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Diffusione anomala (Trasporto facilitato): la permeabilità è elevata per la presenza di proteine carriers che

permettono il passaggio di sostanze che non possono diffondere liberamente attraverso la membrana. Anche

in questo caso il movimento è secondo gradiente, ma dato il numero finito di proteine carriers, quando la

sostanza raggiunge concentrazioni elevate si ha saturazione.

L'interazione delle sostanze col carrier è specifica; sostanze con caratteristiche affini competono per lo stesso

carrier.

La specificità dell'interazione degli zuccheri col carrier dipende dai valori di Km che sono minimi per il

Destrosio e crescono passando dagli aldoesosi (glucosio, mannosio, galattosio) agli aldopentosi (xilosio,

arabinosio, ribosio, lixosio), e dalle forme D alle forme L. Il grado di inibizione reciproca dipende

dall'affinità del carrier per lo zucchero; così in presenza di destrosio il trasporto di tutti gli zuccheri risulta

fortemente inibito, mentre il trasporto di destrosio è inibito dal mannosio, inibito in parte da galattosio,

xilosio e arabinosio, mentre è indifferente alla presenza di sorbosio e levulosio (2 chetosi).

Cinetica del trasporto facilitato: la velocità con cui il glucosio viene trasportato segue una cinetica di

saturazione descritta da:

Equazione di Michaelis-Menten: è una stima dell'affinità del carrier per il glucosio

v0 = Vmax [S]/ Km + [S]

dove Vmax è il trasporto massimo, e Km è la concentrazione di glucosio alla quale la velocità di trasporto è

½ Vmax.

Modello del carrier mobile: le molecole carrier si legano alla molecola da trasportare su un versante della

membrana, migrano sul versante opposto, dove liberano la molecola trasportata.

Modello del Flip-Flop: la proteina trasportatrice, ancorata alla membrana, ha un carattere bistabile, cioè

esiste in 2 stati in cui i siti di legame per la molecola da trasportare sono esposti alternativamente sui due

versanti opposti della membrana.

Trasporto del glucosio: le diverse isoforme delle glucosio-permeasi sono adattate alla funzione delle

cellule. Ad esempio l'isoforma presente nelle cellule nervose (GLUT3) ha una Km bassa; nell'ambito

fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio nelle cellule nervose è sempre vicino al massimo, le cellule

nervose non devono essere sensibili alle variazioni della glicemia.

L'isoforma delle cellule β del pancreas (GLUT2) ha una Km elevata; nell'ambito fisiologico della glicemia, il

trasporto di glucosio varia significativamente e come conseguenza le cellule β secernono insulina (ormone

ipoglicemizzante) in funzione della concentazione extracellulare di glucosio.

La membrana è anche responsabile del potenziale transmembranario.

Equilibrio Elettrochimico e Potenziale di Membrana

Potenziale di Membrana: ai 2 lati della membrana plasmatica di tutte le cellule esiste una differenza di

potenziale con l'interno negativo rispetto all'esterno. Il potenziale di membrana è dovuto alla ineguale

distribuzione di ioni ai due lati di una membrana selettivamente permeabile, ed è mantenuto per la presenza

sulla membrana di pompe ioniche.

Potenziale di equilibrio: ai 2 lati della membrana si stabilisce l'equilibrio quando il lavoro chimico Wc

necessario per trasportare il K+ contro il gradiente di concentrazione è uguale al lavoro elettrico We

necessario per trasportarlo contro il gradiente elettrico.

Wc = R * T * Ln( [K+]'/[K+]'' ) We = z * F * (E'' – E')

Wc = We ===> R * T * Ln( [K+]'/[K+]'' ) = z * F * (E'' – E')

da cui: Equazione di Nerst: (E' – E'') = E = (R * T)/(z * F) * Ln( [K+]''/[K+]' )

Nel caso di una cellula muscolare di un vertebrato, in cui [K+]' = 140 mM e [K+]° = 2.5 mM, la ddp ai 2 lati

della membrana è:

Ek = (R * T)/F * Ln( [K+]°/[K+]' ) = 0,0257 * Ln (2,5 mM/ 140 mM) = -0,103 V

Esempio: “Quanti ioni K+ devono diffondere attraverso la membrana per generare una ddp di -100

mV?”

Carica sulla membrana: 10^-6 Farad/cm^2 * 0,1 V = 10^-7 C/cm^2

Numero di moli di ioni per unità di superficie di membrana: Q/F = 10^-7 cm^-2/96500 C/mol = 10^-12

mol/cm^2

Numero di ioni per unità di superficie: 10^-12 * 6,02 * 10^23 = 6 * 10^11 ioni/cm^2

Cellula sferica di vertebrato di raggio r= 25 μm, [K+]i= 140 mM

V= 4/3 p r3= 6.5 x 10-8 cm3 S = 4 p r2= 7.8 x 10-5 cm2 S/V= 3/r = 3/(2.5*10-3cm) 1000

Numero di ioni che diffondono attraverso la superficie: 6 * 10^11 ioni/cm^2 * 7,8*10^-5 cm^2 = 4,7 *

10^7

Numero di cationi K+ della cellula: 1,4*10^-4 mol/cm^3 * 6,5*10^-8 cm^3 * 0,8 * 6,02*10^23 ioni/mol =

4,4*10^12

Il numero di ioni che diffondono è perciò una frazione trascurabile (4,7*10^7/4,4*10^12 = 10^-5) rispetto al

numero di ioni contenuti nella cellula, confermando il principio di elettroneutralità.

Condizioni per l'equilibrio: se perturbiamo la condizione di equilibrio di una sostanza, il suo flusso

modifica la concentrazione interna finchè non si raggiunge l'equilibrio. Le condizioni per l'equilibrio sono:

le soluzioni interne ed esterne devono essere elettricamente neutre

– equilibrio osmotico

– non ci deve essere alcun flusso netto per ciascun ione

Equilibrio di Donnan: se ho 2 soluzioni equimolari di KCl e in una sostituisco 40 mM di KCl con 40 mM

del sale KA, esso si dissocia in K+ e A-. La membrana è impermeabile a A- ma non a K+ e Cl-. Cl- diffonde

per gradiente di concentrazione generando una ddp che favorisce la migrazione di K+ per gradiente elettrico.

La diffusione di KCl si interrompe quando il flusso di ioni genera una ddp uguale ai 2 lati della membrana.

L'equazione di Nerst per i 2 ioni all'equilibrio deve dare quindi lo stesso potenziale elettrico.

[K+]° * [Cl-]° = [K+]'*[Cl-]' Regola di Donnan

Viene quindi prodotta una ddp di potenziale transmembranario stabile nel tempo. La concentrazione totale

degli ioni diffusibili K+ e Cl- è maggiore dal lato in cui si trova lo ione non diffusibile A-:

[K+]' + [Cl-]' > [K+]° + [Cl-]°

Nel compartimento dello ione non diffusibile è presente quindi una maggiore pressione osmotica e questo

non soddisfa l'equilibrio osmotico ed è quindi incompatibile con le cellule animali. Si può avere equilibrio

ionico ed osmotico se oltre all'anione indiffusibile all'interno, esiste un catione indiffusibile all'esterno:

[K+]' + [Cl-]' + [A-]' = [K+]° + [Cl-]° + [Na+]°

Potenziale di diffusione: la membrana che separa le 2 soluzioni ha permeabilità diversa alle 2 specie

ioniche. In questo caso si genera una ddp detta potenziale di diffusione.

Caso A: Il flusso di Cl- è maggiore di quello del Na+, e l'eccesso di cariche negative sul lato 2 della

membrana genera una ddp che rallenta il flusso degli ioni Cl- e accelera quello degli ioni Na+ fino a che i 2

flussi diventano uguali. Il potenziale di diffusione è la ddp che determina l'uguaglianza dei flussi ionici e

quindi un flusso netto di carica 0. Il potenziale di diffusione così generato è però instabile in quanto tende ad

annullarsi con il ridursi del gradiente di concentrazione tra i 2 compartimenti.

Caso B: il flusso di K+ è maggiore di quello di Na+. Questo provoca un accumulo di cariche negative sul

lato 2 della membrana e quindi una ddp che rallenta il flusso di K+ e accelera quello in direzione opposta di

Na+ fino a diventare uguali. Anche in questo caso il potenziale di diffusione è instabile in quanto si basa su

un equilibrio elettrico ( le 2 correnti ioniche che attraversano la membrana in direzione opposta sono uguali e

quindi il flusso netto di carica è nullo) ma non su un equilibrio chimico (le 2 sostanze sono trasportate da

specie ioniche diverse). Col procedere della diffusione, la differenza di concentrazione dei 2 ioni diminuisce

fino ad annullarsi.

Confronto tra potenziale di equilibrio e di diffusione:

Potenziale di equilibrio: le specie ioniche diffusibili sono all'equilibrio elettrochimico (vale

– l'equazione di Nerst). Il potenziale di membrana coincide con il potenziale di equilibrio di ciascuna

specie ionica diffusibile . Il potenziale di equilibrio si mantiene indefinitamente.

Potenziale di diffusione: le specie ioniche diffusibili NON sono all'equilibrio elettrochimico (non

– vale l'equazione di Nerst). Il potenziale NON coincide con il potenziale di equilibrio di ciascuna

delle specie ioniche diffusibili. Il potenziale di equilibrio non si mantiene indefinitamente.

Equazione di Goldman: nel caso che la membrana sia permeabile a molteplici specie ioniche, tutti gli ioni

diffusibili possono contribuire allo sviluppo della ddp attraverso la membrana. In questi casi non si può

utilizzare il potenziale di Nerst (che vale per un'unica specie alla volta), per cui Goldman propose un modello

quantitativo del potenziale di membrana valido quando più specie ioniche possono attraversare la membrana.

In questa equazione nessuno ione è all'equilibrio; Considerando come P(K), P(Na) e P(Cl) le costanti di

permeabilità relative alle principali specie ioniche nei compartimenti intracellulari e extracellulari; e

considerando [K+]° e [K+]' le concentrazioni di potassio all'esterno e all'interno della cellula, l'equazione

può essere scritta come:

E(ioni) = R*T/z*F * Ln{P(K)*[K+]° + P(Na)*[Na+]° + P(Cl)*[Cl-]'}/{P(K)*[K+]' + P(Na)*[Na+]' +

P(Cl)*[Cl-]°}

In questa equazione si assume che la probabilità che una specie ionica attraversi la membrana sia

proporzionale al prodotto della sua concentrazione su quel lato per la permeabilità della membrana a quel

dato ione.

Es. nelle cellule muscolari di rana, la costante di permeabilità per il sodio è circa 1/100 di quella del potassio

e la membrana è impermeabile al cloro. Per cui l'equazione si riduce a:

E(Na,K) = R*T/z*F * Ln {1*[K+]° + 0,01*[Na+]°}/{1*[K+]' + 0,01*[Na+]'}

Il potenziale diventa stabile quando la somma delle correnti è 0

– I flussi passivi sono bilanciati dal trasporto attivo

– Le variazioni di potenziale delle cellule sono dovute a variazioni di conduttanza.

Potenziale di Riposo: in condizioni di equilibrio, ogni cellula che si trovi in uno stato di non eccitazione, o

di riposo, ha una ddp (Vrip) attraverso la sua membrana. Questo potenziale è governato dai canali ionici di

membrana che sono permeabili ad alcune specie ioniche presenti, e dalla distribuzione ineguale di ioni

inorganici tra l'interno della cellula e il suo esterno (condizione dovuta all'attività di trasporto attivo

attraverso la membrana e all'equilibrio di Donnan). La diversa distribuzione ionica costituisce una forza

motrice chimica che permette lo stabilirsi di un potenziale di equilibrio.

Pompa sodio-potassio: La concentrazione intracellulare bassa di Na+ ed elevata di K+ sono mantenute per

azione di una specifica proteina di membrana, detta Pompa sodio-potassio o Na+/K+ ATPasi, che trasporta

Na+ verso l'esterno e K+ verso l'interno utilizzando l'energia liberata dall'idrolisi dell'ATP. Non è però un

trasporto attivo bilanciato stechiometricamente, infatti per ogni molecola di ATP idrolizzata, 3 ioni Na+

vengono espulsi e 2 ioni K+ vengono assorbiti. Poichè la pompa produce un trasporto netto di carica

attraverso la membrana, questo meccanismo di trasporto è detto elettrogenico e può contribuire al potenziale

di membrana. L'effetto netto della pompa sarebbe quello di spostare il potenziale di riposo verso valori più

negativi rispetto al potenziale di equilibrio, calcolato usando l'equazione di Goldman. Tuttavia è stato

osservato che la pompa non contribuisce direttamente e in modo rilevante al valore del potenziale di riposo, e

ciò sta a significare che qualche carica positiva rifluisce a ritroso nella cellula, annullando parzialmente

l'effetto della pompa.

Inoltre la stechiometria della pompa richiede che la corrente passiva entrante del Na+ debba essere circa 1,5

volte la corrente uscente del K+, anche se la permeabilità passiva della membrana al K+ è maggiore di quella

al Na+. Questa differenza tra flussi ionici può essere ricondotta al fatto che il potenziale di equilibrio per Na+

sia tanto distante dal valore di Vm che la grande forza elettrica netta agente sugli ioni Na+ (Vm – E(Na))

determina il passaggio di più corrente attraverso la minore conduttanza di Na+ in condizioni di riposo.

Trasporto Attivo

Trasporto attivo primario: è un trasporto mediato. Le proteine agiscono come pompe che trasportano i

soluti contro gradiente dalla soluzione meno concentrata a quella più concentrata. Per andare contro

gradiente utilizzano energia come ATP (un esempio è la pompa sodio-potassio).

Esempio: Il rapporto di scambio 3:2 della pompa Na/K è stato mostrato in globuli rossi umani. Prima degli

esperimenti le cellule sono state mantenute per lungo tempo a 2 °C in modo da inibire l’attività della pompa

e farle equilibrare con la soluzione extracellulare. Le cellule venivano poi perfuse con un mezzo a 37 °C. Il

contenuto intracellulare di Na+ e K+ veniva misurato a tempi diversi dall’inizio perfusione. Se nel mezzo era

presente K+, la concentrazione intracellulare di Na+ diminuiva ad una velocità 1.5 volte più grande della

velocità con cui la concentrazione intracellulare di K+ aumentava.

Esempio: Assone di un calamaro: l'efflusso di Na+ da un assone di calamaro ha le caratteristiche di un

trasporto attivo. Infatti va contro gradiente elettrochimico, dipende dall'ATP, è sensibile ai veleni metabolici,

dipende dalla concentrazione di K+ esterna ed è fortemente dipendente dalla temperatura.

Trasporto attivo secondario: è un trasporto mediato che avviene contro gradiente. La sua energia non

deriva direttamente dall'ATP. E' un sistema di trasporto accoppiato, ovvero il gradiente di un soluto permette

il trasporto contro gradiente del soluto accoppiato (se i soluti si muovono nello stesso verso si parla di

simporto, se si muovono in versi opposti si parla di antiporto.

Esempio: Alanina:

L’ingresso di alanina (come di altri aa) dipende dalla concentrazione extracellulare di Na . In assenza di

+

Na il trasporto di alanina avviene per diffusione facilitata: la massima [alanina] è uguale a quella

+ i

extracellulare (linea tratteggiata in A). In presenza di Na il trasporto di alanina nella cellula è un

+

trasporto attivo secondario: l’alanina viene accumulata dentro il citosol in cui raggiunge concentrazioni

>> di quella extracellulare. A concentrazione infinita di alanina la velocità di trasporto è indipendente

dal Na come indicato dallo stesso valore di V nel plot di Lineweaver–Burk.

+ max

Esempio: Trasporto di Glucosio:

1) Trasporto facilitato nei globuli rossi:

Glucosio interno = 0,5 mM Glucosio esterno = 5 mM ==> ΔG = 8.314 x 310 x ln (0.5/5) = -5.93

kJ/mol. La variazione di energia libera è negativa quindi il processo è spontaneo.

2) Trasporto attivo secondario nell'epitelio renale (simporto Na/glucosio):

Con [glucosio]i = 0.5 mM, [glucosio]e = 0.005 mM,

ΔG-glucosio = 8.314 x 310 x ln (0.5/0.005) = +11.8 kJ/mol

Con [Na+]i = 10 mM, [Na+]e = 140 mM, il Na+ ha una carica positiva, per cui la ΔG associata con il

trasporto del Na+ deve tener conto anche del gradiente elettrico, quindi per Na+

ΔG = RT ln ([Na+]i/ [Na+]e) + zFE

Dove z è la carica dello ione, F è la costante di Faraday = 96500 coulombs/mol, E è la differenza di

potenziale ai lati della membrana (70 mV), quindi

ΔGNa = 8.314 x 310 x ln(10/140) + 1 x 96500 x (-0.07) = -13.5 kJ/mol.

Alternativamente: ΔG = zF(Vm-ENa) = 96500 x (-0.07 - 0.07) = -13.5 kJ/mol.

Quindi l’energia libera fornita dall’entrata del sodio è sufficiente per il trasporto contro gradiente del

glucosio.

Esempio: Trasporto attivo secondario di Ca^2+:

Na:Ca = 3:1. In una cellula nervosa di vertebrato abbiamo:

Vm = -77 mV, [Ca2+]i= 0.1 μM, [Ca2+]e= 2 mM, [Na+]i= 15 mM, [Na+]e= 150 mM,

ΔGCa= 8.314 x 293 x ln(2/0.0001)+2 x 96500 x (0.077) = 39 kJ/mol

ΔGNa = 8.314 x 293 x ln(15/150)+1 x 96500 x (-0.077) = -13 kJ/mol

L'entrata di 3 moli di Na implica una ΔG = -39 kJ. Lo scambio è elettrogenico (3:2). L'iperpolarizzazione

della membrana favorisce l'espulsione del Ca, mentre la depolarizzazione arresta e inverte il flusso di Ca.

NB: La [Ca^2+]' nel neurone di mollusco è misurata utilizzando una sostanza chiamata equorina, che

diventa luminescente se legata al Ca^2+. Allo stato stazionario la [Ca^2+]' è mantenuta costante

dall'equilibrio tra flusso passivo in ingresso e flusso attivo in uscita. Riducendo la [Ca^2+]° il flusso passivo

si riduce e la [Ca^2+]' cade fino a quando non si raggiunge un nuovo stato stazionario con una minore

[Ca^2+]' (l'attività del trasportatore rimane inalterata in quanto il gradiente di Na non cambia). Riducendo la

[Na+]° si riduce l'attività dello scambiatore e la [Ca^2+]' sale.

Giunzioni intercellulari: sono le connessioni che si formano tra cellule adiacenti durante lo sviluppo e la

crescita. Si distinguono 3 tipi di giunzioni: serrate, aderenti e comunicanti.

1- Giunzioni serrate: si trovano tipicamente nei tessuti epiteliali di rivestimento di organi cavi (rene e tratto

grastrointestinale) che svolgono funzioni di assorbimento e secrezione di ioni e molecole. Costituiscono una

barriera impermeabile alle sostanze polari tra lato luminale e lato sierosale dell'epitelio.

2- Giunzioni aderenti: giunzioni filamentose tra 2 cellule formate da una placca di glicoproteine all'interno

e da filamenti proteici che si estendono verso l'esterno (caderine). Nelle zonulae adherentes i microfilamenti

a cui le caderine sono attaccate sono formate da actina, nei desmosomi da cheratina. Conferiscono stabilità

meccanica alle giunzioni. Questo tipo di giunzione è presente nei tessuti soggetti a stress meccanico (cuore,

utero e cute).

3 – Giunzioni comunicanti (giunzioni Gap): sono presenti in molti tessuti, in particolare nel muscolo

cardiaco e liscio, in cui consentono il sincronismo elettrico e meccanico tra gruppi di cellule. Danno origine a

micro-aree connesse da proteine di membrana (connessoni) che formano pori acquosi di grandi dimensioni.

Ogni connessone è formato da 6 proteine (connessine).

Trasporto transepiteliale: il tessuto epiteliale è formato da una membrana apicale rivolta verso il lume

della cavità corporea (lato mucoso) e una membrana basolaterale in contatto con il liquido interstiziale, che

scambia sostanze con il sangue (lato sieroso). Le cellule adiacenti sono unite principalmente da giunzioni

serrate, che limitano il passaggio di sostanze. I 2 liquidi sui 2 lati dell'epitelio possono avere composizione

diversa. Le porzioni mucosa e sierosa delle membrane cellulari sono asimmetriche sia per la permeabilità che

per i meccanismi di trasporto.

Il trasporto avviene a cavallo di un epitelio; esistono 2 tipi di trasporto:

trasporto paracellulare: movimento passivo di ioni Na+, Cl-, K+, Ca^2+, Mg^2+ e H2O

– trasporto transcellulare: movimento di ioni e molecole attraverso le cellule, mediato da trasportatori.

Esempio: trasporto transepiteliale di NaCl attraverso la cute di rana

E' un modello che vale per tutti i trasporti transepiteliali di NaCl. L'esperimento di Ussing (1950) mostra che

il trasporto di Cl è passivo ed è mediato dal trasporto primario elettrogenico di Na+. Ponendo la stessa

soluzione fisiologica ai 2 lati dell'epitelio, il trasporto di NaCl è accompagnato da un potenziale

transepiteliale di 50 mV. La corrente di corto-circuito azzera il flusso di Cl e misura il flusso di Na.

L'aggiunta di ouabaina e la sottrazione di K+ dal lato seroso bloccano il trasporto di NaCl e azzerano la

corrente di corto-circuito.

La P(K) è alta dal lato seroso e bassa dal lato mucoso della membrana.

Il trasporto transcellulare è composto da trasporto passivo o attivo secondario sulla membrana apicale e da

trasporto attivo primario o passivo e attivo secondario sulla membrana basolaterale. Il trasporto di cationi è

solitamente accompagnato dal trasporto di anioni per minimizzare la formazione di potenziali elettrici.

La via paracellulare è invece una via di corto-circuito che tende ad annullare le differenze di concentrazione

e di potenziale ai 2 lati di un epitelio, in relazione al grado di pervietà delle tight junctions.

Esempio: assorbimento e secrezione di HCO3- nell'apparato digerente:

Esempio: assorbimento di KCl e NaCl nel rene


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Frances9013 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Fisiologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Lombardi Vincenzo.

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