartimento 1, ma è la concentrazione Cm1 ai lati della membrana all’interfaccia con il

compartimento 1 e il compartimento 2: questa concentrazione è influenzata dalla lipofilicità della

membrana che si esprime attraverso il coefficiente di ripartizione.

Conglobando insieme in un unico termine il coefficiente di diffusione, il coefficiente di ripartizione

membrana/acqua e lo spessore delle membrana, si ottiene la seguente relazione:

J/A=P(Cs1-Cs2)

dove J/A è il flusso per unità di superficie, mentre P è definito coefficiente di permeabilità ed è pari

a: P=Dr/d. 11/10/17, quinta lezione

I movimenti di soluti attraverso le membrane biologiche: trasporti mediati da proteine carrier o

proteine Canale.

L’energetica del trasporto mediato da carrier può essere distinta in trasporto passivo (diffusione

facilitata) e trasporto attivo.

Trasporto passivo: Diffusione facilitata

In questo tipo di trasporto non è richiesta energia metabolica perché la sostanza si muove secondo

il suo gradiente di concentrazione. In seguito specificheremo che i due membri i soluti si muovono

lungo un gradiente di potenziale elettrochimico.

Il trasporto passivo di questo tipo è mediato da proteine carrier o proteine Canale.

Le sostanze che usufruiscono del meccanismo di trasporto facilitato sono molecole idrofile e ioni

che non possono permeare attraverso il doppio strato fosfolipidico. In particolare, si ha che gli ioni

passano attraverso proteine che formano canali ionici, le molecole idrofile attraverso proteine

trasportatrici o proteine carrier.

Le classi di proteine carrier sono 3 e possiamo classificarle in:

Uniporto quando il carrier trasporta una sola specie;

Simporto quando trasporta due specie che si muovono nella stessa direzione;

Antiporto quando trasporta due specie che si muovono in direzioni opposte.

Il trasporto facilitato è il modello generale di trasporto delle proteine carrier ed avviene secondo

gradiente di concentrazione seguendo un meccanismo di tipo flip flop. Inizialmente il carrier si

trova nella conformazione aperta pronto a legare una sostanza dal lato esterno della membrana; il

legame con il substrato induce nel carrier un cambiamento conformazionale che lo porta poi a

rilasciare il substrato nella parte opposta della membrana. Il distacco della sostanza da trasportare

riporta il carrier nella conformazione iniziale.

L’importanza funzionale della diffusione facilitata è rilevantissima, perchè consente il trasporto

attraverso la membrana delle più importanti molecole organiche di interesse vitale (nutritive e

metaboliche) che altrimenti non potrebbero attraversarla con la velocità richiesta.

Due esempi di questo tipo di trasporto sono il trasporto passivo del glucosio e il trasporto passivo

degli aminoacidi.

Quando una cellula deve acquisire glucosio dal torrente sanguigno lo fa attraverso trasporto

facilitato: in seguito ad un pasto il livello di glucosio nel sangue aumenta, quindi esiste un

gradiente di concentrazione del glucosio all’interno e all’esterno della cellula che gli consente

attraverso il carrier di entrare in cellula seguendo appunto il suo gradiente.

Esempio di trasporto facilitato: Trasporto facilitato del glucosio mediante il trasportatore

glucosio permeasi (famiglia dei trasportatori GLUT).

I trasportatori GLUT sono una famiglia di proteine di membrana che consentono la diffusione

facilitata del glucosio secondo gradiente di concentrazione. Sono formati da 12 segmenti ad α-

elica idrofobici disposti in cerchio. Esistono diverse isoforme dei trasportatori del glucosio,

ciascuna con le specifiche caratteristiche di cinetica, di distribuzione tissutale e di funzione (tabella

da sapere).

Come funzionano i membri della famiglia GLUT?

Essi seguono il modello flip flop illustrato in precedenza!

Caratteristiche cinetiche dei trasporti mediati da carrier.

Specificità: ogni trasporto mediato è affidato ad un sistema che opera solo per una particolare

sostanza o per un gruppo di sostanze simili. Il trasportatore stericamente riconosce una specifica

sostanza secondo il meccanismo chiave serratura.

Saturazione: l’intensità del flusso non aumenta in modo proporzionale al gradiente di

concentrazione della sostanza trasportata (legge di Fick) ma, al crescere del gradiente tende

asintoticamente ad un limite massimo.

Competizione: quando due sostanze simili utilizzano lo stesso sistema di trasporto, il trasporto

dell’una tende a inibire il trasporto dell’altra. Se esprimiamo in un

sistema di assi

cartesiani il flusso

netto del soluto in

funzione della

concentrazione

esterna otteniamo

un’iperbole

rettangolare che tende

ad un asintoto

orizzontale

all’aumentare della concentrazione di substrato. Quindi il trasporto tende alla saturazione quado

tutti i trasportatori sono occupati dal substrato. In questo caso, pur aumentando ulteriormente la

concentrazione del substrato il flusso non aumenta più.

Il flusso di una sostanza mediato da carrier è descrivibile attraverso la seguente equazione, simile

all’equazione di Michaelis e Menten: J = JmaxCs/Kt + Cs

in cui J è il flusso espresso come numero di molecole che passano nell’unità di tempo, Cs è la

concentrazione della sostanza trasportata e Kt è una costante corrispondente alla costante di

Michaelis e Menten.

Kt, detta costante di affinità, rappresenta la concentrazione di substrato che dà luogo ad un flusso

pari alla metà del flusso massimo Jmax.

Jmax è il flusso unidirezionale massimo che si verifica quando tutte le molecole trasportatrici sono

occupate dal substrato. Il valore di Jmax è correlato al numero di molecole trasportatrici presenti e

alla frequenza del ciclo di trasporto di ogni singola proteina trasportatrice.

Km, o costante di affinità, è correlato con l’affinità del trasportatore per il substrato: quanto più

basso è il valore di Km (e quindi tanto più piccola è la concentrazione del soluto) tanto più ripida è

l’ascesa iniziale dell’iperbole e quindi tanto maggiore è l’affinità del trasportatore per la molecola

da trasportare. Sulla base della Km si possono confrontare più trasportatori.

Se si considerano i trasportatori del glucosio, quelli che hanno una maggiore attività per questa

sostanza sono i GLUT 3 che hanno una km più bassa: ciò vuol dire che c’è bisogno di una bassa

concentrazione di glucosio per raggiungere un flusso semi massimale.

Confronto tra la cinetica del trasporto mediato e la cinetica della diffusione semplice.

Nel caso della diffusione semplice ogni singola molecola diffonde da sé attraverso il bilayer

fosfolipidico, quindi si dice che in questo caso la cinetica ha un andamento lineare. All’aumento

del gradiente di concentrazione aumenta linearmente anche il flusso di sostanza.

Nel caso della diffusione facilitata abbiamo una cinetica di tipo diverso, in quanto un grande

numero di molecole da trasportare si legano al carrier, che rapidamente provvede a trasportarle

dall’altro lato della membrana. Tuttavia, ad un certo punto il sistema si satura poiché vengono

occupati tutti i carrier da trasportare (bisogna aspettare che i carrier si liberino per iniziare il ciclo);

si raggiunge un flusso massimo che non può essere ulteriormente aumentato aumentando la

concentrazione di substrato.

In questo caso si può determinare una km per interpolazione che corrisponde alla concentrazione

di substrato che produce il picco semi massimale.

I trasporti attivi.

I trasporti attivi richiedono energia metabolica (ATP). I soluti vengono trasportati contro gradiente

di potenziale elettrochimico. Quindi, si tratta di un processo disequilibrante che crea e mantiene le

differenze di concentrazione tra ambienti separati da una membrana. Si riconoscono due tipi

fondamentali di trasporto attivo:

- Trasporto attivo primario

- Trasporto attivo secondario.

Trasporto attivo primario.

I trasporti attivi primari sono sistemi di trasporto che traggono l’energia necessaria per trasportare

le particelle contro gradiente direttamente dalla scissione dell’ATP in ADP. Pertanto, la proteina

trasportatrice è al tempo stesso anche ATPasi, ossia è anche enzima che catalizza l’idrolisi di ATP

grazie alla presenza di un dominio catalitico. In tali proteine trasportatrici l’idrolisi di ATP è

accoppiata a cambiamenti conformazionali della molecola tali da consentire il trasporto contro

gradiente e del substrato. L’adenosin trifosfato (ATP) è un nucleoside

trifosfato che contiene: la base azotata adenina;

il pentoso ribosio; un blocco di tre fosfati indicati

in successione come fosfato α, β e γ. I legami

chimici tra i singoli gruppi fosfato sono

fosfoanidrici, definiti ad elevata energia, in

quanto la loro rottura con conseguente rilascio

di Pi (fosfato inorganico) e ADP libera energia

necessaria alla realizzazione di processi

indispensabili per la cellula.

Si riconoscono tre classi principali di trasportatori attivi primari:

- Le pompe di classe P: costituite da 2 peptidi, alfa e beta; passano in uno stato fosforilato

(subunità alfa) durante il ciclo di trasporto;

- Le pompe delle classi F e V non hanno intermedi fosforilati. Costituite da numerose

subunità, non hanno alcuna relazione con quelle delle pompe della classe P.

- Le proteine ABC hanno 4 domini: 2 transmembrana (T) e 2 citosolici leganti ATP (A) che

accoppiano l'idrolisi di ATP al trasporto del soluto. In certe ABC, i domini sono presenti

come subunità separate mentre in altre risultano fusi in un singolo polipeptide.

ABC-ATPasi ABC- ATPasi (acronico di ATP Binding Cassette) sono proteine

ancestrali, ritrovate in tutti i phyla. Sono composte da due subunità

transmembranali (denominate T), ciascuna formata generalmente da

6 α-eliche e da due subunità ABC (denominate A). Si ritiene che il

meccanismo di funzionamento di tali ATPasi sia riconducibile ad un

meccanismo di tipo flip-flop.

Il ciclo di trasporto inizia con il legame del substrato da trasportare alle subunità T. Ciò provoca

una variazione conformazionale nei due domini , dove aumenta l’affinità della tasca per l’ATP. Il

conseguente legame di due molecole di ATP nella tasca formata dalle due subunità A, la fa

scattare dalla forma aperta a quella chiusa e provoca un cambio conformazionale nelle due

subunità T, che trasferiscono il substrato al lato opposto della membrana. La successiva idrolisi di

ATP riporta il dimero A nella forma aperta e il ciclo ricomincia.

Nella specie umana, le proteine ABC intervengono nel trasporto attivo verso l’esterno della

membrana plasmatica delle cellule degli epiteli intestinale, renale, e respiratorio o verso l’interno

di organuli endoplasmatici (es. il reticolo endoplasmico o i mitocondri) di un gran numero di specie

chimiche: ioni, piccole molecole, lipidi, steroli, molecole potenzialmente tossiche.

Esse costituiscono una vera e propria linea di difesa contro sostanze ritenute tossiche per la

cellula.

Alcuni di questi trasportatori, detti multidrug transporters contribuiscono alla resistenza

farmacologica (Multi Drug Resistance) delle cellule tumorali. Molti chemioterapici sono

riconosciuti come tossine da parte delle cellule e li rigettano all'esterno di esse; l'inefficacia del

chemioterapico spesso deriva dall'efficienza di questi trasportatori.

L'ABC ATPasi riconosce il chemioterapico come sostanza tossica e lo ributta all'esterno; questi

trasportatori sono inducibili nel tempo, quindi l'esposizione prolungata ad un determinato

farmaco determina un incremento dell'espressione di queste proteine sulla membrana, motivo

per il quale se inizialmente il farmaco ha effetto, a lungo andare il farmaco non riesce ad entrare

nella cellula.

Un altro esempio di ABC ATPasi collegata ad una patologia nota è il trasportatore ABC ATPasi che

trasporta cloruro a livello dell'epitelio respiratorio, la cui mutazione è alla base di una patologia

detta fibrosi cistica dovuta alla mutazione di un gene che codifica per una ABC ATPasi responsabile

della secrezione di cloruro a livello dell'epitelio respiratorio: se non c'è un trasporto di sali non c'è

un trasporto di acqua, di conseguenza si ha un accumulo di mucine che produce un muco molto

denso che può far soffocare la persona. 12/10/17, sesta lezione

V-ATPasi. Si caratterizzano per il fatto di essere costituite da molte subunità (V

sta per vacuolo). Si tratta di pompe protoniche, chiamate nel loro

complesso H-ATPasi. Le V ATPasi mantengono attivamente l’acidità

all’interno di molti organuli intracellulari, come i lisosomi (il cui pH

molto basso è dovuto proprio alla presenza di queste ATPasi che

trasportano protoni all’interno) o le vesciche sinaptiche nelle cellule

animali e i vacuoli in quelle vegetali. Sono costituite da due gruppi di

subunità denominati rispettivamente V0 (proteine che attraversano lo

spessore di membrana) e V1 (che si trovano a livello del versante

citoplasmatico). Nel gruppo V1 sono presenti 3 siti catalitici per l’ATP

(sulle 3 subunità A). Il trasporto ionico che avviene attraverso il gruppo

V0 è operato dal moto rotatorio delle subunità C,C’, C’’, D ed F del

complesso V0. L’idrolisi dell’ATP è necessaria per energizzare tale

movimento. F ATPasi. Anche le F-ATPasi sono formate da un numero elevato

di subunità: un gruppo è definito F0 ed è responsabile del

trasporto protonico, il gruppo F1 contiene i domini ATPasici per

l'idrolisi dell'ATP. Le pompe protoniche di classe F sono

localizzate sulla membrana mitocondriale interna e sulla

membrana dei tilacoidi dei cloroplasti. Funzionano in modo

opposto alle V ATPasi: invece di produrre un gradiente protonico

grazie all’idrolisi dell’ATP, sfruttano l’energia derivante dal

trasporto secondo gradiente di protoni (che esiste già a livello

della membrana mitocondriale interna) per sintetizzare ATP

partendo da ADP e Pi inorganico. Un classico esempio è

rappresentato dalla ATP-sintasi localizzata sulla membrana

mitocondriale interna.

.

La famiglia delle P-ATPasi, il cui nome deriva dalla presenza di un sito di fosforilazione (P), è

costituita da proteine integrali di membrana formate da due subunità, α e β. Comprende la Na+ -

K+-ATPasi, la H+/K+-ATPasi e le Ca2+ ATPasi. Le P-ATPasi sono specializzate prevalentemente nel

traporto di ioni. Una subfamiglia di P-ATPasi, le cosiddette fosfolipide traslocasi (meglio note come

flippasi) trasportano i fosfolipidi dal foglietto del bilayer fosfolipidico affacciato al lato

citoplasmatico a quello affacciato al lato extracellulare,

contribuendo a mantenere l’asimmetria dei due foglietti

fosfolipidici.

Durante il loro ciclo di attività le P-ATPasi passano

attraverso due stati conformazionali: E1 ed E2.

Nella conformazione E1 i siti di legame sono esposti al lato

citoplasmatico ed hanno elevata affinità per i substrati da

trasportare dall’altro lato della membrana e bassa affinità

per o i substrati che sono già stati trasportati in senso

opposto.

Nella conformazione E2 gli stessi siti sono esposti all’altro

lato della membrana ed hanno bassa affinità per i substrati

che sono stati già legati al alto intracellulare ed alta affinità

per i substrati che dal alto extracellulare dovranno essere

importati in cellula.

POMPA SODIO POTASSIO.

La pompa sodio potassio è la più diffusa e studiata, presente ad elevata densità in tutte le

membrane plasmatiche.

Il gradiente elettrochimico del sodio va dall'esterno all'interno, cioè all'interno della cellula il sodio

è poco concentrato e all'esterno è molto concentrato: la pompa sodio potassio ATPasi trasporta il

sodio contro gradiente di concentrazione, va ad accumularlo all'esterno dove è già abbastanza

concentrato mantenendo bassa la concentrazione di sodio intracellulare. Il potassio viene portato

all'interno della cellula.

È un carrier di tipo antiporto (poiché uno ione si muove in una direzione e l’altro in direzione

opposta) che, in particolare, estrude Na+ dalla cellula e importa K+, generando e mantenendo il

gradiente di Na+ e K+ ai due lati della membrana plasmatica. È detta pompa elettrogenica in

quanto trasporta all’esterno 3 ioni Na+ e intrude 2 ioni K+ e genera in questo modo una differenza

di potenziale a livello della membrana.

Il lavoro compiuto da tale pompa per mantenere tali gradienti è considerevole: si ritiene che possa

corrispondere al 40% dell’energia spesa complessivamente da un intero organismo per sostenere

le sue attività vitali. La pompa Na+/K+ATPasi consiste di 2 subunità

principali (a e b). La subunità alfa (composta da

1000 aa; PM 110 Kda) contiene i siti di legame per

Na+ e ATP e un sito di fosforilazione nel dominio

citoplasmatico; nel dominio extracellulare ha i siti

di legame per il K+ e la ouabaina (glicoside che si

estrae ed è un inibitore della pompa sodio

potassio).

La subunità b (composta da 300 aa) non manifesta

attività enzimatica e di trasporto. La sua

associazione con la alfa -subunità è necessaria per

l’attività della pompa in quanto stabilizza la subunità alfa all’interno della membrana.

Ciclo di attività della sodio potassio ATPasi.

Si riconoscono 5 step:

1) Una molecola di ATP si lega alla Na+ -K+ ATPasi sul versante citoplasmatico. Questa tappa

aumenta l’affinità del trasportatore per il Na+. I 3 ioni Na+ vengono legati sul versante

citoplasmatico del trasportatore. Il trasportatore passa, quindi, nello stato E1 in cui esso ha

un'elevata affinità per le sostanze che devono essere trasportate.

2) L’ATP viene idrolizzata, lasciando un gruppo fosfato legato al carrier.

3) L’energia rilasciata dall’idrolisi di ATP modifica la conformazione della proteina carrier, che

si apre ora vero il lato extracellulare. Allo stesso tempo l’affinità per il Na+ diminuisce e gli

ioni Na+ vengono rilasciati all’esterno, nel liquido extracellulare.

4) Dopo la perdita del Na+ il gruppo fosfato si stacca. La perdita del Pi crea un’alta affinità dei

siti di legame per il K+ sul versante extracellulare del carrier. Due ioni K+ dal versante

extracellulare si attaccano al carrier. Il trasportatore è nello stato conformazionale E2 in cui

si ha bassa affinità per il sodio che è stato rilasciato ed acquisisce elevata affinità per il

potassio che deve essere ancora trasportato.

5) Una nuova molecola di ATP si lega all’ATPasi. Questo modifica la conformazione in modo

tale che la proteina si apra nuovamente verso il lato citoplasmatico rilasciando il K+. Il ciclo

poi ricomincia.

Ruoli fisiologici della pompa sodio potassio.

Crea gradienti per Na+ e K+ necessari per:

• Potenziale di membrana;

• Potenziali d’azione;

• Potenziali sinaptici;

• Potenziali generatori.

I gradienti del Na+ sono importanti per i trasporti attivi secondari di soluti organici (glucosio,

aminoacidi) e ioni (Ca2+, Cl-, H+).

H+/K+-ATPasi

E’ una pompa ATPasica molto simile alla Na+/K+ ATPasi, ma a differenza di quest’ultima, è

elettroneutra, ossia estrude 2 ioni H+ e intrude 2 ioni K+. È il principale responsabile dell'acidità

dei contenuti dello stomaco. Nello stomaco la H+/K+-ATPasi è presente nelle cellule ossintiche

delle ghiandole gastriche della mucosa dello stomaco.

Il funzionamento della protono – potassio ATPasi è simile

a quella della pompa sodio potassio. Questa pompa è

localizzata sulla membrana plasmatica delle cellule

ossintiche. È un antiporto, quindi la pompa H+ /K+ATPasi

trasporta attivamente H+ nel lume gastrico (all'esterno)

accumulando K+ in cellula idrolizzando ATP. Il K+

accumulato fuoriesce insieme con il Cl- attraverso il

cotrasporto K+/Cl-. Quindi, complessivamente, grazie

all’attività funzionalmente accoppiata della pompa

H+/K+ATPasi e del cotrasporto K+/Cl- viene secreto HCl

nel lume dello stomaco. L’H+ secreto dalla pompa deriva dall’idratazione della CO2 metabolica,

che, grazie all’attività catalitico dell’enzima anidrasi carbonica (CA), viene scissa in H+ e HCO3-.

L’HCO3- accumulato in cellula dall’idratazione della CO2 fuoriesce in scambio con il Cl- che può

entrare in cellula attraverso la membrana basolaterale per fuoriuscire nel lume gastrico attraverso

la membrana apicale.

Quindi, dopo un pasto ricco in proteine si ha un accumulo di acido nello stomaco (perché l'HCl

viene secreto nel lume dello stomaco) e un accumulo di bicarbonato nel sangue (si ha una sorta di

alcalosi). Sulla membrana baso-laterale ci sarà sempre la pompa sodio potassio ATPasi, per cui il

sodio viene estruso all'esterno che porta ad un accumulo di bicarbonato di sodio nel sangue (per

bilanciare tutto).

Ca2+ ATPasi: PMCA e SERCA

Le pompe per il Ca2+ sono molto efficaci nel generare elevatissimi gradienti di Ca2+.

Ca2+ intracellulare: 10-7 Mol/l

Ca2+ extracellulare 10-3 Mol/l

Si noti come vi sia una differenza di 4 ordini di differenza tra le due concentrazioni.

Il calcio dev'essere poco concentrato nella cellula perché Il Ca2+ è un potente secondo

messaggero, fondamentale in una serie di processi come ad esempio la contrazione muscolare, la

trasmissione sinaptica, l’adattamento allo stimolo dei recettori sensoriali. La sua bassissima

concentrazione in cellula, mantenuta attraverso svariati meccanismi di cui le Ca2+ ATPasi sono uno

dei principali, consente che anche piccole variazioni della concentrazione intracellulare di tale ione

possano rappresentare potenti segnali per la cellula per l’attivazione di risposte biologiche.

Per mantenere bassa la concentrazione di calcio intracellulare sono richieste due ATPasi: PMCA

(Plasma membrane Calsium ATPase): espelle all’esterno della cellula il Ca2+attraverso la

membrana cellulare e SERCA (sarco/endoplasmic reticulumCa2+-ATPase): importante per

sequestrare il Ca2+ nel reticolo endoplasmatico. Entrambe le ATPasi idrolizzano una molecola di

ATP per trasportare contro gradiente due ioni

calcio.

Trasporto attivo secondario.

Il trasporto attivo secondario consiste in quel

trasporto di una o più molecole contro

gradiente di concentrazione accoppiato al

trasporto di una seconda sostanza che si

muove secondo gradiente di concentrazione.

In questo caso, quindi, l'utilizzo dell'energia

proveniente dall'ATP è indiretto (non si tratta

quindi di ATPasi come nei trasporti primari).

Come tutti i trasporti mediati anche il trasporto attivo secondario segue una cinetica di

saturazione.

Le molecole cotrasportate possono andare nello stesso verso attraverso la membrana (simporto)

oppure in verso opposto(antiporto).

I più comuni sistemi di trasporto attivo secondario sono guidati dal gradiente di concentrazione

del Na+, che è praticamente ubiquitario. Si tratta generalmente di Cotrasporto e Antiporto.

Esempi:

Cotrasporto Na+-amminoacidi(consente alla cellula di accumulare amminoacidi)

AntiportoNa+-Ca2+ (contribuisce al mantenimento dell’omeostasi intracellulare del Ca2+)

CotrasportoNa+ glucosio nella membrana apicale dell’epitelio di intestino tenue e del tubulo

contorto prossimale.

(citplasma) (spazio extracellulare)

Vengono qui riassunti i principali tipi di trasporti attivi secondari basati sul gradiente di sodio:

• Sodio-glucosio: presente a livello della membrana plasmatica apicale delle cellule

intestinali e renali.

• Sodio-ioduro: presente a livello della membrana plasmatica delle cellule della tiroide che

consente il trasporto e l'accumulo dello iodio.

• Sodio-bicarbonato: presente nel lume intestinale e renale.

• Sodio-protonI: importante nell'omeostasi del pH intracellulare.

Tutte queste sostanze (glucosio, iodio, bicarbonato, calcio e protoni) vengono trasportati contro il

loro gradiente di concentrazione sfruttando il movimento secondo gradiente del sodio, che esiste

perchè c'è l'idrolisi di ATP da parte della pompa sodio potassio ATPasi. Questi trasportatori fanno

un uso indiretto dell'ATP tramite l'uso di questa pompa.

ANTIPORTO SODIO-CALCIO:

Oltre a due trasporti attivi primari (PCMA e SERCA) la membrana plasmatica delle cellule ha anche

un trasporto attivo secondario per mantenere bassa la concentrazione di calcio intracellulare:

quest'ultimo tipo di trasporto espelle due ioni calcio in scambio con tre ioni sodio.

Nel trattamento patologico dello scompenso cardiaco (quando cioè si riduce la forza di

contrazione da parte del cuore) si somministra un farmaco, l'ouabanina che inibisce la pompa

sodio potassio ATPasi, quindi di fatto il gradiente di sodio tra l'interno e l'esterno della membrana

si riduce poiché viene temporaneamente sospesa l'attività della pompa: si ridurrà di conseguenza

anche la forza con cui il trasporto attivo secondario espelle calcio all'esterno. Si ha di riflesso

l'aumento di concentrazione di calcio intracellulare che aumenta la forza di contrazione.

17/10/17, settima lezione

ANTIPORTO SODIO PROTONI:

Il sodio si muove sempre secondo il suo gradiente di concentrazione (dall’esterno all’interno della

cellula): ciò energizza il cambio conformazione del carrier che deve espellere il protone contro il

suo gradiente di concentrazione: questi vengono liberati nel citosol dalla deidrogenazione dei

substrati e dalla idratazione della CO2 metabolica.

L’antiporto sodio protoni partecipa alla regolazione dell’equilibrio acido base di tutte le cellule.

Si tratta di un trasporto attivo secondario "housekeeper", ossia questo tipo di antiporto è

presente in tutte le cellule.

Tale trasportatore è, inoltre, espresso in abbondanza sulla membrana plasmatica apicale delle

cellule del tubulo renale, dove svolge un ruolo fondamentale nel regolare il pH sistemico e sulla

membrana plasmatica dell'epitelio intestinale.

COTRASPORTO SODIO GLUCOSIO. Sappiamo che il glucosio può muoversi attraverso

un trasporto mediato a livello della membrana. Nel

momento in cui vi è un aumento di concentrazione

di glucosio nel sangue (ad esempio dopo i pasti)

esso permea secondo il suo gradiente di

concentrazione nelle cellule attraverso le permeasi

servendosi della diffusione facilitata (trasporto

passivo mediato da carrier). I trasporti passivi che

consentono il movimento facilitato del glucosio

attraverso la membrana sono rappresentati dalla famiglia dei trasportatori GLUT.

Per il glucosio in particolari tessuti esiste a livello dell'orletto a spazzola delle cellule intestinali e

renali anche un trasporto attivo secondario di glucosio in cui l’energia potenziale accumulata nel

gradiente di concentrazione del sodio viene usata per spostare il glucosio contro il suo gradiente di

concentrazione ed accumularlo in cellula.

Le proteine che operano questo trasporto appartengono alla famiglia SGLT (Sodium-dependent

Glucose Transporters). Esse trasferiscono all’interno della cellula una molecola di glucosio

accoppiata a due ioni Na+ che si muovono nello stesso verso.

Ciclo di attività del cotrasporto sodio glucosio.

Il meccanismo del cotrasporto sodio glucosio è assimilabile a quello del tipo flip flop. In

particolare, si ha che:

1) Quando il carrier è aperto sul versante del liquido extracellulare, ha un sito ad alta affinità per

l’Na+ e uno a bassa affinità per il glucosio.

2) Quando l’Na+ si lega al carrier il sito di legame per il glucosio diventa ad alta affinità e lega il

glucosio.

3) Il legame di entrambi i substrati determina il cambiamento di conformazione del carrier che si

ribalta e si apre verso il citoplasma.

4) L’Na+ (meno concentrato in cellula) viene rilasciato nel citoplasma. Il rilascio dell’Na+ riporta la

conformazione del sito di legame per il glucosio alla forma di bassa affinità in modo che anche il

glucosio venga rilasciato.

Assorbimento di glucosio a livello intestinale.

A livello delle cellule intestinali, oltre ai trasportatori

GLUT avviene anche un trasporto attivo secondario. Il

trasporto attivo secondario del glucosio (SGTL1) è

presente sulla membrana dell'orletto a spazzola delle

cellule intestinali e consente sfruttando il gradiente del

sodio di accumulare il glucosio in cellula contro il suo

gradiente di concentrazione. Il glucosio accumulato in

cellula può fuoriuscire attraverso la membrana

basolaterale attraverso il GLUT2.

Questo è quindi un "epitelio polarizzato", cioè esso ha

strutture e funzioni diverse sul lato apicale e quello

basolaterale: questa diversità di trasportatori garantisce

un trasporto di tipo direzionale e vettoriale dal lume

verso il lato basale.

Domanda esame: come viene assorbito il glucosio a livello intestinale? Grazie all'attività di due

trasportatori localizzati a livello delle due membrane, apicale e basolaterale: il trasporto attivo

secondario sodio glucosio accumula il glucosio in cellula dal lume; in seguito attraverso la

membrana basolaterale il glucosio secondo gradiente di concentrazione (e quindi attraverso un

trasporto passivo mediato da GLUT 2) fuoriesce.

Attraverso lo stesso cotrasportatore (SGTL1) può essere trasportato anche il galattosio

(chimicamente molto simile al glucosio).

Attraverso il trasporto facilitato GLUT2 possono passare lo stesso galattosio, ma anche fruttosio.

Come viene assorbito il fruttosio?

Il fruttosio, chimicamente differente da glucosio e galattosio, entra nella cellula per diffusione

facilitata (nessuna spesa di energia) grazie al trasportatore GLUT5 e non attraverso il trasportatore

sodio glucosio poiché quest’ultimo non lo riconosce. Può occasionalmente attraversare anche il

GLUT2 che lo riconosce e farlo passare nella membrana basolaterale.

Perché il fruttosio non ha bisogno di trasporti attivi e passa passivamente secondo il suo

gradiente?

Innanzitutto, se misuriamo le velocità con cui vengono assorbiti a livello intestinale fruttosio e

glucosio, ci accorgiamo che la velocità con cui viene assorbito il glucosio è molto maggiore rispetto

a quella del fruttosio: infatti, il glucosio è la molecola energetica del nostro metabolismo di cui il

nostro organismo necessita per ricavarne energia. La presenza del trasporto attivo secondario di

glucosio aumenta notevolmente la velocità del suo assorbimento (rispetto a quello di fruttosio)

poiché esso crea un gradiente, lo accumula velocemente in cellula e fuoriesce. Se dovesse affidarsi

al solo trasporto passivo di glucosio, la velocità sarebbe più lenta e di conseguenza anche

l'assorbimento.

Riassorbimento del glucosio a livello renale. Il rene dall'ultrafiltrato deve riassorbire le

sostanze nutritive ed eliminare le

sostanze di rifiuto. Tra le sostanze da non

perdere e quindi da riassorbire c'è

proprio il glucosio. Nel lume del tubulo

renale sono presenti due isoforme di

trasportatori: nei segmenti prossimali è

presente l’isoforma SGLT2 (non trasporta

galattosio ed è quella a più bassa affinità

con il valore di Km più alto) in quelli

distali l’isoforma SGLT1 (non trasporta

galattosio, con Km più bassa e affinità più

alta). La fuoriuscita del glucosio verso il

lato basolaterale è assicurata da un

trasporto facilitato GLUT.

La diversa disposizione dei trasportatori è dovuta al fatto che quando l'ultrafiltrato sta entrando

nel rene è ricco di glucosio e non è necessaria un'elevata affinità per il glucosio; l'elevata affinità

per il glucosio da parte del trasportatore presente a livello distale è necessaria affinchè recuperi

quel poco di glucosio che è rimasto.

In condizioni fisiologiche questi trasportatori riescono a recuperare tutto il glucosio ma, dal

momento che il loro numero è limitato, quando le concentrazioni dello zucchero nel filtrato

salgono eccessivamente, un po'di glucosio sfugge al riassorbimento. E’ ciò che accade nei soggetti

diabetici la cui urina contiene glucosio.

Assorbimento di amminoacidi, dipeptidi e tripeptidi a livello intestinale.

La digestione delle proteine avviene a livello

gastrico laddove l'ambiente particolarmente acido

consente la rottura dei legami peptidici tra i singoli

amminoacidi. A livello dell’intestino tenue i singoli

amminoacidi sono trasportati in cellula mediante

simporti Na+amminoacidi -dipendenti localizzati

sulla membrana dell’orletto a spazzola.

I dipeptidi e tripeptidi sono trasportati in cellula

da simporti H+-dipendenti, localizzati anch’essi

sulla membrana plasmatica luminale.

Lo scambiatore Na+/H+ localizzato sulla

membrana luminale e la pompa Na+/K+-ATPasi

localizzata sulla membrana basolaterale

mantengono I necessari gradienti di Na+ e H+

rispettivamente.

Nel citoplasma degli enterociti sono presenti delle di- e tripeptidasi che idrolizzano i di- e tri-

peptidi nei singoli amminoacidi che fuoriescono dalla cellula attraverso la membrana basolaterale

mediante trasporto facilitato da carrier.

I protoni poi fuoriescono dalla cellula attraverso la pompa sodio protoni di cui è ricco l'epitelio

intestinale in scambio con il sodio.

TRASPORTI MEDIATI DA VESCICOLE.

I trasporti mediati da VESCICOLE vengono annoverati tra i trasporti attivi perché la cellula spende

energia per il trasporto delle vescicole

endocitosi

L’ è il processo attraverso il quale la membrana si invagina a formare una cavità nella

quale sono presenti macromolecole o aggregati sovramolecolari. Successivamente la membrana si

chiude formando una vescicola la quale alla fine di distacca dalla membrana stessa.

Esistono diversi tipi di endocitosi:

Pinocitosi : consiste nell’introduzione in cellula di materiale liquido dall’ambiente

extracellulare. Si forma una minuscola goccia di liquido circondata dalla membrana che si stacca

nel citoplasma. I liquidi contenuti in queste vescicole vengono poi lentamente trasferiti nel

citoplasma.

Fagocitos i: forma di endocitosi in cui grosse particelle come microrganismi e cellule morte

sono ingerite in grosse vescicole endocitotiche dette fagosomi. Durante l’ingestione si ha il

ripiegamento della membrana plasmatica per includere la particella che è venuta a contatto con la

superficie cellulare e si forma così intorno ad essa un grande sacco membrana. Quando la

membrana ha circondato completamente la particella, questa si fonde nel punto di contatto. Il

fagosoma si fonde successivamente con i lisosomi che provvedono alla degradazione del materiale

ingerito.

Endocitosi mediata da recettor e: è innescata dal contatto delle molecole che devono essere

introdotte in cellula (es. lipoproteine, proteine vettrici di ormoni o metalli, fattori di crescita o

virus) con specifici recettori della membrana plasmatica, che di solito si addensano in regioni

specializzate della membrana plasmatica.

Sul versante intracellulare i complessi recettore-ligando si combinano, attraverso la mediazione di

proteine dette adaptine, con particolari proteine citosoliche dette clarinetto. Le clatrine sono

organizzate in strutture dotate di 3 gambe non complanari dette trischeli, i quali, combinandosi tra

loro, formano una struttura poliedrica che contribuisce all’invaginazione della membrana

plasmatica.

In dettaglio:

Le vescicole che si formano dalla membrana plasmatica per endocitosi mediata da recettore sono,

quindi rivestite da una gabbia di clatrine che viene presto rimossa, formando gli endosomi precoci.

Successivamente il recettore si stacca dal ligando e si formano due gruppi di vescicole: quelle

contenenti il ligando si fondono con vescicole gemmate dall’apparato del Golgi formando

l’endosoma tardivo, quelle contenenti i recettori si fondono nuovamente con la membrana, dando

luogo ad esocitosi.

Questo «riciclaggio» mantiene invariata dimensionalmente la membrana plasmatica ed inoltre fa

sì che non vadano perduti i recettori di membrana, garantendone una costante disponibilità.

Un esempio di endocitosi mediata da recettore è dato dallendocitosi delle LDL (lipoproteine a

bassa densità). Il colesterolo ematico viene assorbito dalle cellule animali per endocitosi mediata

da recettore.

Le lipoproteine a bassa densità (LDL) costituiscono uno dei carrier primari per il trasporto di

colesterolo nel sangue. Esse mediano il trasporto del colesterolo dal fegato ai tessuti.

esocitosi

L' è il processo cellulare con il quale la cellula riversa al suo esterno (ovvero nel liquido

extracellulare) delle molecole accumulate all'interno di una vescicola, tramite la fusione di

quest'ultima con la membrana plasmatica.

L’esocitosi viene messa in atto da parte della cellula per espellere prodotti di scarto (escrezione) o

portare all’esterno della cellula prodotti di secrezione.

Esistono due tipi di esocitosi:

- La secrezione costitutiva, è tipica delle cellule che sintetizzano una molecola e la estrudono,

continuamente, nel tempo.

- La secrezione regolata, invece, avviene quando la cellula sintetizza un prodotto e lo accumula in

apposite vescicole che vengono esocitate soltanto dopo l'insorgere di un segnale. Il calcio è uno

ione che, in molte tipologie di cellule, è un segnale di attivazione dell'esocitosi.

PROTEINE CANALE.

Le proteine Canale sono proteine integrali di membrana che formano nella membrana dei pori

attraverso i quali transitano a grande velocità gli ioni inorganici e le molecole d’acqua. Pertanto il

trasporto mediato da proteine Canale avviene molto più velocemente rispetto a quello operato

dalle proteine carrier che invece Stabiliscono un vero e proprio legame con le particelle da

trasportare ed operano il trasporto attraverso cambiamenti conformazionali più o meno

complessi.

I canali in genere sono formati da più subunità transmembranarie (in genere da 4 a 6) disposte in

cerchio a formare un poro idrofilo che attraversa da parte a parte il bilayer fosfolipidico.

18/10/17, ottava lezione

Proprietà fondamentali che contraddistinguono i canali ionici:

• Gating (gate = cancello): è il meccanismo che governa le transizioni che controllano

l’apertura e la chiusura del canale.

• Selettività: è la proprietà del canale di selezionare la specie ionica che lo attraversa. Non si

ha quindi un passaggio aspecifico, ma la specie ionica viene selezionata.

SELETTIVITA' Alla base della selettività sta il fatto che

nella molecola costitutiva del canale

ionico sia presente un condotto

percorribile dallo ione e che questo

condotto presenti una regione critica

contenente un filtro di selettività che

consente il transito solo degli ioni di una

determinata specie (quelli per i quali il

canale è selettivo).

Si ritiene che interazioni di tipo elettrico

tra le cariche che caratterizzano gli ioni e

gli amminoacidi che formano le pareti interne del poro siano alla base del meccanismo della

selettività (esclude alcune specie ioniche e ne fa passare altre). Si ritiene, inoltre, che lo ione

debba perdere il suo mantello di solvatazione per attraversare il filtro di selettività.

Come può avvenire questo passaggio?

In ambiente acquoso, ogni ione è avvolto da un guscio di

molecole d’acqua (gli ioni vengono quindi solvatati) detto

alone o mantello di solvatazione. Le molecole d’acqua che

compongono l’anello di solvatazione si orientano, essendo

dipoli, lungo il campo elettrico generato dallo ione.

A parità di carica, il numero di molecole d’acqua che si

addensano attorno allo ione è tanto maggiore quanto

minore è il raggio anidro dello ione (vedi tabella). Ciò

dipende dal fatto che la forza elettrica esercitata dallo ione

è tanto maggiore quanto maggiore è la densità di carica

(densità di carica = quantità di carica distribuita

uniformemente su una superficie).

Esempio del K+ e del Na+

Nel caso del Na+ il raggio ionico è inferiore rispetto al raggio ionico del K+. Pertanto, la densità di

carica nel caso del Na+ è maggiore rispetto alla densità di carica del K+ (infatti nel caso del Na+ la

carica è distribuita su una superficie minore). Pertanto, la forza di attrazione che il Na+ esercita

sulle molecole d’acqua circostanti è maggiore.

Conseguentemente, l’anello di solvatazione del Na+ è maggiore rispetto a quello del K+. Ciò

comporta che l’anello di cariche del filtro di selettività deve avere una distribuzione spaziale ben

precisa, specifica per la specie ionica per la quale il canale manifesta selettività.

Per superare il filtro di selettività lo ione deve essere reso anidro poiché non ci può passare

attraverso da idratato: esso deve perdere le molecole d'acqua. Pertanto, i legami tra lo ione e le

molecole d’acqua devono essere vinti dall’attrazione tra lo ione e cariche elettriche di segno

opposto a quello dello ione presenti sugli amminoacidi che compongono il filtro di selettività.

Ad esempio per disidratare uno ione e consentirne il passaggio

attraverso il filtro di selettività, i legami che legano lo ione alle

molecole d’acqua dell’anello di solvatazione devono essere sostituiti

da simili legami con gli atomi di ossigeno dei residui carbonilici degli

amminoacidi che costituiscono il filtro di selettività. Il filtro di

selettività è strutturato sia dimensionalmente che dal punto di vista

degli amminoacidi che sono presenti per stabilire delle interazioni

tali da consentire il passaggio anidro del potassio. Attraverso questo

canale non può passare il sodio perché la distanza tra gli

amminoacidi non è tale da consentire la rimozione di tutte le

molecole d'acqua.

Struttura di un filtro di selettività. In generale per molti canali ionici (come ad

esempio nel caso di quelli voltaggio-dipendenti)

ogni subunità comprende diversi segmenti

transmembrana collegati da anse intracellulari ed

extracellulari.

Ai fini della costituzione del filtro di selettività,

riveste particolare interesse l’ansa tra il segmento

5 e il segmento 6. Quest’ansa, detta anche ansa P

(poro), è rivolta verso l’interno della molecola, affondata nello spessore della membrana.

L’organizzazione a cerchio di 4 anse P contribuisce a formare la parete interna del poro come una

sorta di imbuto molecolare che si affossa nello spessore della membrana, la cui porzione più

stretta (dell’imbuto) rappresenta il filtro di selettività.

GATING .

La maggior parte dei canali ionici ha la facoltà di passare, in risposta ad un segnale adeguato, da

uno stato aperto, in cui è ammesso il passaggio degli ioni, ad uno stato chiuso, in cui gli ioni non

possono transitare. In tal modo l’intensità di flusso può essere finemente regolata.

Il modello più semplice che possa spiegare questa transizione di stato prevede la presenza di una

«porta» o gate posizionata nella porzione del canale dove fluiscono gli ioni.

Il gate è una porzione di proteina ed è costituito da una propaggine molecolare del canale capace

di muoversi sul suo punto di attacco al resto della proteina, in modo da occludere o lasciare pervio

il lume del canale.

Si conoscono 5 categorie generali di «gated channels» distinte in base allo specifico meccanismo di

gating:

canali controllati dal voltaggio: i cosiddetti "canali voltaggio dipendenti";

canali controllati dal ligando: I cosiddetti "canali ligando dipendenti";

canali controllati dalla sollecitazione meccanica: detti anche "meccanocanali";

canali controllati dalla temperatura;

canali controllati dalla luce: si ritrovano solo in forme abbastanza primitive, come ad esempio

nelle alghe.

Canali voltaggio dipendenti. Sono i canali più abbondanti e di cui

parleremo molto in questo corso. Passano

dallo stato chiuso allo stato aperto e viceversa

in seguito a variazioni della differenza di

potenziale elettrico a cavallo della membrana.

Alla variazione del potenziale elettrico di

membrana corrisponde una variazione del

campo elettrico all’interno della membrana.

Si ritiene, quindi, che il gate di questi canali sia

dotato di carica elettrica che risenta della

forza (attrattiva o repulsiva) esercitata dalla variazione di campo elettrico all’interno della

membrana.

Canali chemio-dipendenti o ligando-dipendenti o operati da recettore (ROC).

Passano dallo stato chiuso allo stato aperto in seguito al

legame di particolari molecole «messaggere» (ligandi)

ad uno specifico sito recettoriale del canale, sito che

può trovarsi sul lato extracellulare o sul lato

intracellulare.

In seguito a questo legame, la struttura del canale

subisce una serie di cambiamenti conformazionali che

alla fine determinano il movimento del gate dalla

posizione di chiusura a quella di apertura (o viceversa

quando il ligando si stacca dal sito recettoriale).

Canali meccano-sensibili.

I canali meccano-sensibili (o sensibili alle sollecitazioni meccaniche) sono generalmente dotati di

una porta connessa ad una struttura citoscheletrica che la apre quando sopraggiunge una

deformazione della superficie cellulare.

Questi canali sono alla base di processi fisiologici quali la percezione della pressione sulla pelle

(senso del tatto), delle vibrazioni dell’aria (senso dell’udito) e la propriocezione (es. la percezione

dello stato di tensione muscolare).

Canali sensibili a variazioni di temperatura. Passano dallo stato chiuso a quello

aperto in seguito a piccole variazioni

di temperatura rispetto ad un valore

di riferimento. Essi sono coinvolti

nella percezione del caldo, del freddo

e dei processi termoregolatori.

Si ritiene che in questi canali siano

presenti sequenze di diverse decine

di amminoacidi che darebbero luogo

a strutture che si muovono in corrispondenza di piccole variazioni di temperatura. Il moto di tali

strutture provocherebbe l’apertura o la chiusura del canale.

Canali ionici senza porta (non-gated channels)

Tutte le cellule sono dotate di canali ionici che sono sprovvisti di porta «non gated channels».

Tali canali si trovano sempre nello stato aperto. Essi conferiscono alla membrana una

conduttività di base (possibilità di essere attraversata dagli ioni) che è una componente

fondamentale per la genesi del potenziale di membrana in tutte le cellule.

Il flusso ionico che passa attraverso i canali non-gated è denominato leakage (flusso a perdita),

perché tende a dissipare i gradienti ionici presenti a cavallo della membrana di trasporti attivi

primari e secondari.

Sono conosciuti vari tipi di canali di leakage:

• canali del Na+ (detti anche epiteliali)

• canali del K+ (detti anche 2P)

• canali del Cl-

• canali del Ca2+ (presenti ad esempio sulla membrana del reticolo sarcoplasmatico).

Trasporto d’acqua attraverso la membrana plasmatica e la regolazione del volume

cellulare.

In genere la membrana plasmatica che riveste tutte le cellule di un organismo è permeabile

all’acqua per due ragioni:

1) L’acqua essendo una molecola molto piccola può passare tra le molecole contingue di

fosfolipidi per semplice diffusione;

2) La membrana plasmatica di gran parte delle cellule contiene proteine che formano canali

per l’acqua (le cosiddette acquaporine) che aumentano notevolmente la permeabilità

all'acqua della membrana plasmatica stessa. Più acquaporine sono presenti, più la

membrana è permeabile all'acqua.

La differenza tra il passaggio dell'acqua mediante diffusione facilitata e mediante acquaporine sta

nella velocità: quest'ultimo tipo di passaggio è molto più veloce rispetto a quello diffusivo in cui le

molecole devono diffondersi nell'ambiente idrofobo della membrana.

Acquaporine. La presenza di canali idrici nella membrana plasmatica è stata per lungo tempo

solo ipotizzata. Sono state scoperte nel 1992 dal premio Nobel Peter Agree.

Esse sono state identificate in tutti gli organismi viventi, mammiferi inclusi, piante e batteri.

Le acquaporine sono proteine integrali di membrana associate a formare tetrameri. Ogni proteina

acquaporinica costituisce un canale idrico.

Ogni molecola acquaporinica consta di 6 alfa eliche transmembrana collegate da anse intracellulari

ed extracellulari (anse A, B, C, D, E).

Le anse B ed E (formate dagli stessi amminoacidi prolina, asparagina e alanina) affondano nello

spessore della membrana con andamento antiparallelo formando uno stretto poro del diametro di

3,4 A, estremamente selettivo per le molecole d’acqua.

Le acquaporine comprendono un'ampia famiglia di proteine transmembrana. Nella specie umana

si riconoscono 8 isoforme, anche se in realtà ne sono state circa 200 nel mondo animale. Esse sono

presenti in tutti gli organi nell'uomo, ma il numero maggiore di acquaporine si riscontra nel rene,

che è il principale organo coinvolto nel meccanismo di osmoregolazione e quindi deputato al

controllo del bilancio idrico salino dell'organismo. 19/10/17, nona lezione

Come ogni altra sostanza, anche l’acqua si muove per diffusione secondo il suo gradiente di

concentrazione.

La concentrazione dell’acqua è alterabile addizionando soluto alla soluzione: all’aumentare della

concentrazione di soluto diminuisce quella dell’acqua.

Ma perché all’aumento del soluto diminuisce la concentrazione di acqua?

La concentrazione dell’acqua è tanto maggiore

quanto più diluita è la soluzione.

Infatti, se consideriamo un ugual volume di acqua

(1) e di soluzione acquosa (2), nel primo caso il

100% di molecole contenute nel volume

considerato è rappresentato da molecole d’acqua,

nel secondo caso, rispetto al numero totale di

molecole della soluzione, la percentuale di

molecole d’acqua nello stesso volume è inferiore.

Pertanto, la concentrazione d’acqua in (1) è

maggiore che in (2).

Osmosi La membrana cellulare, grazie alla presenza delle

acquaporine, presenta una permeabilità all’acqua

molto maggiore rispetto a quella dei soluti; questa

caratteristica consente di assimilarla ad una

membrana semipermeabile.

Il passaggio diffusivo di acqua secondo il suo

gradiente di concentrazione attraverso una

membrana semipermeabile (cioè una membrana

permeabile al solvente, in questo caso l’acqua, ma

non ai soluti) prende il nome di Osmosi.

L'osmosi è un processo fisico spontaneo, vale a dire non richiede l’apporto esterno di energia. Esso

tende a diluire la soluzione più concentrata in soluti e a ridurre la differenza di concentrazione tra

due soluzioni separate da una membrana semipermeabile. Esso è un trasporto equilibrante come

la diffusione.

In particolare, come si nota in figura, se si hanno due ambienti (uno meno concentrato in soluto e

quindi più concentrato in acqua e un altro ambiente più concentrato in soluto e meno concentrato

in acqua) separati da una membrana semipermeabile avremo un flusso osmotico di acqua dal

compartimento a maggiore concentrazione di acqua verso quello a concentrazione minore di

acqua.

Questo flusso di acqua è detto flusso osmotico perché avviene attraverso una membrana

semipermeabile.

Per la legge di Teorell, ogni flusso è proporzionale alla forza che lo genera; nel caso del flusso

pressione

osmotico, la forza che lo genera riferita all’unità di superficie prende il nome di

osmotica.

Pressione osmotica. Per definire la pressione osmotica, si consideri un sistema

costituito da una soluzione e dal relativo solvente puro

separati da una membrana perfettamente

semipermeabile (ossia permeabile esclusivamente al

solvente ma non al soluto). Un dispositivo di tale tipo è

alla base della struttura di un osmometro (ossia il

dispositivo utilizzato per misurare la pressione osmotica).

Visto che le molecole d’acqua si muovono secondo

gradiente di concentrazione, che esse sono dotate di un

moto browniano e quindi tendono ad occupare lo spazio a loro disposizione ed essendo la

membrana semipermeabile, si osserva un passaggio delle molecole d’acqua dal compartimento 1,

dove le molecole d’acqua sono più concentrate, verso il compartimento 2, dove lo sono meno. In

virtù della natura semipermeabile delle membrana non si osserva alcun passaggio di soluto.

La forza che spinge le molecole d’acqua a passare attraverso la membrana semipermeabile si

traduce in un aumento del volume d’acqua e conseguentemente della pressione idrostatica

all’interno del compartimento 2. Tale pressione aumenta fino ad equilibrare esattamente, a livello

della membrana, la forza che spinge le molecole d’acqua ad attraversarla.

Il valore di pressione idrostatica necessaria per annullare la diffusione osmotica dell’acqua

rappresenta una misura indiretta della pressione osmotica stessa.

Pressione osmotica – legge di van’t Hoff

Per calcolare quantitativamente la pressione osmotica si usa la legge di Van’t Hoff esprime la

relazione tra la differenza di pressione osmotica che si crea tra due ambienti a concentrazione C1 e

C2 di soluto e la differenza stessa di concentrazione:

Δp = RT(C1-C2)

Considerando un osmometro perfetto in cui C1=0, la legge di van’t Hoff consente di definire la

pressione osmotica di una soluzione come:

Pi greco = RT·C

Difatti, la pressione osmotica (p) è direttamente proporzionale:

- alla concentrazione di soluto (C) (in quanto questa influenza la concentrazione di acqua e quindi

il gradiente di concentrazione di acqua che determina il movimento diffusione dell’acqua).

- alla temperatura assoluta in quanto dipende da un fenomeno diffusivo e quindi dall’energia

cinetica posseduta dalle molecole.

La pressione osmotica come proprietà colligativa.

La pressione osmotica appartiene alle cosiddette proprietà colligative delle soluzioni, cioè essa

non dipende dalla natura delle particelle di soluto, ma dal loro numero per unità di volume.

Pertanto, una soluzione di una sostanza che in acqua si dissocia in due ioni (es. NaCl), esercita una

pressione osmotica doppia di una soluzione di uguale molarità di una sostanza che non si dissocia

(es. glucosio) poiché nel caso di NaCl si ha la dissociazione dei due ioni in soluzione.

In base alla legge di Van’t Hoff si definisce 1 osmolare una soluzione che contiene una osmole

(Osm) in un litro, intendendo per osmole una quantità di particelle disciolte per unità di volume

necessaria affinché essa eserciti una pressione osmotica di 22.4 atmosfere, qualunque sia la

natura delle particelle.

Il liquido extracellulare dei mammiferi ha una osmolarita di circa 300 mOsm comune anche ai

pesci.

Pressione osmotica teorica e pressione osmotica reale

Se la membrana è perfettamente semipermeabile la pressione osmotica reale è pari a quella

calcolata con la legge di Van’t Hoff.

Se però il soluto presenta una certa permeabilità attraverso la membrana (è questo il caso della

membrana plasmatica), anche se inferiore a quella dell’acqua, la Dp misurata è inferiore a quella

teorica fino ad azzerarsi se il soluto permea liberamente.

Bisogna considerare il cosiddetto coefficiente di riflessione, cioè il rapporto tra la pressione

osmotica reale (quella che si sviluppa ai due lati della membrana semipermeabile) e la pressione

osmotica teorica (quella che si svilupperebbe ai due lati della membrana semipermeabile ideale).

Questo coefficiente di riflessione è compreso in un range tra 0 e 1. se il coefficiente di riflessione è

1, la pressione osmotica reale è uguale a quella ideale, quindi la mia membrana semipermeabile

ha un comportamento simile a quella ideale.

Quando il coefficiente di riflessione è 0, la membrana non discrimina tra acqua e soluti e passano

entrambi, quindi non si sviluppa nessuna differenza di pressione osmotica.

Nel caso intermedio, la membrana avrà una maggiore permeabilità all'acqua rispetto ai soluti. E’

questo il caso della membrana plasmatica che non è una membrana semipermeabile perfetta in

quanto presenta una certa permeabilità ai soluti: il valore di pressione osmotica reale è minore

rispetto a quello di pressione osmotica teorica, inferiore per un coefficiente di riflessione.

Osmolarita e tonicità.

L’osmolarità di una soluzione è definita in base al suo comportamento attraverso membrane

semipermeabili perfette e attraverso la legge di Van’t Hoff.

La tonicità di una soluzione è definita in base al suo comportamento attraverso membrane reali

(come la membrana plasmatica, quindi parzialmente permeabili ai soluti).

Analizziamo il primo concetto di osmolarita.

Due soluzioni che esercitano la stessa pressione osmotica attraverso una membrana

semipermeabile perfetta sono dette isosmotiche tra loro. Esse, per la legge di Van’t Hoff,

contengono lo stesso numero di particelle. Se una soluzione esercita una pressione osmotica

(attraverso una membrana semipermeabile perfetta) inferiore ad un’altra si dice iposmotica

rispetto a quest’ultima; se esercita, invece, una pressione osmotica maggiore si dice iperosmotica.

Analizziamo il secondo concetto di tonicità.

Una soluzione è isotonica con una data cellula o un dato tessuto se questi, una volta immersi in

essa, non si restringono e non si rigonfiamento. Se la cellula si rigonfia la soluzione è detta

ipotonica (quindi acqua tende a passare osmoticamente dalla soluzione alla cellula), mentre, se la

cellula si restringe, la soluzione è detta ipertonica (per cui acqua si muove osmoticamente dalla

cellula verso l'esterno e la cellula va incontro a rangrinzimento).

Regolazione del volume cellulare

Quando la cellula è esposta ad uno stress ipotonico o ad uno stress ipertonico, essa subisce una

variazione di volume in seguito al movimento osmotico di acqua attraverso la membrana

plasmatica.

(Se poniamo la cellula in acqua distillata, essa si rigonfia fino a scoppiare).

Essa attiva meccanismi di trasporto transmembrana che consentono di regolare il volume

cellulare. La cellula non può controllare i movimenti delle molecole d'acqua, ma regolerà la

concentrazione dei soluti nelle cellule. Tali meccanismi di trasporto sono rappresentati da

antiporti, scambiatori, cotrasportatori, canali per K+, Na+, H+, Cl-, HCO3- e piccole molecole

organiche (zuccheri, metilamine, aminoacidi).

Regolazione del volume cellulare - RVD

Quando la cellula è immersa in una soluzione ipotonica, essa tende a rigonfiarsi poiché l'acqua

secondo il suo gradiente si muove dall'esterno verso l'interno della cellula. In una condizione,

quindi, di stress ipotonico si osserva un aumento del volume perché la cellula si sta rigonfiando.

Successivamente, mediante l’attivazione di meccanismi di attivi di regolazione del volume cellulare

(detti in questo caso Regulatory volume decrease, RVD) recupera il volume iniziale. Si dice, quindi,

che la cellula attiva una risposta di tipo RVD.

Regolazione del volume cellulare – RVI

Quando la cellula è esposta a stress ipertonico si raggrinzisce per perdita di tempo osmotica di

acqua. Successivamente, mediante l’attivazione di meccanismi di attivi di regolazione del volume

cellulare (detti in questo caso Regulatory volume increase, RVI) recupera il volume iniziale. Quindi

in questo caso la cellula attiva una risposta di tipo RVI.

Meccanismi di RVD ed RVI.

L’RVD si realizza attraverso l’attivazione di meccanismi di trasporto che fanno perdere soluti dalla

cellula. Conseguentemente, la cellula, diventando ipotonica rispetto all’ambiente circostante,

perde acqua per osmosi, recuperando così il volume iniziale. I meccanismi di trasporto che si

attivano durante l’RVD sono rappresentati dal cotrasporto K+/Cl- e da canali per il K+ e il Cl-.Tali

meccanismi di trasporto sono attivati dall’incremento di volume indotto dallo stress ipotonico.

L’RVI si realizza attraverso la l’attivazione di meccanismi di trasporto che fanno guadagnare soluti

alla cellula. Conseguentemente, la cellula, diventando ipertonica rispetto all’ambiente circostante,

assume acqua per osmosi recuperando il volume iniziale. I meccanismi di trasporto che si attivano

durante l’RVD sono rappresentati dal cotrasporto Na+/K+/2Cl-, dall’antiporto HCO3-/Cl- e

dall’antiporto Na+/H+. Tali meccanismi di trasporto sono attivati dalla diminuzione di volume

indotto dallo stress ipertonico. 24/10/17, decima lezione

Trasporti transepiteliali

Gli epiteli sono membrane cellulari ed in particolare gli epiteli monostratificati sono formati da una

singola rete di cellule strettamente collegate tra loro poggiate su una lamina basale; essi regolano

gli scambi di materiali tra l’ambiente interno dell’organismo e l’ambiente esterno, poiché sono

localizzati proprio all'interfaccia tra ambiente esterno ed ambiente interno.

In base alla funzione svolta gli epiteli monostratificati si distinguono in:

Epiteli di scambio: si caratterizzano per il fatto di avere uno spessore molto ridotto (es. endotelio

capillare, media gli scambi tra il sangue e il liquido interstiziale, es. epitelio di rivestimento delle

superfici respiratorie, media gli scambi gassosi con l’ambiente esterno).

Epiteli di trasporto: promuovono e regolano l’assorbimento e la secrezione di numerosissime

sostanze (es. epitelio renale ed epitelio intestinale)

Epiteli secernenti: rilasciano nell’ambiente esterno o nel sangue sostanze prodotte

rispettivamente da ghiandole esocrine (es. ghiandole sudoripare) o da ghiandole endocrine (es.

ipofisi).

EPITELI DI TRASPORTO. Caratteristica comune a tutti gli

epiteli di trasporto è che questi

sono costituiti da un solo strato

di cellule cilindriche connesse le

une alle altre da un complesso

sistema giunzionale. Le cellule

dell’epitelio di trasporto

poggiano su una membrana

basale la quale consente il

libero passaggio di tutte le

sostanze trasportate

dall’epitelio. Essa, pertanto, ha

solo la funzione di interfacciare

l’epitelio con il sottostante

tessuto connettivale.

Caratteristiche fondamentali degli epiteli di trasporto sono:

Presenza di un complesso giunzionale tra cellule adiacenti: tale complesso giunzionale lega

saldamente le pareti laterali delle cellule epiteliali. Esso “sigilla” cellule epiteliali adiacenti

garantendo così la funzione di barriera svolta dall’epitelio.

Polarità: esiste una diversità morfologica e funzionale tra la membrana plasmatica apicale e quella

basolaterale. In realtà, esiste una diversità anche nei meccanismi di trasporto a livello delle due

porzioni di membrana (apicale e basolaterale), le quali sono mantenute distinte dalle giunzioni

tight.

Analizziamo il primo concetto: presenza di un complesso giunzionale tra cellule adiacenti.

Il complesso giunzionale in un epitelio di trasporto (procedendo in direzione lume-sierosa) è

formato da:

• Giunzioni strette o occludenti o tight junctions;

• Giunzioni aderenti;

• Giunzioni comunicanti o giunzioni gap.

1) Tight junctions.

• Aiutano a mantenere la polarità cellulare

• Collocate di norma sotto la superficie apicale: sono le prime forme di connessione tra

cellule che si incontra

• Formano una barriera per sigillare le cavità del corpo (intestino, stomaco, etc.) impedendo

che i contenuti possano riversati all’interno.

Le membrane di due cellule contigue sono «saldate» in punti specifici da domini extracellulari di

specifiche proteine transmembranarie: la claudina, occludina, proteina JAM.

Occludina, claudina e JAM sono proteine

integrali di membrana che sporgono

sulla faccia esterna delle membrane e

sono tra loro unite da legami non

covalenti. Queste proteine formano una

cintura intorno alla cellula che

nemmeno le proteine di membrana

possono attraversare, dividendola

quindi in due domini, quello apicale e

quello basolaterale.

Al microscopio elettronico la tight

junction appare come una struttura a

tre binari elettrondensi: i due più esterni

sono rappresentati dagli strati

fosfolipidici più interni delle due cellule

coinvolte nella giunzione, quello più interno è dato dalla fusione dei due strati fosfolipidici esterni

delle due cellule.

Le giunzioni occludenti svolgono una funzione sigillante, uniscono le due cellule adiacenti senza

lasciare interstizi, in modo che le molecole idrosolubili non filtrino facilmente tra una cellula e

l'altra. Sono localizzate generalmente all'apice di cellule polarizzate come quelle dell'epitelio

intestinale e impediscono alle molecole presenti, ad esempio, nel lume dell'intestino di valicare

l’epitelio.

2) Giunzioni aderenti. Sono giunzioni meccaniche localizzate al di sotto delle

giunzioni tight e circondano la cellula. Lo spazio

intercellulare di 15÷20 nm presente tra i due foglietti

esterni delle membrane adiacenti contiene delle

particolari proteine integrali di membrana, Ca2+-

dipendenti: le caderine.

Le regioni extracellulari di queste proteine formano

ponti con quelle della cellula adiacente.

La loro porzione citoplasmatica, invece, si lega a una

regione specializzata, rappresentata da un fascio di filamenti di actina del citoscheletro attraverso.

La struttura dei filamenti di actina è ben saldata anche con la membrana cellulare grazie a due

particolari proteine, la vinculina e l’α-actinina.

Nel caso dei desmosomi, essi collegano la membrana con il citoscheletro a livello dei filamenti

intermedi e non actinici.

3) Giunzioni comunicanti Le giunzioni comunicanti rappresentano vie di

comunicazione tra cellule, consentendo alle cellule dello

stesso tessuto di essere funzionalmente accoppiate.

Esse sono formate da due unità chiamate connessoni,

formati a loro volta da proteine specifiche dette connessine

(in numero di sei per subunità). L’accoppiamento del

connessone di una cellula con il connessone della cellula

adiacente consente di costituire un canale idrofilo a ponte

tra le due cellule che permette gli scambi di metaboliti

(quali Amp ciclico, ione calcio, urea, acqua) e quindi l'accoppiamento elettrico. È importante

ricordare che queste giunzioni possono andare incontro a regolazione a feedback da parte del

calcio, pH e cAMP per prevenire eventuali danni alle cellule adiacenti. Non sono quindi canali

sempre aperti, ma sono regolati dal rilascio di questi fattori, in seguito ai quali essi vanno incontro

ad un cambio conformazionale e si chiudono.

Se ad esempio la concentrazione di calcio nella cellula vicina aumenta in maniera esagerata,

questa potrebbe andare incontro ad apoptosi e quindi morte: la cellula adiacente chiude i canali di

connessione con la cellula vicina.

Allo stesso modo, se il pH della cellula vicina cambia in modo drastico, la cellula adiacente ha

problemi e la cellula vicina chiude i connessoni.

Analizziamo il secondo concetto: polarità.

Polarità morfologica: la membrana luminale, a differenza di quella basolaterale è dotata di

microvilli (detti anche orletto a spazzola) che aumentano notevolmente la superficie apicale

Polarità funzionale: consiste nell’asimmetrica distribuzione di proteine di trasporto a livello della

membrana apicale e basolaterale delle cellule. Ad esempio la pompa Na+-K+-ATPasi è localizzata a

livello della membrana plasmatica basolaterale, ma non a livello di quella apicale.

La diversità di trasporto consente di operare un trasporto direzionato di sostanza; se ci fossero gli

stessi trasportatori su tutte e due le membrane non si avrebbe la direzionalità di trasporto, che

prevede l’accumulo di sostanza nella cellula e la sua fuoriuscita secondo gradiente e per realizzare

ciò c'è bisogno di trasportatori diversi.

Polarità elettrica: a cavallo dell’epitelio è sempre presente un potenziale transepiteliale,

determinato dal trasporto transepiteliale degli ioni, il cui valore può essere molto variabile da

epitelio a epitelio.

Se posizioniamo un elettrodo a livello della membrana apicale e un elettrodo a livello della

membrana basolaterale e li colleghiamo ad un voltmetro, misuriamo sempre una differenza di

potenziale legata appunto al trasporto transepiteliale degli ioni.

In definitiva: gli epiteli proteggono l’ambiente interno dell’organismo, così come la membrana

plasmatica delimita la cellula. Pertanto, le molecole che entrano o escono dall’organismo devono

attraversare un epitelio (trasporto transepiteliale).

Vie di permeazione di una sostanza attraverso un epitelio.

Esistono due vie:

1) via di permeazione paracellulare, attraverso gli interstizi tra le cellule lasciati in liberi dalle

giunzioni intercellulari.

2) via di permeazione transcellulare, attraverso il corpo delle cellule.

1) Via di permeazione paracellulare:

non comporta l’attraversamento di membrane poiché esso avviene nello spazio intercellulare

attraverso i piccoli interstizi lasciati dal complesso giunzionale;

dipende dal grado di «apertura» della via paracellulare che di per sé è sprovvista di specificità;

infatti, mentre nel caso dei trasporti esiste il riconoscimento della sostanza da trasportare da parte

del carrier con un meccanismo di tipo chiave serratura, nel caso della via paracellulare non si ha

questa specificità, ma la discriminazione sul fatto che una sostanza possa passare o meno dipende

essenzialmente dalle dimensioni. Per cui, solo piccoli ioni come sodio, potassio, cloruro, calcio,

magnesio e acqua possono usufruire di questa via di permeazione.

non avviene in modo direzionato, in quanto attraverso gli interstizi tra le cellule il passaggio può

avvenire sia in un senso che nell’altro secondo il gradiente di concentrazione della sostanza.

costituisce una via di fuga (leakage o perdita) per le sostanze trasportate contro gradiente per

via transcellulare, che in tal modo possono ritornare secondo gradiente dal lato da cui

provengono.

avviene per movimento diffusionale passivo di ioni (Na+, Cl-, K+, Ca2+, Mg2+) e acqua.

La pervietà della via paracellulare dipende essenzialmente dalla tenuta del complesso giunzionale.

In relazione alla pervietà della via paracellulare si distinguono:

Epiteli leaky: "vuol dire epiteli a perdere". Sono caratterizzati dal fatto che la via paracellulare è

ampia e facilmente percorribile da ioni. Questi epiteli presentano piccole differenze di potenziale

transepiteliale e bassa resistenza elettrica. Esempi: epitelio dell’intestino tenue ed epitelio del

tubulo contorto prossimale

Epiteli tight: la via paracellulare è impervia o ristretta (tight). Questi epiteli presentano elevate

differenze di potenziale transepiteliale e bassa resistenza elettrica. Esempi: epitelio del colon ed

epitelio del dotto collettore del rene.

La distinzione tra epiteli leaky ed epiteli tight dipende dalle caratteristiche del complesso delle

giunzioni tight. Nelle giunzioni tight le membrane di due cellule adiacenti si connettono le une alle

altre lungo più linee continue di saldatura, complesse e ramificate, che rendono lo spaccato delle

giunzioni simile ad una rete.

Le linee di saldatura sono dovute a due file di proteine intrinseche (l’una appartenente ad una

membrana, l’altra alla membrana adiacente) che si affaccerebbero l’una di fronte all’altra,

connettendosi testa a testa come in una cerniera lampo. La cellula lungo la linea di saldatura viene

«incernierata tutt’intorno alle cellule vicine.

La differenza tra epiteli leaky ed epiteli tight sta a livello del complesso giunzionale, nel numero di

linee di saldatura in serie e nel numero di ramificazioni (nei primi è ridotto, nei secondi è

abbondante).

Via di permeazione transcellulare:

comporta il passaggio in serie della sostanza attraverso il corpo cellulare e quindi attraverso la

membrana plasmatica apicale e basolaterale delle cellule;

avviene in modo direzionato, attraverso l’intervento di sistemi di trasporto attivo; nel caso del

glucosio, abbiamo un trasporto vettoriale di glucosio dal lato luminale al lato basolaterale.

presenta un elevato grado di selettività perché si basa su riconoscimento sterico tra la sostanza

che deve essere trasportata e il suo trasportatore.

In definitiva: il trasporto attraverso la via transcellulare prevede l’attraversamento della

membrana apicale e in serie l’attraversamento della membrana basolaterale. Questo tipo di

trasporto è la risultante di vari processi di trasporto di membrana, attivi, passivi e attivi secondari,

che insieme danno luogo ad un trasporto transepiteliale direzionato.

Primo esempio di trasporto transepiteliale: l'assorbimento transepiteliale di glucosio.

A livello della membrana apicale abbiamo il cotrasporto sodio glucosio (SGLT1) che accumula

glucosio in cellula sfruttando il gradiente elettrochimico del sodio generato dalla pompa sodio

potassio ATPasi. Il glucosio accumulato in cellula può uscire attraverso un trasporto passivo

attraverso una "glucosio permeasi".

Secondo esempio di trasporto transepiteliale: l'assorbimento transepiteliale di amminoacidi.

Gli amminoacidi entrano a livello delle cellule intestinali con un cotrasporto sodio amminoacidi

(trasporto attivo secondario, direzionato, selettivo) per poi fuoriuscire attraverso una permeasi.

Esempi di trasporto transepiteliale: l’assorbimento transepiteliale di NaCl (avviene sia a livello

intestinale che a livello renale).

1) Il primum movens per il trasporto transepiteliale di NaCl è rappresentato dall’attività della

pompa Na+-K+-ATPasi.

2) La pompa Na+-K+-ATPasi, localizzata a livello della membrana basolaterale, genera e mantiene il

gradiente elettrochimico del Na* (la quantità di sodio intracellulare è bassa) favorevole al suo

ingresso in cellula attraverso i trasporti attivi secondari Na+ dipendenti (sodio glucosio, sodio

protoni, sodio amminoacidi) presenti a livello della membrana apicale o anche attraverso canali

per il Na+ (soprattutto a livello del colon). Pertanto, l’azione combinata della pompa Na+ -K+-

ATPasi sulla membrana basolaterale e dei trasporti attivi secondari sulla membrana plasmatica

apicale determina l’assorbimento transepiteliale (ad esempio a livello intestinale e renale) di Na+.

3) Per il principio dell’elettroneutralità delle soluzioni, bisogna avere lo stesso numero di cationi e

di anioni; pertanto, è necessario che al seguito degli ioni Na+ avvenga l’assorbimento di una

quantità equivalente di Cl-. Quindi, complessivamente l'epitelio non trasporta solo sodio, ma sodio

cloruro.

L’assorbimento transepiteliale di cloruro avviene con meccanismi di trasporto differenti a seconda

degli epiteli.

Nell’intestino gli ioni Cl- attraversano la membrana plasmatica apicale attraverso il cotrasporto

HCO3-/Cl-: il bicarbonato deriva dall'idratazione della CO2 metabolica che viene idratata ad acido

carbonico ad opera dell'enzima anidrasi carbonica; l'acido carbonico si dissocia in protoni e

bicarbonato.

Il bicarbonato esce secondo gradiente consentendo al cloruro di entrare in cellula, mentre i

protoni fuoriescono in cambio con il sodio attraverso il carrier sodio protoni, il quale è importante

per mantenere il pH della cellula stabile.

inoltre, esistono anche canali per il Cl- a livello della membrana basolaterale che, combinati con il

cotrasporto bicarbonato cloruro a livello della membrana apicale, consentono l'assorbimento del

cloruro che avviene parallelamente all'assorbimento del sodio, ma con meccanismi diversi.

25/10/17, lezione 11

L’unità funzionale del rene è rappresentata dal tubulo renale: esso comincia con il glomerulo

avvolto dalla capsula di Bowman, poi si ha il tubulo contorto prossimale (che sta sempre nella zona

corticale del rene), poi si ha l'ansa di Henle che risale con il tubulo contorto distale e poi ridiscende

nel dotto collettore. A livello del tratto ascendente

dell’ansa di Henle del rene

osserviamo un forte riassorbimento

di cloruro di sodio.

Il sodio si muove sempre grazie

all'attività della pompa sodio potassi

ATPasi a livello basolaterale ed entra

a livello della membrana apicale

mediante trasporti attivi secondari

sodio dipendenti che gli consentono

di entrare in cellula.

Come viene trasportato il cloruro (per il quale c'è una maggiore permeabilità fra le cellule?)

Sempre nel tratto ascendente dell'ansa di Henle gli ioni Cl- superano la membrana plasmatica

apicale (cioè entrano in cellula) mediante il simporto Na+/K+/2Cl- (sodio potassio due cloruro, un

trasportatore attivo secondario che sfrutta il gradiente elettrochimico del sodio per trasportare in

cellula due ioni cloruro e uno ione potassio) e quella basolaterale mediante il cotrasporto K+/Cl-

ed anche attraverso canali del Cl-.

Questo cotrasporto sodio potassio cloruro è uno dei target di una famiglia di diuretici che vengono

chiamati "diuretici dell'ansa", cioè molecole che vanno ad inibire il cotrasportatore inibendo così

anche il riassorbimento di sodio cloruro a livello del ramo ascendente dell'ansa di Henle: infatti, se

non viene riassorbito il sodio non viene riassorbita neanche l'acqua a livello del tubulo renale

(meccanismo che capiremo in seguito), e di fatto si ha la produzione di un'urina ipotonica e quindi

un effetto diuretico. Il tubulo renale è un epitelio leaky, cioè "a perdita": ha le giunzioni tight un

po' lasse, quindi gli ioni magnesio, sodio, potassio e calcio possono passare attraverso le giunzioni

secondo il loro gradiente di concentrazione. Lo stesso accade nell'intestino che è un altro epitelio

leaky Nel tubulo contorto prossimale del

rene, gli ioni Cl- superano la membrana

luminale mediante il simporto Na+/Cl-

(trasporto attivo secondario che

consente l'accumulo in cellula di

cloruro, che poi fuoriesce sempre

mediante canali del Cl- a livello della

membrana basolaterale.

Trasporto transepiteliale di acqua.

Gli epiteli operano anche un trasporto di acqua. Dal

momento che non esiste un trasporto attivo di acqua, Il

movimento transepiteliale dell’acqua segue quello degli

osmoliti, come ioni e nutrienti. Pertanto, gli epiteli

assorbono o secernono acqua, utilizzando il trasporto

attivo di soluti. Quindi, l'acqua è trasportata attraverso gli

epiteli con un meccanismo secondario come conseguenza

del trasporto dei soluti: cioè l'epitelio assorbe sali per

trasportare acqua.

Il meccanismo dell’assorbimento transepiteliale dell’acqua

accoppiato a quello dei soluti si basa su un meccanismo

denominato gradiente stazionario teorizzato da Curran

(detto anche modello di Curran o teoria dei tre

compartimenti).

Analisi del modello di Curran.

Supponiamo che l’epitelio debba assorbire acqua, e quindi portarla dal livello apicale a quello

basolaterale.

Le membrane laterali delle cellule epiteliali operano un intenso trasporto attivo di NaCl. Quando il

sale viene pompato all'esterno della cellula in queste lunghe e strette fessure, la sua

concentrazione darà origine ad una ipertonicità locale all’interno degli spazi intercellulari (che

diventano quindi ipertonici) e determina così un gradiente osmotico che richiama l’acqua negli

spazi intercellulari stessi.

Il richiamo d’acqua dal lume verso gli spazi intercellulari avviene prevalentemente attraverso la via

transcellulare ed è mediato dalle acquaporine, che consentono un trasporto molto più veloce di

acqua.

Si realizza pertanto negli spazi intercellulari un gradiente osmotico stazionario che favorisce il

passaggio di acqua dal lume dell’epitelio verso lo spazio sotto epiteliale. Il richiamo di acqua nello

spazio intercellulare fa aumentare nello spazio intercellulare stesso la pressione idrostatica

(perché sta aumentano la quantità di acqua) creando così una forza che spinge il liquido

(composto da acqua e soluti) ad uscire. Ciò avviene preferenzialmente verso lo spazio

sottoepiteliale, perché la lamina basale è molto permeabile sia all’acqua che all’NaCl.

Pertanto, in sintesi il compartimento intercellulare funziona come una camera di compressione, in

cui l’acqua viene attratta per effetto osmotico attraverso la via transcellulare negli spazi

intercellulari e spinta per effetto idrostatico verso lo spazio sottoepiteliale.

Il meccanismo è detto anche dell’osmosi locale perchè localmente si viene a creare un gradiente

osmotico stazionario che richiama acqua che poi conseguentemente determina un aumento della

pressione idrostatica.

Analizziamo due aspetti fondamentali di questi compartimenti: spazio sottoepiteliale, spazio

interstiziale e il lume. La pressione osmotica determina nello spazio interstiziale il richiamo di

acqua e la pressione idrostatica che si crea nel secondo compartimento determina l'assorbimento

di acqua e soluti dello spazio sottoepiteliale. Quindi, il flusso transepiteliale di acqua si realizza

grazie al:

- coefficiente di riflessione σ molto alto della membrana basolaterale. Il coefficiente è

molto alto grazie alla presenza di acquaporine (e quindi un'elevata permeabilità all'acqua),

ma questa membrana è praticamente impermeabile al Na+, per l’assenza di canali per tale

ione; l’acqua quindi può entrare nel compartimento interstiziale.

- coefficiente di riflessione σ molto basso (praticamente 0) della lamina basale; il

coefficiente di riflessione è molto basso perchè essa è molto permeabile ad acqua ed NaCl.

- coefficiente di permeabilità idraulica molto alto della lamina basale, che si lascia

attraversare molto facilmente dall'acqua.

Trasporto diffusionale e trasporto in massa di acqua.

Consideriamo ora gli epiteli di scambio, formati da cellule molto appiattite che mediano gli scambi

di fluidi, massa e di gas respiratori. Il potenziale chimico dell’acqua dipende sia dalla concentrazione

dell'acqua sia dalla pressione idrostatica dell’acqua.

(La pressione idrostatica è la pressione esercitata da un liquido in tutte le direzioni sulle pareti del

recipiente che lo contiene; ad esempio nei capillari è la pressione che il sangue esercita sulle pareti

dei capillari sanguigni).

Le molecole d’acqua, spinte da queste due forze, possono permeare in due differenti modi:

• ad una ad una con movimento diffusionale dovuto all’agitazione termica;

• in massa, con trasferimento cioè di una massa di acqua o di soluzione (flusso in massa). Il

flusso in massa di acqua determina un effetto di trascinamento sui soluti.

La differenza tra le due modalità di trasporto risiede nelle caratteristiche della membrana in

questione:

1) Se la membrana è dotata di pori piccoli (acquaporine): il movimento di acqua attraverso la

membrana plasmatica avviene attraverso un flusso diffusionale (flusso osmotico) spinto dal

gradiente di concentrazione di acqua, che rappresenta la forza prevalente che determina tale

movimento di acqua. In tal caso sono presenti canali dell’acqua con diametro dell’ordine dei pochi

Å (3-4 Å) che consentono il passaggio delle molecole d’acqua ad una ad una con movimento

diffusionale, oltre al passaggio più lento delle molecole d’acqua attraverso i fosfolipidi di membrana.

2) Se la membrana è dotata di pori grandi: il movimento di acqua attraverso la membrana plasmatica

avviene mediante il trasporto in massa: si verifica a cavallo di epiteli di scambio come le pareti dei

capillari sanguigni, dove i pori tra una cellula endoteliale e l’altra è sufficientemente ampio da

consentirlo, dove in questo caso è la pressione idrostatica che rappresenta la forza prevalente nel

determinare il movimento di acqua.

Ma cos'è un capillare? I capillari sono i siti di scambio tra il sangue e il liquido

interstiziale in cui sono immerse le cellule di un

tessuto. Gli epiteli sono i punti in cui il sistema

arterioso (che porta ossigeno e nutrienti) si interfaccia

con il sistema venoso (che porta metaboliti di rifiuto);

a livello dei capillari avviene lo scambio di sostanze con

i tessuti e la formazione del liquido interstiziale.

I capillari sono dei cilindri le cui pareti sono definite da sottili cellule endoteliali e sono rivestiti poi

da una lamina basale. È necessario che il capillare sia in questo modo (e quindi nudo da altre

tonache) altrimenti gli scambi con i tessuti non potrebbero avvenire. Le cellule sono legate tra di

loro (anche se non così saldamente come nell'epitelio di trasporto), ma soprattutto presentano delle

fessure che rappresentano un importante passaggio di acqua in massa, che attraversa facilmente la

lamina basale.

Esistono 3 tipi di capillari sanguigni: continui, fenestrati e sinusoidali. I capillari sinusoidali in

particolare sono capillari che presentano un elevato numero di fenestrature. (impara tutta la

seguente diapositiva).

Qualsiasi sia il tipo di capillare, in esso si distingue l’estremità arteriosa (a cui arriva il sangue

ossigenato e ricco di nutrienti) e l’estremità venosa (da cui defluisce il sangue che ha subito gli

scambi con i tessuti, si è impoverito di ossigeno e si è arricchito di prodotti di rifiuto).

All’estremità arteriosa avviene una fuoriuscita di liquido (acqua, soluti e nutrienti) per filtrazione

per movimento in massa di acqua.

All’estremità venosa avviene un’assunzione di liquido (acqua e metaboliti di rifiuto) sempre per

movimento in massa di acqua e metaboliti disciolti. 26/10/17, lezione 12

Filtrazione: si definisce filtrazione il processo in cui la pressione idrostatica forza l’acqua ad

attraversare una membrana dotata di ampi pori (nel caso dei capillari, la membrana è rappresentata

dall’endotelio capillare) e le molecole di soluto possono essere trasportate insieme con l’acqua per

effetto di trascinamento se loro dimensioni sono inferiori rispetto a quelle dei pori della membrana

(nel caso dell’endotelio capillare i pori sono rappresentati dagli spazi tra cellule endoteliali).

Flusso di massa tra sangue e liquido interstiziale.

Sono due le forze principali che determinano il movimento di liquidi attraverso l’endotelio dei

capillari:

- la pressione idrostatica (pressione arteriosa, impressa dalla contrazione del cuore) del

liquido all’interno del capillare spinge il liquido fuori dal capillare; essa è una pressione

favorevole alla fuoriuscita;

- la pressione colloido-osmotica delle proteine, che è la pressione osmotica determinata dalla

presenza delle proteine all'interno del sangue che non riescono a passare attraverso la

membrana endoteliale (che si comporta come una membrana semipermeabile): l'acqua

viene richiamata per la presenza delle proteine per poter diluire l'interno e diluire la

concentrazione delle proteine.

L’effetto della pressione colloido-osmotica è opposto a quello della pressione idrostatica: se la

pressione idrostatica tende a spingere il liquido all'esterno, la pressione colloido-osmotica tende

invece a richiamare liquido all'interno.

La principale differenza nei soluti tra plasma e liquido interstiziale è rappresentata dalle proteine

presenti nel plasma e assenti nel liquido interstiziale, in quanto non passano attraverso l’endotelio

capillare.

Infatti, la parete dei capillari permette il libero passaggio dell'acqua e di piccole molecole, ma non

lascia passare in quantità significative le proteine plasmatiche per cui queste si trovano nel plasma

in forte concentrazione. L’endotelio, si comporta, pertanto, come una membrana impermeabile alle

proteine plasmatiche che esercitano una pressione osmotica (chiamata pressione oncotica) pari a

circa 25 mmHg. Nel grafico osserviamo come varia il profilo della

pressione idrostatica e della pressione colloido-

osmotica lungo la lunghezza del capillare.

La pressione idrostatica è di 32 mmHg (millimetri

di mercurio) all’estremità arteriosa del capillare e

scende (a causa della perdita di energia

determinata dall’attrito) verso un minimo di 15

mm Hg all’estremità venosa del capillare: man

mano che il sangue scorre lungo il capillare la

pressione idrostatica diminuisce perchè il calibro

del capillare è molto piccolo; si arriva ad un

valore di 15 mmHg.

La pressione colloidosmotica ha un valore costante di 25 mm Hg, poiché le proteine sono sempre

presenti.

Pertanto, all’estremità arteriosa la pressione idrostatica è maggiore di quella colloidosmotica e si ha

una filtrazione netta di liquido fuori dal capillare; all’estremità venosa, invece, la pressione

idrostatica è inferiore di quella colloidosmotica e si verifica un riassorbimento netto di liquido a

livello del capo venoso del capillare.

Filtrazione nei capillari

La legge di Starling ci indica il valore della pressione netta di filtrazione: essa deriva dalla somma

algebrica della pressione idrostatica e della pressione colloido-osmotica. Il segno meno indica che la

pressione colloido-osmotica è diretta in verso opposto rispetto a quella della pressione idrostatica.

P = ΔP - Δπ

N

Il bilancio sarà positivo all’estremità arteriosa, poi tende a diminuire fino a quando non si ha una

condizione di circa 0 a circa metà capillare, per cui poi prevale l’effetto della pressione colloido-

osmotica di assorbimento in cui il bilancio diventa negativo.

Non sempre però tutto ciò che viene filtrato viene riassorbito; ciò che non viene riassorbito finisce

nel sistema linfatico che rappresenta un ulteriore sistema di scambio tra il sistema dei capillari e il

liquido interstiziale. Ciò che viene filtrato per la stragrande maggioranza viene riassorbito.

Ad esempio, durante un processo infiammatorio aumenta la permeabilità dei capillari, quindi

aumenta con la formazione dell'edema la fuoriuscita di liquido. Una volta che l'edema viene

riassorbito, nel bilancio tra filtrazione e riassorbimento entra il sistema linfatico che drena il liquido

che non viene riassorbito.

Filtrazione glomerulare a livello del rene.

Un altro esempio di trasporto in massa di acqua e filtrazione è rappresentato dalla filtrazione

glomerulare che avviene a livello renale con la formazione dell’urina primaria.

I capillari del glomerulo sono contenuti in una specie di calice detto capsula di Bowman, dove

avviene il processo di ultrafiltrazione. Da questa capsula si diparte il tubulo renale, diviso in tubulo

prossimale, ansa di Henle e tubulo distale, che sbocca nel tubulo collettore.

L'ultrafiltrazione è solo lo step iniziale del processamento di urina: l'ultrafiltrato deve essere

sottoposto ad un processamento che prevede essenzialmente processi di riassorbimento d'acqua

secondo il meccanismo già visto in precedenza: l'acqua viene riassorbita secondariamente al

riassorbimento dei sali. Abbiamo anche processi di secrezione di sostanze che devono essere espulse

nell'urina. Alla fine del processo abbiamo l'eliminazione di un volume che è l'1% di quello

dell'ultrafiltrato iniziale.

Volendo fare un bilancio si ha che:

F-R+S=E

F: quantità filtrata a livello della capsula di Bowman

R: quantità riassorbita durante tutto il decorso

S: quantità secreta di prodotti di rifIuto

E: quantità di soluto secreto che sarà l'urina finale.

Capsula di Bowman.

Analizziamo la filtrazione a livello glomerulare. La capsula di Bowman è una struttura sferica cava

a fondo cieco, che avvolge il glomerulo per

raccogliere il filtrato. Nell'insieme il glomerulo

renale e la capsula del Bowman costituiscono il

corpuscolo renale, noto anche come corpuscolo

del Malpinghi o malpighiano.

I capillari sono formati da cellule endoteliali sulle

quali si attaccano le cellule del foglietto viscerale

della Capsula di Bowman, in cui si distinguono un

foglietto esterno (o parietale) e un foglietto interno

(o viscerale) separati da uno spazio capsulare (o

camera glomerulare) che raccoglie l’ultrafiltrato.

Il foglietto parietale è rappresentato da un epitelio pavimentoso semplice il quale poggia

esternamente su una lamina basale abbastanza spessa e talvolta stratificata che lo separa dallo

stroma circostante; la superficie cellulare interna, lievemente sporgente, delimita la camera

glomerulare (o spazio capsulare). Le cellule epiteliali, a contorno poligonale, non presentano

caratteri particolari.

Il foglietto viscerale, in continuazione con il foglietto parietale in corrispondenza del polo vascolare

del corpuscolo, è costituito da uno strato di cellule epiteliali specializzate, i podociti, che da un lato

delimitano lo spazio capsulare e dall’altro si addossano ai capillari glomerulari modellandosi alle

varie anse da essi descritte.

L’ultrafiltrato glomerulare passa attraverso tre strati prima di entrare nella capsula del Bowman ed

essi costituiscono nel loro insieme la membrana filtrante: questi 3 strati sono endotelio capillare;

membrana basale glomerulare e strato dei podociti.

Il filtro glomerulare possiede una capacità selettiva molto elevata verso le dimensioni delle molecole

di cui permette il passaggio.

Il filtro glomerulare è pressoché completamente impermeabile alle proteine plasmatiche.

Il peso molecolare della più piccola proteina plasmatica, l’albumina, è di 69.000 D e il suo diametro

è di 6 nm. I porti pertanto hanno un diametro inferiore a tale soglia.

Il processo di ultrafiltrazione glomerulare avviene, mediante un “sistema di pressioni”, ovvero tra

forze che lo favoriscono e quelle che lo ostacolano (Legge di Starlig).

Le forze in gioco sono:

1. Pressione idrostatica dei capillari glomerulari. È la pressione ematica all’interno dei capillari

glomerulari. Essa favorisce la filtrazione attraverso la membrana glomerulare. Nell’uomo

circa 55/60 mmHg.

2. Pressione colloidosmotica dei capillari glomerulari. Si oppone alla filtrazione. La pressione

colloidosmotica media nei capillari glomerulari è intorno a 30 mmHg.

3. Pressione idrostatica della capsula del Bowman. Si oppone alla filtrazione glomerulare ed è

determinata dalla presenza dell’ultrafiltrato. Si aggira intorno a 15 mmHg.

La pressione di filtrazione netta, ossia la pressione netta che spinge il liquido attraverso la membrana

glomerulare, è pari alla pressione idrostatica glomerulare (P ) meno la somma della pressione

H

colloidosmotica glomerulare (P) e della pressione idrostatica capsulare (P ):

fluid

PFN = P – (P+ P )

H fluid

Esempio di calcolo della PNF:

PFN = P – (P + P ) = 55 – (30 + 15) = 10 mmHg

H fluid

La normale pressione di filtrazione è, quindi, di circa 10 mmHg.

Quando la pressione sanguigna si abbassa di molto, si blocca il processo di ultrafiltrazione perchè il

bilancio alla fine tra pressioni positive e negative si annulla e il rene non ha la forza di filtrare.

31/10/17, lezione 13

Fenomeni elettrici di membrana

Potenziale di diffusione

La diffusione di più specie ioniche attraverso la membrana secondo il loro gradiente di

concentrazione può creare essa stessa differenze di potenziale elettrico a cavallo di una

membrana stessa quando gli ioni presentino permeabilità differenti attraverso di essa. Il

potenziale che si genera è detto potenziale di diffusione.

Per permeabilità si intende la capacità di transito degli ioni attraverso canali ionici di membrana

specifici. La permeabilità della membrana agli ioni dipende dal numero e dal tipo di canali ionici

presenti.

Cos’è quindi il potenziale di diffusione?

Il potenziale di diffusione è quella differenza di potenziale che si genera a cavallo di una membrana

come conseguenza:

- della ineguale distribuzione di ioni sui due versanti della membrana, quindi dai gradienti di

concentrazione tra i due ambienti separati alla membrana;

- della diseguale permeabilità agli ioni da parte della membrana stessa.

Perché si genera questo potenziale e come si arriva a questa definizione?

Consideriamo un sistema a due compartimenti separati da una membrana.

- L’ambiente 1 e 2 a diversa concentrazione di NaCl sono separati da una membrana che manifesta

una permeabilità maggiore al Cl- rispetto al Na+: possiamo infatti immaginare che la membrana

abbia un maggior numero di canali per il cloruro rispetto al sodio.

- Na+ e Cl- tendono a diffondere secondo gradiente di concentrazione da 1 a 2. Il Cl-, avendo una

permeabilità maggiore, tende a permeare prima attraverso la membrana rispetto al Na+. Ciò fa sì

che in prossimità dell’uscita dalla membrana dal lato 2 si abbia una concentrazione maggiore di Cl-

mentre dal lato 1 si accumulino le cariche positive del Na+. Perciò, ai capi della membrana si crea

una separazione di cariche che dà luogo ad una differenza di potenziale con segno negativo verso

l’ambiente 2 e positivo verso l’ambiente 1. Tale differenza di potenziale è detta potenziale di

diffusione.

-La differenza di potenziale accelera il flusso del Na+ mentre rallenta quello del Cl-, per cui gli effetti

delle diverse permeabilità degli ioni vengono compensate, con il risultato che i due flussi netti di

Na+ e Cl- dal compartimento 1 al compartimento 2 sono uguali.

In definitiva: gli ioni Cl- e Na+ sono spinti da un uguale gradiente di concentrazione ad entrare in

membrana, ma procedono, nel suo spessore, a velocità diverse. Infatti, lo ione avente permeabilità

maggiore attraverso la membrana tende a passare prima attraverso di essa. Ciò crea separazione di

cariche e quindi un potenziale di diffusione tra i due versanti della membrana, ossia una differenza

di potenziale conseguente alla diffusione di ioni a diversa permeabilità.

Poiché per il principio dell'elettroneutralità delle soluzioni il numero di cationi e anioni nella

soluzione dev'essere uguale, nella sua globalità questo processo è di tipo diffusivo e porta cloruro

di sodio dal compartimento 1 al compartimento 2,ma a livello di membrana (e SOLO a livello di

membrana) per effetto delle diverse permeabilità degli ioni si genere una separazione di carica,

conseguente alla diffusione degli ioni diversamente permeabili.

Profilo di un potenziale di diffusione.

Supponiamo di voler mettere un elettrodo nel compartimento 1 e un elettrodo nel compartimento

2, di collegarli ad un voltmetro e di misurare il profilo del potenziale nel tempo.

Si osserva che il potenziale di diffusione inizialmente aumenta nel tempo, poi diminuisce e finisce

per annullarsi quando non ci sarà più differenza di gradiente di concentrazione tra i due

compartimenti.

Facciamo un altro esempio un po’ più complesso. Consideriamo un sistema a due

compartimenti separati da una membrana,

contenenti NaCl e KCl alla stessa

concentrazione (0,1 M) con il K+ avente una

permeabilità maggiore del Na+ attraverso la

membrana. Il Na+ ha un gradiente di

concentrazione favorevole a passare dal

compartimento 1 al compartimento 2

perché il sodio è presente solo nel

compartimento 1, mentre il K+ ha una gradiente favorevole al passaggio dal compartimento 2 al

compartimento 1 perché nel compartimento 1 il potassio non è presente.

Dal momento che il K+ ha la permeabilità maggiore, tenderà a passare prima del Na+ dal

compartimento 2 al compartimento 1, generando in tal modo una separazione di cariche, ossia un

potenziale di diffusione, negativo dal lato di membrana rivolto verso il compartimento 2 e positivo

dal lato di membrana rivolto verso il compartimento 1. Nel tempo, la separazione di cariche

generata dal movimento più veloce del potassio rispetto al sodio rallenta il movimento del potassio

e accelera quello del sodio, per cui alla fine complessivamente si avrà nel compartimento 1 sodio

cloruro con un po' di potassio cloruro e nel compartimento 2 potassio cloruro con un po'di sodio

cloruro finchè le concentrazioni non si eguagliano.

Il controione in questo caso è il cloruro, ciò che sta variando sono i cationi.

Nota bene: per semplicità abbiamo supposto che la membrana non sia permeabile al cloruro; se lo

fosse, il cloruro pur non avendo un gradiente di concentrazione favorevole, sarebbe poi influenzato

nel suo movimento a muoversi e sarebbe attratto dal compartimento 2 al compartimento 1

(concetto che vedremo tra poco). Nella genesi del potenziale di diffusione, occorre tenere ben

presente che: la separazione di cariche avviene solo a cavallo

della membrana mentre la soluzione esterna alla membrana

contenuta nel compartimento 1 e nel compartimento 2 è

elettroneutra cioè hanno il numero di cationi uguale al

numero di anioni come espresso dal principio

dell’elettroneutralita che non può mai venir meno.

Quantificazione del potenziale di diffusione attraverso

l’equazione di Goldman (detta anche di Hodgkin e Katz).

Il potenziale di diffusione, generato da più specie ioniche a diversa concentrazione ai due lati della

membrana e aventi diversa permeabilità attraverso la membrana stessa, è descritto e quantificato

dalla equazione di Goldman (detta anche di Hodgkin e Katz):

Pa e Pc sono i coefficienti di permeabilità degli anioni e dei cationi in gioco;

Ca e Cc sono le concentrazioni degli anioni e dei cationi rispettivamente nel compartimento 1 e 2.

Il potenziale di diffusione è espresso in millivolt ed è pari al prodotto tra una costante (cioè RT/zF

sono valori costanti) e il logaritmo della sommatoria delle permeabilità degli anioni per la

concentrazione degli anioni nel compartimento 2 più la sommatoria delle permeabilità dei cationi

per la concentrazione dei cationi nel compartimento 1 fratto la sommatoria della permeabilità

degli anioni per la concentrazione degli anioni nel compartimento 1 più la sommatoria delle

permeabilità dei cationi per la concentrazione dei cationi nel compartimento 2.

Quanto maggiore è la permeabilità per una data specie ionica tanto maggiore sarà il contributo

della specie stessa al potenziale di diffusione; se ci sono ioni a bassa permeabilità, di fatto il loro

contributo nella sommatoria diventa trascurabile.

Analizziamo il termine RT/zF che corrisponde ad una costante:

R= 8.3 J/mol x K =1.98 cal/mol x K (costante dei gas)

T = 293 K (20 C)

z = valenza dello ione. +1 (per Na, K+, H+ o in genere cationi monovalenti)

z = -1 (per Cl- o anioni monovalenti)

z = +2 (per Ca2+)

F = 96,500 coulomb (costante di Faraday) indica la quantità totale di carica elettrica di una mole di

cariche elementari e rappresenta il prodotto tra la costante di Avogadro Na≈ 6,022 × 1023 mol-1 e

la carica elementare e ≈ 1,602 × 10−19 Coulomb.

Elettrodiffusione di uno ione. Legge di Nernst-Planck.

Qual è la forza che spinge uno ione a muoversi? (domanda esame) --> il potenziale elettrochimico.

Nel caso di un anelettrolita (e cioè di una sostanza che non è un elettrolita, come ad esempio il

glucosio) la forza che lo fa muovere è il suo gradiente di concentrazione.

Nel caso dello ione, la questione è complicata dal fatto che lo ione ha una carica e quindi può

essere influenzato da eventuali differenze di potenziale presenti a cavallo della membrana stessa.

Per cui, quando si parla di forze che spingono lo ione a muoversi attraverso una membrana, non

basta solo citare il gradiente di concentrazione dello ione, ma lo ione avendo una carica risente

anche del gradiente elettrico attraverso la membrana laddove sia presente.

In definitiva si dice che la diffusione di uno ione, a differenza della diffusione di una specie non

carica, dipende dal gradiente di potenziale elettrochimico che è dato dalla somma algebrica del

gradiente di potenziale chimico (quindi gradiente di concentrazione) e del gradiente di potenziale

elettrico.

La legge di Nernst-Planck dell’elettrodiffusione di uno ione attraverso una membrana teorizza

questo concetto:

Ji è il flusso di uno ione

dc/dx = gradiente di potenziale chimico (gradiente di concentrazione fratto la distanza)

d /dx = gradiente di potenziale elettrico

D è il coefficiente di diffusione, D = RT/Nf

L’energia potenziale elettrica è espressa generalmente per coulomb di carica (volt=joule/coulomb)

invece che per mole come il potenziale chimico. Il termine zF ci consente di esprimere il potenziale

elettrico anch’esso per mole, più precisamente in Joule/mole anziché in Joule/Coulomb. Infatti, il

numero di coulomb trasportati da una mole è pari al numero di coulomb trasportati da un

equivalente (F = faraday) moltiplicati per la valenza (zi) dello ione considerato. Il Faraday è uguale

a F = 96500 C/Eq.

Il segno ± tra le forze in gioco dipende dal fatto che esse possono essere concordi o discordi.

Potenziale di equilibrio.

Consideriamo un sistema a due compartimenti separati da una membrana.

- L’ambiente A e B hanno diversa concentrazione di KCl e sono separati da una membrana che

manifesta permeabilità solo al K+.

K+ tende a passare dal compartimento A al compartimento B in virtù del suo gradiente, ma nel

momento in cui si affaccia sul lato della membrana rivolto verso il compartimento B opera una

separazione di cariche che ostacola l’ulteriore diffusione di ioni K+ dal compartimento A al

compartimento B. Si genera in tal modo una differenza di potenziale elettrico ai due lati della

membrana, detto potenziale di equilibrio (di Nerst) per il K+ a cavallo della membrana.

Nel caso precedente, però, il movimento dello ione era seguito dal movimento dello ione più

lento. In questo caso invece la membrana è permeabile ad una sola specie, quindi di fatto il

cloruro non può passare. Il movimento del potassio non può essere seguito in questo caso dal

movimento di un controione.

Tuttavia, non si può avere un flusso netto di potassio dal compartimento A al compartimento B

perché altrimenti avremmo un accumulo di cariche positive nel compartimento B, cosa che non è

possibile per via del principio dell'elettroneutralità. Quindi di fatto il potassio, che è l'unica specie

permeabile nel suo movimento attraverso la membrana, genera una separazione di carica che

impedisce l'ulteriore movimento di altro potassio spinto dal gradiente di concentrazione.

Si genera quindi una differenza di potenziale elettrico che spinge il potassio nella direzione

opposta controbilanciando completamente la forza che tende a spingere il potassio dal

compartimento A al compartimento B.

Si genera, cioè, un potenziale di equilibrio: differenza di potenziale a cavallo della membrana che

si verifica quando la membrana è selettivamente permeabile ad una sola specie ionica. Il

potenziale di equilibrio generato è di entità corrispondente a quella del potenziale chimico, ma

spinge lo ione a muoversi nella direzione opposta, per cui alla fine il flusso netto dello ione è nullo.

Più elevata è la differenza di concentrazione dello ione mobile ai due lati della membrana

maggiore è la differenza di potenziale.

Due esempi di potenziale di equilibrio.

Nel primo caso si ha una concentrazione di 0,15 M NaCl nel compartimento 1 e una soluzione di

0,15 M KCL nel compartimento 2. In questo caso la membrana è permeabile solo al potassio (sodio

e cloruro non riescono ad attraversarla) che tende a muoversi dal 2 all'1; quando inizia a muoversi,

inizia anche a stabilire una separazione di carica che blocca il potassio, generando così una forza

esattamente uguale e contraria a quella che spinge il potassio a muoversi secondo gradiente di

concentrazione. Quindi, alla fine i due flussi di potassio da 1 a 2 e da 2 a 1 sono uguali.

Nel secondo caso supponiamo invece che l'unico ione permeabile sia il sodio. Il sodio ha un

gradiente di concentrazione favorevole al suo passaggio, quindi inizia a muoversi più velocemente

dal 2 all'1 di quanto non possa fare dall'1 al 2. Quando però il sodio spinto dal suo gradiente si

affaccia sul lato 2 della membrana, deposita cariche positive, mentre le cariche negative si

accumulano nel compartimento 1; si instaura quindi un potenziale di equilibrio che ne impedisce

un ulteriore passaggio.

Quantificazione del potenziale di equilibrio: equazione di Nerst.

Il potenziale di equilibrio può essere descritto dalla legge di Nerst.

Il potenziale di equilibrio è quella differenza di potenziale di membrana alla quale il gradiente

elettrico (zFD /Dx) è esattamente uguale e contrario al gradiente di concentrazione di uno ione

(Dc/Dx). In tali condizioni il flusso netto dello ione è nullo, in quanto il flusso dal compartimento 1

al compartimento 2 è identico al flusso dello ione dal compartimento 2 al compartimento 1.

Pertanto risolvendo rispetto al potenziale di equilibrio si ha che

Da questa equazione si evince che tanto maggiore è il gradiente di concentrazione, tanto maggiore

sarà il potenziale di equilibrio che blocca lo ione impedendone il movimento in base al suo

gradiente di concentrazione.

Il potenziale chimico dello ione (e quindi la forza che lo spinge a muoversi per gradiente di

concentrazione) viene convertito con l'equazione di Nerst in un gradiente elettrico perché il

potenziale chimico è esattamente uguale e contrario al potenziale elettrico. Quindi, conoscendo il

potenziale chimico, convertendo mediante la moltiplicazione per zF del potenziale chimico si

ottiene il potenziale elettrico. 02/11/17, lezione 14

Dall’equazione di Nerst, che descrive la genesi del potenziale di equilibrio di uno ione attraverso la

membrana selettivamente permeabile allo ione stesso presente in gradiente di concentrazione,

scaturisce che essa permette di calcolare il potenziale di equilibrio di uno ione a partire dalle sue

concentrazioni.

Se conosco le concentrazioni dello ione ai due lati della membrana posso calcolarne il potenziale di

equilibrio, cioè quel potenziale che dovrei applicare per far mantenere costante il gradiente di

concentrazione ai due lati della membrana.

L’equazione di Nerst si applica singolarmente a ciascuna specie ionica, quando invece

nell’equazione di Goldman dovevamo considerare tutte le specie diffusibili del sistema.

Esempio pratico.

Le concentrazioni di sodio e potassio nella cellula e fuori dalla cellula sono le seguenti:

il potassio è quindi concentrato di più nella cellula e meno

all’esterno; vale il contrario per il sodio.

Supponendo che la membrana di una cellula sia permeabile solo al

K+, calcolare il potenziale di equilibrio.

A 25°C il termine RT/F è pari a 25 mV.

La conversione da ln a Log prevede la moltiplicazione per il fattore

2.3. Pertanto, conglobando il termine RT/F e la conversione da logaritmo naturale (ln) a logaritmo

in base 10 (Log) in un unico termine, otteniamo 58 mV, termine che rimane costante

nell’equazione di Nerst.

Sostituendo gli altri valori si avrà che:

Quando abbiamo a che fare con una cellula, per convenzione ciò che va al numeratore (e quindi il

compartimento 1) è il compartimento extracellulare mentre chi va al denominatore (e quindi il

compartimento 2) è il compartimento intracellulare.

Questo è il valore del potenziale di equilibrio per lo ione potassio.

Consideriamo invece ora il caso del sodio.

Supponendo che la membrana di una cellula sia permeabile solo al sodio, calcolare il potenziale di

equilibrio

A 25°C il termine RT/F è pari a 25 mV.

La conversione da ln a Log prevede la moltiplicazione per il fattore 2.3. Pertanto, conglobando il

termine RT/F e la conversione da logaritmo naturale (ln) a logaritmo in base 10 (Log) in un unico

termine otteniamo 58 mV e quindi si avrà che:

Quindi --> se la membrana avesse un potenziale di equilibrio di +58mV, il sodio sarebbe bloccato

all'equilibrio in quanto avremmo a cavallo della membrana un gradiente elettrico uguale e

contrario al gradiente di concentrazione che spinge lo ione a muoversi nella direzione opposta.

Ricapitolando: confronto tra potenziale di diffusione e potenziale di equilibrio

Potenziale di equilibrio:

- La membrana è permeabile ad una sola specie ionica;

- La specie ionica diffusibile è all’equilibrio elettrochimico, cioè il gradiente elettrico è esattamente

uguale a contrario al gradiente chimico dello ione, mantenendo in equilibrio le concentrazioni

degli ioni ai due lati della membrana (vale l’equazione di Nernst);

- Il potenziale di equilibrio si mantiene indefinitamente proprio perché il gradiente di

concentrazione viene bloccato ai due lati della membrana.

Potenziale di diffusione:

- La membrana è permeabile a più specie ioniche, che hanno, tuttavia, permeabilità diverse

attraverso la membrana (poiché se avessero la stessa permeabilità il potenziale sarebbe nullo);

- Le specie ioniche diffusibili non sono all’equilibrio elettrochimico, ciò vuol dire che per ogni

specie il gradiente di potenziale elettrico non è in grado di equilibrare il potenziale chimico (non

vale l’equazione di Nernst)

- Il potenziale di diffusione non si mantiene indefinitamente ma tende a diminuire fino ad

annullarsi con l'annullamento del gradiente di concentrazione ai due lati della membrana.

Equilibrio di Gibbs-Donnan.

Un altro fenomeno elettrico di membrana è un tipo particolare di potenziale di equilibrio, il

cosiddetto equilibrio di Gibbs – Donnan.

Secondo il fisiologo Donnan, tra due soluzioni acquose separate da una membrana che sia

impermeabile ad uno solo dei soluti si stabilisce un equilibrio (equilibrio di Donnan) garantito da

una differenza di potenziale transmembranaria che mantiene costante la concentrazione degli ioni

ai due lati della membrana.

Una conseguenza dell’equilibrio di Donnan è che tra i due compartimenti si stabilisce una

differenza di pressione osmotica: la pressione osmotica è maggiore nel compartimento contenente

lo ione non diffusibile. Immaginiamo, infatti, di avere un recipiente

diviso da una membrana in due

compartimenti (1 e 2) che contengono,

rispettivamente, una soluzione di KCl ed una

di proteinato di K+ (KPr) in concentrazioni

inizialmente equimolari (10 mM)

Immaginiamo, inoltre, che la membrana sia

permeabile al K+ e al Cl-, ma non al Pr-

(proteinato). Il potassio non ha nessuna

tendenza a muoversi, mentre il cloruro si

muove secondo gradiente di concentrazione dall'ambiente 1 al 2. Le frecce nere indicano i flussi

secondi il gradiente di concentrazione, le frecce bianche indicano flussi secondo gradiente

elettrico.

1) Gli ioni Cl- diffondono da 1 a 2 secondo il loro gradiente di concentrazione, ma così facendo

creano un gradiente elettrico che li spinge in direzione opposta: tendono, cioè, a depositare

cariche negative sul lato esterno della membrana e cariche negative sul lato interno.

2) Il gradiente elettrico creato dalla diffusione degli ioni Cl- richiama ioni K+ (che inizialmente

abbiamo detto non aveva nessun gradiente favorevole al suo movimento) da 1 a 2, ma così

facendo gli ioni K+ creano un gradiente di concentrazione che li spinge in direzione opposta e

quindi verso il compartimento 2.

Quando i flussi unidirezionali contrapposti diventano uguali sia per il K+ che per il Cl-, il flusso

netto transmembranario diventa pari a 0 sia per il K+ che per il Cl.

In queste condizioni la differenza di potenziale che si instaura a cavallo della membrana coincide

con il potenziale di equilibrio dei due ioni (EK = ECl) previsto dall’equazione di Nerst.

Dal momento che zK = 1 e zCl = -1, ne consegue che risolvendo le due equazioni togliendo i

logaritmi si avrà che il rapporto delle concentrazioni di potassio nel compartimento 1 e nel

compartimento 2 è uguale al rapporto delle concentrazioni di cloruro nel compartimento 2 e nel

compartimento 1.

Ma questo cosa significa?

Per il principio dell’elettroneutralità delle soluzioni, in ogni soluzione il

numero di ioni positivi è uguale al numero di ioni negativi.

Pertanto nel compartimento 1 si avrà: [K+]1 = [Cl-]1

mentre nel compartimento 2 si verificherà che: [K+]2 = [Cl-]2 + [Pr-]2

Quindi, la concentrazione totale degli ioni diffusibili (K+ è Cl-) è maggiore dal

lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr-): [K+]2+[Cl-]2>[K+]1+[Cl-]1

Cosa comporta l’ equilibrio di Gibbs-Donnan?

Nel momento in cui si instaura un equilibrio di Gibbs – Donnan, se

inizialmente ho una condizione di isoosmolarità, mi ritrovo poi di fronte ad

uno squilibrio osmotico, perché si verifica un accumulo di soluti diffusibili dal

lato in cui ci sono gli ioni impermeabili. Alla fine, quindi, le due soluzioni diventano una più

iperosmotica rispetto all'altra (si crea una differenza di pressione osmotica che tende a richiamare

acqua per diluire il compartimento 2).

All’interno di una cellula vi sono molti anioni osmoticamente attivi piuttosto impermeabili, tipo

proteinati e nucleotidi. Un equilibrio di Gibbs-Donnan porterebbe a una disparità di pressione

osmotica tra l’interno e l’esterno della cellula. Lo squilibrio osmotico causerebbe l’ingresso

d’acqua e lo scoppio della cellula.

Perché una cellula non subisce un rigonfiamento osmotico per effetto Donnan e infine non si

rompe?

Una spiegazione è che la cellula pompa attivamente Na+ esternamente tramite la pompa sodio

potassio ATPasi, riducendo la pressione osmotica nel citoplasma e incrementando quella del

liquido extracellulare.

Come si genere il potenziale di membrana a cavallo della membrana plasmatica di una cellula?

A cavallo della membrana plasmatica, quindi tra la superficie intra- ed extracellulare del doppio

strato fosfolipidico, di tutte le cellule esiste una differenza di potenziale detta potenziale di

membrana.

Esempi di potenziale di membrana misurati in diversi tipi di cellule.

L’assone gigante di calamaro è stato

ampiamente utilizzato dai primi fisiologi per lo

studio del potenziale di azione infilandoci un filo

di argento rivestito di cloruro di argento.

Come si può misurare questa differenza di

potenziale? La differenza di potenziale

esistente tra i due lati della membrana

plasmatica può essere misurata

sperimentalmente inserendo un elettrodo

in una cellula ed un secondo elettrodo nel

liquido extracellulare. I due elettrodi

saranno poi collegati ad un voltmetro.

Per convenzione l'elettrodo extracellulare

fa da terra, cioè da riferimento ed è

settato a 0 mV. Se l'elettrodo

extracellulare è macroscopico, l'elettrodo

inserito in cellula è microscopico, tale da adeguarsi alle dimensioni cellulari. E' costituito da una

micropipetta riempita da una soluzione elettrolitica in cui è immerso un filo d'argento collegato al

voltmetro.

La differenza di potenziale a cavallo della membrana plasmatica è generalmente negativa verso il

citoplasma e positiva verso l'esterno della cellula. Il suo valore assoluto varia a seconda del tipo

cellulare. Nelle cellule nervose è mediamente intorno a -70 mV.

Il potenziale di membrana rappresenta una delle caratteristiche più rilevanti della Fisiologia

cellulare: (da sapere bene all’esame) in molte cellule il potenziale di membrana è funzionale al

trasporto transmembranario di metaboliti o sostanze nutritive, alla regolazione del pH

intracellulare e alla regolazione del volume cellulare.

Nelle cosiddette cellule eccitabili, neuroni e cellule muscolari, transitorie variazioni del potenziale

di membrana rappresentano segnali elettrici la cui insorgenza e propagazione sono alla base del

funzionamento del sistema nervoso e di quello muscolare.

Bisogna ricordare sempre che la separazione di cariche a cavallo della membrana plasmatica, detta

potenziale di membrana, avviene solo a cavallo della membrana, mentre il citoplasma e il liquido

extracellulare sono elettroneutre.

Da dove scaturisce il potenziale di membrana? Le diverse ipotesi.

I primi fisiologi si chiesero da dove potesse scaturire questo potenziale di membrana, che è un

fenomeno costante.

Vennero proposte diverse ipotesi.

Essi inizialmente pensarono che, essendo un fenomeno costante, fosse il potenziale di equilibrio.

Ciò che loro sapevano era che il potenziale di membrana fosse un fenomeno dovuto alla

separazione di cariche costante a cavallo della membrana, a livello della quale ci sono diversi ioni

che sono diversamente distribuiti.

in realtà, se noi andiamo a considerare i vari ioni e ne calcoliamo i diversi potenziali di equilibrio e

applichiamo l'equazione di Nerst, osserviamo che nella maggior parte dei casi gli ioni non sono in

equilibrio nel liquido intra ed extracellulare, cioè il potenziale di membrana non coincide con il

potenziale di equilibrio. Quindi, la teoria del potenziale di equilibrio venne scartata poiché non si

riuscì a trovare uno ione per il quale il potenziale di membrana coincidesse con il potenziale di

equilibrio.

Calcolando il potenziale di equilibrio di sodio e cloruro non riesco ad ottenere –90mV.

Infatti, Il Cl-è prossimo al suo equilibrio, Il Na+ è lo ione che si trova più lontano da una

distribuzione di equilibrio.

L'altra ipotesi esplorata fu che si trattasse di un potenziale di Gibbs – Donnan, perché nella cellula

sono presenti anioni impermeanti, ma nemmeno questa ipotesi può essere accettata in quanto fu

dimostrato il passaggio di sodio e potassio ai due lati della membrana, quando invece con Donnan

non si ha un flusso netto da un lato all'altro della membrana: la cellula, infatti, tende a perdere K+

e ad acquisire Na+.

Scartate le ipotesi del potenziale di equilibrio e del potenziale di Gibbs – Donnan, ciò che rimane

da considerare è che il potenziale di membrana sia un potenziale di diffusione. In definitiva:

Cos'è il potenziale di membrana?

Il potenziale di membrana è essenzialmente un potenziale di diffusione che scaturisce:

- dalla ineguale distribuzione di ioni sui due versanti della membrana, quindi nei gradienti di

concentrazione ionica tra ambiente intracellulare ed extracellulare, generati e mantenuti dalla

pompa Na-K-ATPasi;

-dalla diseguale permeabilità agli ioni da parte della membrana plasmatica.

(Per permeabilità si intende la capacità di transito degli ioni attraverso canali ionici specifici)

Gli ioni maggiormente coinvolti nella genesi del potenziale di membrana sono Na+ e K+. Gli ioni

Na+ sono più concentrati nel liquido extracellulare che dentro la cellula, gli ioni K+ sono più

concentrati in cellula che nel liquido extracellulare.

Inoltre, la membrana delle cellule è circa 40 volte più permeabile agli ioni K+ che agli ioni Na,

poiché sono presenti più canali per il potassio. Quindi, risultano soddisfatte le due condizioni

affinchè si generi un potenziale di membrana. 07/11/17, lezione 15

Come si genera il potenziale di membrana? Il K+, essendo più concentrato all'interno della cellula,

ed avendo una elevata permeabilità attraverso

la membrana, tende a fuoriuscire dalla cellula.

Nel momento in cui gli ioni K+ si affacciano sul

versante extracellulare della membrana

caricano positivamente il versante

extracellulare, mentre il versante intracellulare

della membrana stessa si carica negativamente.

Si crea quindi ai due lati della membrana un

gradiente elettrico. Tale gradiente elettrico

rallenta il movimento degli ioni K+, in quanto si

oppone alla loro fuoriuscita.

Se il K+ fosse l'unica specie permeante

attraverso la membrana, la forza elettrica

derivante dalla separazione di cariche a cavallo della membrana diventerebbe di eguale ampiezza

al gradiente di concentrazione chimico che guida gli ioni K+ a uscire dalla cellula. In tali condizioni il

movimento netto di K+ attraverso la membrana si arresterebbe e si raggiungerebbe il potenziale di

equilibrio del K+. In realtà, il valore del potenziale di equilibrio per il K+ calcolato si avvicina ma

non corrisponde al potenziale di membrana, in quanto è più negativo. Questo dipende dal fatto

che la membrana è permeabile, anche se in misura minore, al Na+. Pertanto, la differenza di

potenziale generata dal movimento del K+ accelera il movimento del Na+ facilitando il suo

ingresso in cellula, rendendo, così,il potenziale di membrana meno negativo rispetto al potenziale

di equilibrio del K+.

Pertanto:

a) il flusso netto passivo di Na+in entrata in cellula è uguale a flusso netto passivo di K+ in uscita

dalla cellula

b) non si ha un trasporto netto di cariche da un ambiente all’altro e il principio

dell’elettroneutralità delle soluzioni non è infranto nella massa delle soluzioni in gioco.

Lo ione Cl- nella maggiorparte dei casi è distribuito all’equilibrio.

Le cellule sono almeno 40 volte più permeabili al K+ rispetto al Na+ In quanto una piccola quota di

Na+ riesce ad entrare, la d.d.p. è lievemente più positiva rispetto al pot. di equilibrio del K+ di -90

mV.

Come mai il Potenziale di membrana e le concentrazioni ioniche sono COSTANTI nel tempo ?

La risposta é nell'attività dell Na+/K+ATPasi di membrana che:

1) espellendo attivamente Na+ entrato passivamente e ricaptando K+, mantiene costanti nel

tempo le differenze di concentr. ioniche e di conseguenza indirettamente il pot di membrana;

2) essendo elettrogenica (scambia 3 ioni Na con 2 ioni K) può essa stessa generare un potenziale

elettrico attivo che si addiziona a quello di diffusione di Na+ e K+. Il contributo al potenziale di

membrane derivante dalla elettrogenicità della pompa è di circa il 5%.

Quindi: la pompa Na+-K+ ATPasi genera dei controflussi attivi che controbilanciano i flusso passivi

degli ioni Na+ e K+ attraverso i rispettivi canali.

Quando un certo numero di ioni si distribuisce ai lati di una membrana, e tutti sono lontani dal

loro equilibrio elettrochimico, ognuno tenderà a spostare il potenziale di membrana verso il suo

potenziale di equilibrio (di Nernst). Più permeabile è la membrana ad un particolare ione,

maggiore è la forza con cui quello ione tende a portare il potenziale di membrana verso il proprio

potenziale d’equilibrio

Il potenziale di membrana è stabile solo se l’afflusso di sodio è esattamente controbilanciato

dall’efflusso di potassio. Dal punto di vista elettrico vuol dire che:

Cioè la somma di tutte le correnti ioniche attraverso la membrana è 0.

Per la prima legge di Ohm: i= E/R, cioè la corrente elettrica è pari al rapporto tra la differenza di

potenziale tra due punti e la resistenza.

R è il reciproco della conduttanza ed essendo R = 1/g --> i= E x g

In cui:

• g = conduttanza che si esprime in S/cm2(mSo μS o pS/cm2);

• Em = potenziale elettrico stazionario della membrana

La forza elettromotrice che fa muovere gli ioni è pari alla differenza tra il potenziale di membrana

e il suo potenziale di equilibrio: Em–Ek

Quindi, la corrente di ogni singolo ione si può esprimere così (applicando la formula i = E x g)

iK = gk (Em – Ek);

iNa = gNa (Em – ENa);

iCl = gCl (Em – ECl).

Considerando Na, K e Cl, la differenza di potenziale a cavallo della membrana sarà data dalla

EQUAZIONE DELLA CONDUTTANZA DI MEMBRANA. Essa si ottiene riprendendo l'equazione

si sostituisce al posto della I la formula della corrente e ri risolve rispetto al potenziale di

membrana.

Quanto maggiore è il rapporto "gK/sommatoria di g" tanto maggiore è il contributo dello ione sul

potenziale di membrana.

Conduttanza e permeabilità sono due grandezze fisiche diverse che esprimono concetti molto

vicini e sono strettamente correlati. La permeabilità misura la velocità con cui

lo ione passa la membrana e dipende dai

canali ionici. La conduttanza è una

misura della facilità con cui una corrente

ionica può attraversare una membrana;

è una grandezza che dipende dalla

permeabilità, ma anche dagli ioni che

possono fluire perché scaturisce dalla

legge di Ohm. Se ci sono pochi ioni la

conduttanza è modesta anche se la

permeabilità è alta. Se aumenta il numero di ioni, a parità di permeabilità aumenta anche la

conduttanza. 08/11/17, lezione 16

Equivalente elettrico della membrana La membrana cellulare manifesta una differenza di

potenziale negativa verso il lato citoplasmatico della

membrana. In termini elettrici è come se le due

superfici della membrana corrispondessero ai due poli

di una pila elettrica, il cui polo negativo è situato

all’interno della cellula e quello positivo verso

l’esterno. Il tutto si sviluppa nei 5nm di spessore del

bilayer fosfolipidico. Il doppio strato lipidico,

impermeabile agli ioni, agendo come isolante

conferisce alla membrana una capacità elettrica,

pertanto può essere assimilato ad un condensatore le

cui armature sono rappresentate dalle superfici della

membrana rivolte rispettivamente verso il lato extracellulare ed intracellulare.

I canali ionici attraverso cui passano le cariche elettriche dotano la membrana di una propria

conduttanza elettrica. Infatti, la permeabilità del canale nei confronti dello ione può essere

rappresentato da un punto di vista elettrico con un resistore ovvero con il suo inverso la

conduttanza.

Queste proprietà elettriche della membrana possono essere convenientemente rappresentate

tramite un circuito equivalente in cui un condensatore è collegato in parallelo con una resistenza.

Pertanto, un canale e il gradiente di concentrazione dello ione permeante che lo attraversa

possono essere rappresentati da un punto di vista elettrico come costituiti rispettivamente da un

resistore e da una batteria in serie. Circuito elettrico equivalente di una

membrana biologica che presenta le

conduttanze del Na+ e del K+. Tutte le

rimanenti conduttanze sono sommate insieme

come 1/gT. Le pile di concentrazione ENa e EK

sono in serie alle rispettive conduttanze e con

polarità opposte.

Potenziali graduati e potenziali d’azione.

Le cellule nervose comunicano attraverso due tipi di segnali elettrici rappresentati da variazioni

del potenziale di membrana che a loro volta sono determinate dall’apertura o dalla chiusura di

canali ionici provvisti di gate (porte):

1) Potenziali graduati, che rappresentano piccoli segnali elettrici proporzionati all’intensità dello

stimolo che li ha generati, i quali agiscono a breve distanza, poiché diminuiscono di ampiezza man

mano che ci si allontana dal sito della loro genesi.

2) Potenziali d’azione, che sono segnali di tipo tutto o nulla: costituiti da una rapida e transitoria

inversione di polarità della membrana, che si propaga uguale a sé stessa senza diminuire

d’intensità (a differenza del potenziale graduato) e sono utilizzati soprattutto per propagare

l’informazione su lunghe distanze.

Descrizione delle variazioni del potenziale di membrana

Rappresentando in un sistema di assi cartesiani il potenziale di membrana, possiamo collocare il

potenziale di riposo (-70mV) compreso tra il potenziale di equilibrio del sodio e quello del potassio.

I segnali elettrici sono dovuti a variazioni del potenziale di membrana. Essi si generano quando, in

risposta a particolari stimoli, si aprono o si chiudono alcuni canali ionici con gate. Quando i canali

con gate si aprono o si chiudono, cambia la permeabilità ad alcuni ioni, modificandone il

movimento attraverso la membrana e conseguentemente modificando il potenziale di membrana.

Poiché il potenziale di membrana rappresenta la differenza di potenziale tra i due lati della

membrana, si dice che la membrana è polarizzata in condizioni di riposo.

Dal momento che il potenziale ha un valore negativo (circa -70 mV nei neuroni), un cambiamento

verso valori più negativi è detto iperpolarizzazione, in quanto la membrana diventa più polarizzate.

Un cambiamento verso valori meno negativi determina una depolarizzazione della membrana, in

quanto la membrana diventa meno polarizzate. La ripolarizzazione si verifica quando il potenziale

di membrana ritorna al valore di riposo dopo una depolarizzazione.

Caratteristiche generali dei potenziali graduati.

I potenziali graduati rappresentano piccole modificazioni del potenziale di membrana che si

verificano quando i canali ionici provvisti di gate si aprono o si chiudono in risposta a segnali

specifici.

Gli stimoli che producono segnali graduati possono essere:

- Stimoli chimici (come quelli prodotti dai neurotrasmettitori che si legano a recettori

localizzati sulla membrana postsinaptica)

- Stimoli sensoriali (a livello dei recettori sensoriali)

L’ampiezza della variazione del potenziale di membrana viene graduata in funzione dell’intensità

dello stimolo che l’ha generata: uno stimolo debole produce un piccolo cambiamento del

potenziale di membrana, mentre uno stimolo più intenso provoca una variazione del potenziale di

membrana di maggiore ampiezza.

Potenziali graduati L’ampiezza della variazione del potenziale di

membrana viene graduata in funzione

dell’intensità dello stimolo che l’ha generata:

uno stimolo debole produce un piccolo

cambiamento del potenziale di membrana,

mentre uno stimolo più intenso provoca una

variazione del potenziale di membrana di

maggiore ampiezza.

I potenziali graduati possono propagarsi dal

punto di stimolazione per brevi distanze, in quanto sono eventi che si attenuano con la distanza

dal puto in cui si generano.

Alcuni potenziali graduati sono depolarizzanti, mentre altri sono iperpolarizzanti. La direzione della

variazione del potenziale dipende dal tipo di neurone interessato, dallo stimolo applicato e dal tipo

di canale ionico che si apre o si chiude in risposta allo stimolo stesso.

Cellule eccitabili

La modalità di segnalazione basata su potenziali d’azione è utilizzata oltre che nei neuroni anche in

altri tipi di cellule, come le cellule del muscolo scheletrico e cardiaco. In riferimento alla proprietà

di poter sviluppare potenziali d’azione, neuroni, cellule muscolari scheletriche e cellule muscolari

cardiache sono definite cellule eccitabili. In tali cellule il potenziale di membrana (negativo

all’interno della cellula) prende il nome di potenziale di riposo poiché caratterizza lo stato di riposo

della cellula.

Neurone. Ciascun neurone è formato da un corpo cellulare,

detto pirenoforo o soma, da cui si dipartono uno o

più processi citoplasmatici atti alla ricezione di

impulsi, i dendriti, ed un prolungamento

citoplasmatico deputato alla trasmissione di

impulsi: l’assone (l’assone viene anche indicato con

il termine di fibra).

Il corpo cellulare del neurone ha una struttura simile a quelle

delle altre cellule, dal momento che esso contiene un nucleo,

l’apparato del Golgi, il reticolo endoplasmico e i mitocondri. Il

corpo cellulare assolve la maggior parte delle funzioni svolte

dalle altre cellule, come la sintesi proteica e il metabolismo

cellulare.

Il neurone è caratterizzato dalla presenza di due tipi di

prolungamenti, noti rispettivamente come dendriti e assoni. I

dendriti sono sottili e molto ramificati. Insieme al corpo

cellulare, i dendriti fanno parte della zona ricevente del

neurone. Gli assoni sono generalmente più grandi e lunghi dei

dendriti, originano dal pirenoforo a livello del monticolo

assonico e si possono ramificare ripetutamente, ciascuna

ramificazioni termina con un rigonfiamento a forma di

bottone: la terminazione sinaptica o bottone sinaptico che consentirà il collegamento con un altro

neurone.

Regionalizzazione delle funzioni nel neurone.

I dendriti rappresentano la zona di ricezione dei potenziali sinaptici (graduali) eccitatori ed

inibitori. Questi vengono integrati nel soma e possono dar luogo ad un impulso nervoso nel

monticolo assonico. L’ impulso viene propagato rapidamente lungo l’assone (zona di conduzione)

per raggiungere le terminazioni nervose, zona specializzata nella liberazione del

neurotramettitore.

La regionalizzazione delle funzioni del neurone è dovuta alla presenza di canali ionici differenti tra

soma e dendriti da un lato e assone dall’altro lato. A livello dell’assone sono presenti canali del

Na+ e del K+ voltaggio dipendenti, cioè dotati di un sistema di gate che si aprono in risposta alla

variazione del potenziale di membrana e sono i responsabili della genesi del potenziale d’azione.

Tali canali sono assenti nella membrana

plasmatica del soma e dei dendriti, dove, invece, si

ritrovano canali stimolo-dipendente che danno

luogo a potenziali graduati.

Principali tipi morfologici di cellule nervose.

I neuroni, a seconda del numero e disposizione di assone e dendriti, si possono dividere in:

neuroni unipolari: sono presenti nella vita fetale. Nell’adulto sono rappresentati solo dai neuroni

sensitivi dell’olfatto e dai coni e bastoncelli della retina. Sono sprovvisti di dendrite e il solo

prolungamento, centrale al pirenoforo, funziona da assone.

neuroni pseudounipolari: sono neuroni con il pirenoforo a forma di goccia, dotati di un solo tratto

prolungamento che, successivamente, si divide a T formando, così, un assone e un dendrite.

Tipico esempio sono i neuroni dei gangli sensitivi spinali e dei gangli sensitivi dei nervi cranici.

neuroni bipolari: il loro pirenoforo ha forma ellittica con due prolungamenti, l’assone e il dendrite,

posti ai poli della cellula. Li troviamo nel ganglio spirale, nel ganglio vestibolare e nella retina.

neuroni multipolari: sono di forma poliedrica proprio perché dal pirenoforo si dipartono un assone

e due o più dendriti. Rappresentano il tipo di neurone più comune presente nel tessuto nervoso.

Trasporto assonale

I neuroni presentano meccanismi di trasporto per mobilitare prodotti sia dal corpo cellulare al

terminale assonale (trasporto anterogrado), che dal terminale assonale al corpo cellulare

(trasporto retrogrado). Il trasporto di vescicole dal soma al

terminale assonale avviene grazie ai

microtubuli che si estendono per tutta la

lunghezza dell’assone e svolgono il ruolo di

«binari» per le molecole trasportatrici.

Queste sono rappresentate da chinesine e

dineine, che, utilizzando l’idrolisi di ATP,

essenzialmente «camminano» sui «binari»

costituiti dai microtubuli. Le chinesine

intervengono nel trasporto anterogrado, le

dineine nel trasporto retrogrado.

Nel SNC non abbiamo solo i neuroni.

Le cellule della neuroglia sono molto più numerose dei neuroni e, contrariamente ai neuroni,

mantengono la capacità di proliferare. Esse hanno funzione di supporto e cooperazione nelle

funzioni neuronali. Ne SNC abbiamo oligodendrociti, astrociti, microglia, cellule ependimali, nel

SNP cellule di Schwann e cellule satelliti.

Astrociti. Gli astrociti sono presenti nel SNC dove rappresentano il maggior supporto fisico ai

neuroni e contribuiscono a determinare la barriera emato-encefalica. Hanno una forma stellata

con diversi prolungamenti che terminano con dei pedicelli.

Oligodendrociti e cellule di Schwann. Oligodendrociti e cellule di Schwann sono deputate alla

formazione della guaina mielinica che riveste l’assone di numerosi neuroni rispettivamente nel

sistema nervoso centrale e in quello periferico

I microgliociti si occupano della prima e principale difesa immunitaria attiva nel sistema nervoso

centrale. si muovono costantemente e analizzano il SNC in cerca di neuroni danneggiati, placche e

agenti infettivi.

IL POTENZIALE D'AZIONE

Il potenziale d’azione consiste in una repentina e transitoria variazione del

potenziale di membrana che si genera nelle cellule eccitabili in risposta a

potenziali graduati che raggiungono il valore soglia, ossia quel valore del

potenziale di membrana che è critico per l’innesco del potenziale d’azione.

Durante il potenziale d’azione si verifica un’ampia e rapida

depolarizzazione durante la quale si registra per un breve periodo

un’inversione della polarità del potenziale di membrana.Nel neurone il

potenziale d’azione prende origine dal tratto iniziale dell’assone detto

monticolo assonico o segmento iniziale o zona trigger e corre lungo

l’assone fino al terminale assonico senza attenuazione della sua intensità.

Il potenziale d’azione si innesca nel tratto iniziale

dell’assone (cono d’emergenza) quando un

potenziale graduato, che rappresenta una

variazione del potenziale di membrana a livello dei

dendriti o dal soma del neurone, raggiungendo il

cono d’emergenza, depolarizza la membrana fino

al valore soglia (-55 mV).

A questo punto si innesca il potenziale d’azione

che consta di tre fasi distinte:

1) Depolarizzazione rapida

2) Ripolarizzazione

3) Iperpolarizzazione postuma

L’ampiezza del potenziale d’azione è indipendente dalla grandezza dello stimolo, ovvero se lo

stimolo è abbastanza grande da superare la soglia, il potenziale viene evocato con ampiezza e

forma costante.

1) Depolarizzazione rapida

Durante questa fase il potenziale di membrana passa dal valore soglia di -55 mV a + 30 mV. Questa

fase si caratterizza per un rapido e brusco aumento della conduttanza della membrana al Na+. Il

Na+ entra in cellula perché sospinto dal suo gradiente di potenziale elettrochimico.

A causa dell’elevata conduttanza della membrana al Na+, il potenziale di membrana tende ad

avvicinarsi al potenziale di equilibrio di tale ione (+58 mV).

Al picco della fase ascendente la membrana ha cambiato polarità: il versante intracellulare è più

positivo di quello extracellulare. Questo cambiamento è rappresentato sul grafico dall'overshoot,

cioè dalla porzione di potenziale d'azione che è al di sopra di 0 mV.

2) Ripolarizzazione

La seconda fase del potenziale d’azione è la ripolarizzazione della membrana, durante la quale il

potenziale di membrana, dal valore di +30 mV ritorna al valore di riposo di -70mV.

Nell’arco di 1 msec, dopo l’iniziale incremento della conduttanza al Na+, questa diminuisce

rapidamente fino ad annullarsi, mentre nel frattempo sta aumentando la conduttanza al K+.

Pertanto, il K+ fuoriesce dalla membrana secondo il suo gradiente elettrochimico, ripolarizzando la

membrana fino a raggiungere il potenziale di riposo.

Quindi, la fase di ripolarizzazione del potenziale d'azione è legata ad un aumento della

permeabilità al K+. Infatti anche i canali voltaggio dipendenti del K+ si aprono in risposta alla

depolarizzazione soglia iniziale, ma sono più lenti, perciò il picco di permeabilità del K+ viene

raggiunto più tardi rispetto a quello del Na+. Quando i canali per il K+ finalmente si aprono il

potenziale di membrana ha raggiunto +30 mV grazie all’ingresso del Na+. In queste condizioni il K+

è spinto ad uscire dalla cellula sia dal suo gradiente di concentrazione che dal gradiente elettrico.

L’uscita di K+ dalla cellula riporta il potenziale di membrana al valore di riposo.

3) Iperpolarizzazione postuma

Nel corso di tale fase la conduttanza al K+ rimane elevata per un breve periodo dopo che il

potenziale di membrana ha raggiunto il proprio valore di riposo. Durante tale periodo il potenziale

di membrana è più negativo che in condizioni di riposo, avvicinandosi al potenziale di equilibrio del

K+.Quando i canali del K+ voltaggio dipendenti si chiudono e si ripristina una normale permeabilità

al K+ il potenziale di membrana ritorna al valore di riposo di –70 mV.

Per capire meglio il decorso del potenziale d’azione lo confrontiamo con il decorso delle

conduttanza per il sodio e il potassio. La variazione del potenziale di membrana

che caratterizza le diverse fasi del

potenziale d’azione è dovuta a variazioni

di conduttanza al Na+ e al K+, le quali a

loro volta sono dovute all’apertura e alla

chiusura, temporalmente coordinate, dei

canali voltaggio-dipendenti per il Na+ e

per il K+.

Dall’analisi delle curve di conduttanza del

Na+ e del K+ durante il decorso del

potenziale d’azione, si osserva che è

proprio un aumento transitorio della

conduttanza al Na+ l’evento responsabile dell’innesco del potenziale d’azione. Tale incremento è

determinati dall’apertura dei canali del Na+ voltaggio dipendenti in corrispondenza del

raggiungimento della soglia.

In condizioni di riposo, gran parte dei canali del sodio sono chiusi. Essi si aprono in corrispondenza

della depolarizzazione della membrana, sono perciò voltaggio-dipendenti. Quando la membrana

da un potenziale graduato fino al raggiungimento di un valore soglia, si attivano i canali voltaggio-

dipendenti del sodio, entrano gli ioni sodio e l’interno della cellula diventa ancora meno negativo

cosa che a sua volta provoca a sua volta un ulteriore aumento della conduttanza. Questo processo

a feedback positivo continua fino a che il potenziale di membrana non raggiunge un valore vicino

al potenziale di equilibrio del Na+. In corrispondenza di questo valore il flusso di ioni Na+ termina.

09/11/17, lezione 17

Funzionamento dei canali per il Na+ voltaggio-dipendenti

I canali del Na+ voltaggio dipendenti hanno due gate detti rispettivamente di attivazione e di

inattivazione costituiti da porzioni amminoacidiche cariche e sensibili, pertanto, al valore del

potenziale di membrana.

Il gate di attivazione è responsabile dell’apertura del canale del Na+ durante la fase di

depolarizzazione, mentre la porta di inattivazione è responsabile della chiusura dei canali del Na+

durante la fase di ripolarizzazione.

Vediamo più in dettaglio il ciclo di funzionamento del canale.

Entrambi i gate si aprono e si chiudono in risposta a modificazioni del potenziale di membrana e, in

base alla posizione delle porte, il canale del Na+ può trovarsi in una delle seguenti tre

conformazioni: Gate di inattivazione aperto e gate di attivazione chiuso: il

canale si trova nella conformazione di chiuso ma attivabile.

Questa è la condizione di riposo per il neurone, in cui il canale

del Na+ è in posizione chiusa ma in grado di aprirsi in risposta ad

uno stimolo depolarizzante soglia, cioè il canale è chiuso ma è

pronto ad aprirsi in risposta ad uno stimolo depolarizzante

soglia.

Se arriva uno stimolo depolarizzante si passa nella conformazione b.

Gate di inattivazione aperto e gate di attivazione

aperto: il canale si trova nella conformazione di

aperto. Questa conformazione si osserva durante la

fase di depolarizzazione. Entrambi i gate sono aperti

e gli ioni sodio possono fluire.

Dopo circa un millisecondo, in seguito al flusso di ioni

sodio si passa alla conformazione c.

Gate di inattivazione chiuso e gate di attivazione aperto:

il canale si trova nella conformazione di chiuso e

inattivabile. Questa è la conformazione che caratterizza

la fase di ripolarizzazione. La porta di inattivazione

rimane chiusa finché il potenziale di membrana non

ritorna ad un valore prossimo al potenziale di riposo.

La rapida depolarizzazione che si verifica durante la fase

ascendente del potenziale d’azione determina la

chiusura del cancello di inattivazione, che normalmente

è tenuto aperto da potenziali negativi, per cui il

potenziale d’azione si ferma al valore di +30 mV. La chiusura del cancello di inattivazione arresta il

feedback positivo. Se non intervenisse nessun fenomeno, questo feedback si arresterebbe al

potenziale di equilibrio del sodio, ma la cosa non avviene perchè si chiude la porta di inattivazione,

perchè le cariche che lo costituiscono sono sensibili a quel valore.

Tra l’apertura del cancello di attivazione e quella del cancello di inattivazione decorrono 0.5 ms

sufficienti a determinare la fase ascendente del potenziale d’azione.

L’apertura della porta di attivazione è un processo rigenerativo, in quanto rigenera a sua volta

l’apertura della porta di attivazione di altri canali del Na+. Infatti, all’inizio la depolarizzazione

soglia determina l’apertura di pochi canali del Na+, con conseguente afflusso di Na+ nella cellula.

Ciò causa a depolarizzazione della membrana e causa l’apertura di ulteriori canali del Na+,

portando ad un maggiore afflusso di Na+ e ad una maggiore depolarizzazione. Questo feedback

positivo si arresta quando la porta di inattivazione si chiude.

Canali del SODIO VOLTAGGIO DIPENDENTI.

Elementi caratterizzanti di tali canali sono:

- 4 domini della subunità alfa disposte in cerchio ognuna con 6

STM;

- Il filtro di selettività dato dalla giustapposizione delle 4 regioni

P interposta tra S5 ed S6;

- Le gates di attivazione disposte all’imboccatura citoplasmatica

del canale;

- I sensori del voltaggio: i 4 STM S4

- Le gates di inattivazione.

I canali del sodio sono costituiti da una grossa subunità alfa che si associa ad altre proteine come

le subunità beta.

La subunità alfa forma il cuore del canale e funziona per se stessa. Essa ha quattro domini ripetuti I

II III IV e ognuno contiene 6 regioni transmembrana (da S1 a S6). Il filtro di selettività del canale è

determinato dall’ansa P di ogni dominio che riveste il lato interno del canale.

La regione S4 di ogni dominio, altamente conservata, agisce come sensore di voltaggio del canale.

La sensibilità al voltaggio della regione S4 è dovuta all’elevata presenza di aa positivi (in particolare

arginina). Quando vengono stimolati da una depolarizzazione della membrana, questa regione si

muove verso il lato esterno influenzando il gate di attivazione e facendo sì che il canale diventi

permeabile agli ioni.

Il gate di attivazione è a sua volta l’estensione, verso il lume del canale, del segmento S6 di ciascun

dominio. Le 4 gates che a riposo (canale chiuso) si incrociano chiudendo il canale, quando

interviene l’apertura vengono ribaltate all’esterno e rendono così possibile l’accesso agli ioni.

Il gate di inattivazione è rappresentato da una porzione citoplasmatica del canale (ansa che

connette i domini III e IV) che occlude il poro legandosi ad una regione adiacente (il sito di

attracco). Il sito di attracco a sua volta è formato da regioni multiple comprendenti l’ansa

citoplasmatica che connette S4 a S5 dei domini III e IV e l’estremità citoplasmatica di S6 nel

dominio IV. Anch’esso è dotato di amminoacidi carichi positivamente che lo rendono sensibile al

voltaggio.

Funzionamento dei canali per il K+ voltaggio-dipendenti

I canali del K+ voltaggio dipendenti presentano un solo “cancello” che risponde alla

depolarizzazione prolungata aprendosi. Hanno una cinetica di apertura più lenta rispetto ai canali

del Na+. Quando la membrana si ripolarizza il canale si chiude.

Sono costituiti da 4 subunità disposte in cerchio a

formare il canale. Ogni subunità è composta da 6

segmenti transmembrana. Il segmento tra la

quinta e la sesta alfa elica (P loop) si trova al

centro del poro e determina la selettività degli

ioni.

A livello della quarta alfa elica c’è il segmento che funge da sensore del voltaggio formato da

diversi amminoacidi tra cui l arginina a contatto con amminoacidi idrofobici che si muove in

seguito alle variazioni del potenziale provocando l’apertura del canale.

La chiusura del canale del potassio è dovuta all’azione di tappo

di un peptide che costituisce l’estremità ammino terminale della

subunità a (una “ball”; in realtà 4: una per subunità), collegato

alla restante parte della molecola da un tratto flessibile (una

“chain”): meccanismo del tipo “ball and chain”. Il peptide è

dotato di cariche positive che prenderebbe contatto con cariche

negative speculari posizionate all’imboccatura intracellulare del

canale andando a chiudere il canale. 14/11/17, lezione 18

La schematizzazione del ciclo di Hodgking è la relazione circolare tra il potenziale di membrana e la

conduttanza al sodio e al potassio.

Le variazioni di conduttanza di membrana che portano ad una

repentina variazione del potenziale di membrana sono state

schematizzate da Hodgking nel cosiddetto "ciclo di Hodgking",

che altro non è che una rappresentazione sintetica di ciò che

accade durante il potenziale d'azione. Uno stimolo soglia, se è in

grado di depolarizzare la membrana fino ad un valore soglia tale

da indurre l'apertura dei canali del sodio voltaggio dipendenti,

porta all'apertura di questi canali, aumenta la corrente di sodio e

si aprono ancora più canali con un meccanismo di feedback

positivo. Quindi, con un rapido circuito a retroazione positiva si

ha l'incremento di depolarizzazione tanto da portare ad un

inversione del potenziale di membrana. Si ha poi una fase di

feedback negativo sostenuta dall'apertura dei canali del potassio

voltaggio dipendenti che a sua volta determinano un aumento

della corrente di potassio iperpolarizzante che fa riportare il

potenziale di membrana al valore iniziale.

La caratteristica che contraddistingue il potenziale d'azione dai potenziali graduati è il principio del

<<tutto o nulla>> del potenziale d'azione, secondo cui: se una membrana è depolarizzata fino al

valore soglia o oltre, si genera un potenziale d’azione che ha sempre la stessa ampiezza (anche se

lo stimolo iniziale è più intenso dello stimolo soglia). Se la membrana non è depolarizzata fino al

valore soglia, non si genera alcun potenziale d’azione.

Lo stimolo soglia.

Lo stimolo soglia è quello stimolo che fornisce alla membrana una quantità di carica q tale da

depolarizzare la membrana stessa ad un valore del potenziale di membrana tale da determinare

l’apertura dei canali del Na+ voltaggio-dipendenti; in particolare si aprirà la porta di attivazione di

questi canali: il canale passerà così dalla conformazione di chiuso e attivabile alla conformazione di

aperto.

La quantità di carica q è pari al prodotto della corrente fornita (alla zona trigger del neurone) per il

tempo. Pertanto è possibile ottenere uno stimolo soglia variando la corrente o il tempo (q=i x t).

Reobase e cronassia Se esprimiamo in un sistema di assi cartesiani le

caratteristiche dell'impulso che bisogna fornire ad

una fibra nervosa per innescare il potenziale

d'azione, si può costruire una curva in cui ogni punto

della curva corrisponde ad una certa intensità di

corrente somministrata per un certo tempo.

L'asintoto parallelo all’asse del tempo è la reobase.

La reobase è la minima intensità di uno stimolo

elettrico, applicata per un tempo molto lungo a una

fibra nervosa o muscolare, capace di produrre un

potenziale d'azione. Il tempo necessario per

produrre un impulso con una corrente di intensità

doppia della reobase è detto cronassia e fornisce

una misura della eccitabilità della fibra.

L’utilità del conoscere la cronassia è il fatto che la cronassia è la misura dell’eccitabilità (espressa in

millesimi di secondo) di un tessuto stimolato mediante corrente continua. Più piccolo è il tempo di

cronassia di un tessuto, più esso è eccitabile.

Accomodazione della soglia L'accomodazione della soglia consiste in un

aumento del potenziale soglia per un neurone

sottoposto a stimolazioni la cui intensità cresce

lentamente. Se invece di fornire un impulso

rettangolare di corrente fornisco una corrente che

tende ad aumentare lentamente nel tempo,

anche la soglia tende ad aumentare nel tempo.

In un sistema di assi cartesiani abbiamo l’intensità

di corrente somministrata sperimentalmente al

neurone in funzione del tempo. se do un impulso

rettangolare di corrente, ho il valore soglia che in

questo caso sarebbe il valore dell'intercetta

sull'asse y. Se si fornisce una corrente che cresce molto velocemente (a) che ha una tendenza

molto alta e cambia rapidamente nel tempo, si ha che il potenziale soglia è vicino, simile a quello

normale (quello rettangolare che abbiamo detto essere l'intercetta sull'asse y). Se si fornisce una

corrente che aumenta di intensità lentamente, il potenziale soglia si innalza.

Sperimentalmente la curva della soglia viene ottenuta usando correnti progressive, cioè correnti

che aumentano l’intensità in modo lineare(a, b, c,d). Il raggiungimento della soglia viene segnalata

dalla insorgenza dell’impulso nervoso(o potenziale d’azione). Le correnti a, b, c sono soglia ai fini

della genesi del potenziale d’azione, ma la corrente a è più efficace e più rapida nel generare

l’impulso nervoso. La corrente d è talmente lenta che risulta essere inefficace nel generare il

potenziale d’azione perché nel frattempo è cambiata la soglia, nel senso che durante la

stimolazione la soglia è aumentata e quindi non si riesce a raggiungerla.

In conclusione le correnti soglia più efficaci ai fini della stimolazione sono quelle più rapide, che di

conseguenza determinano una maggiore velocità di propagazione del potenziale d’azione.

Ricorda: nel caso dell'accomodazione della soglia sto utilizzando correnti di intensità crescente,

mentre se devo misurare reobase e cronassia sto somministrando impulsi "rettangolari" di

corrente e non do impulsi che crescono nel tempo, e quindi non ho il tempo di innescare il

fenomeno dell'accomodazione.

A cosa è dovuta l’accomodazione della soglia?

E’ dovuta ai canali del Na+ e del K+ voltaggio dipendenti. Infatti, se la depolarizzazione è

sufficientemente lenta, alcuni canali del Na+, apertisi durante la depolarizzazione, hanno un

tempo sufficiente per essere inattivati con il prolungarsi della depolarizzazione. Pertanto, se la

depolarizzazione è sufficientemente lenta, non si ha la normale cinetica di apertura e chiusura

delle porte, ma i canali hanno il tempo di attivarsi e allo stesso tempo di inattivarsi. Allo stesso

tempo, visto che la depolarizzazione della membrana sta aumentando lentamente, i canali del K+

si aprono. L’incremento di conduttanza al K+ tende a ripolarizzare la membrana rendendola

ancora più refrattaria alla depolarizzazione.

In definitiva: questa lenta depolarizzazione agisce sia a livello dei canali del sodio (per cui alla fine

non ho un numero di canali sufficientemente aperti per garantire un potenziale d’azione) che a

livello dei canali del potassio (che hanno il tempo di aprirsi): la soglia tende ad aumentare: tanto è

più lenta al crescita della corrente che si somministra, tanto maggiore è questo fenomeno di

accomodazione della soglia.

Periodo refrattario. Riconsiderando nuovamente il grafico del potenziale di

membrana in funzione del tempo, si può descrivere una

nuova caratteristica del potenziale d’azione, cioè il

fenomeno della refrattarietà. La refrattarietà del

neurone si riferisce al fatto che, una volta che sia stato

avviato un potenziale d’azione, per un tempo di circa 1

ms un secondo potenziale d’azione non può nuovamente

ripartire per quanto sia intenso lo stimolo. Questo viene

definito periodo refrattario assoluto del potenziale

d’azione e corrisponde alla fase 1 (cioè alla fase di rapida

ascesa del potenziale d’azione) e in parte anche alla fase

2 (fase di ripolarizzazione)

Immediatamente dopo il periodo refrattario assoluto, si verifica il periodo refrattario relativo in

cui un potenziale graduato più intenso di quello necessario a raggiungere il valore soglia (stimolo

sovra soglia) può avviare un secondo potenziale d’azione. Il periodo refrattario relativo dura 5-15

ms.

A cosa è dovuto il periodo refrattario assoluto?

Il periodo refrattario assoluto è dovuto ai canali voltaggio dipendenti per il sodio. Infatti, durante

la fase 1 di rapida depolarizzazione i canali voltaggio dipendenti per il Na+ sono tutti aperti e

attivabili; quindi qualsiasi altro stimolo di qualsiasi intensità non può aprirne altri perché lo stimolo

soglia recluta già tutti i canali del sodio voltaggio dipendenti con un meccanismo di feedback

positivo. Inoltre, una volta che la cellula è depolarizzata, i canali del Na+ sono inattivi. In questa

situazione qualsiasi stimolo, anche il più “potente” non attiverà nessun potenziale d’azione.

Ma abbiamo detto che il periodo refrattario assoluto prende anche una parte della fase 2 di

ripolarizzazione poiché in questa fase i canali del sodio sono chiusi e inattivabili: anche in questo

caso qualsiasi stimolo non è in grado di farli ripartire. Solo quando il potenziale di membrana si

ripolarizza entro un certo valore i canali del sodio voltaggio dipendente ritornano nella

conformazione di chiuso attivabile (che contraddistingue la fase di riposo), con cui possono

ripartire con un nuovo potenziale d’azione.

A cosa è dovuto il periodo refrattario relativo?

In questa fase posso stimolare il neurone e indurre un nuovo potenziale d’azione ma per farlo

devo somministrare uno stimolo sovra soglia più intenso rispetto a quello che dovrei

somministrare in condizioni normali: devo fornire una quantità di carica maggiore perché nel

frattempo i canali del potassio voltaggio dipendenti sono ancora aperti e vi è un’elevata

permeabilità al K+ che continua oltre la fase di ripolarizzazione con la iperpolarizzazione postuma.

Lo stimolo sovra soglia serve a contrastare l’effetto uscente del potassio.

Funzioni del periodo refrattario

Impedire il riverbero dei segnali che devono essere propagati in una sola direzione (antidromica)

senza poter tornare indietro;

Limitare la frequenza di scarica di un neurone cioè il numero di potenziale d’azione che si

generano nell’unità di tempo.

Conseguenze del periodo refrattario

Il potenziale d’azione è un evento isolato che non può sommarsi con altri potenziali d’azione;

La frequenza con cui un neurone può generare potenziali d’azione è limitata.

Propagazione del potenziale d’azione Un potenziale d’azione non è altro che una

rapida variazione del potenziale di

membrana in un dato segmento della

membrana cellulare.

Una volta generato, il potenziale d’azione si

propaga senza decremento lungo l’assone,

partendo dal monticolo assonico e

giungendo al terminale assonico.

Durante il processo di propagazione lungo

l’assone, questa variazione repentina del

potenziale di membrana si trasmette uguale

a se stessa nel segmento adiacente e da

questo al successivo e così via, come se

fosse un domino, fino al terminale assonico.

La propagazione del potenziale d’azione lungo l’assone si basa sulla generazione di nuovi

potenziali d’azione nei punti successivi dell’assone, procedendo in direzione anterograda. Gli

autori di questo processo sono sempre i canali del sodio voltaggio dipendenti, per cui se in un

segmento si ha la fase di rapida ascesa e su quello stesso segmento inizia poi la ripolarizzazione dei

canali del potassio, nel frattempo il segmento successivo sta andando in rapida depolarizzazione.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher deborahappunti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Fisiologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Salento - Unisalento o del prof Lionetto Maria Giulia.

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