Fisiologia cellulare e neurofisiologia

Omeostasi

Omeostasi è l'insieme di meccanismi atti a mantenere stabilità, non necessariamente all'equilibrio, della cellula mantenendo funzionalmente separati l’ambiente intra- ed extracellulari. Il concetto di omeostasi è correlato a quello di steady state inteso come serie di reazioni chimico-fisiche necessarie alla persistenza di una situazione stabile. Entrambe queste funzioni cellulari sono garantite dalle interazioni con l’ambiente esterno e si riassumono in tre attività cellulari:

• Attività di produzione di energia – Metabolismo energetico della cellula, consumo di combustibile
• Trasporto, sintesi e regolazione – Necessari al mantenimento di integrità strutturale
• Processi complessi – Necessari all’adattamento, riproduzione, evoluzione, svolgimento attività specifiche

Concetti fondamentali

Velocità dei processi

Velocità del processo = fattore di scala x (forza/resistenza); dimensioni fisiche diverse a seconda del processo. La resistenza (NdR. il suo inverso è la conduttanza) è data dalla proporzionalità degli altri fattori (es. Ohm = V/I) e dipende dalle caratteristiche fisiche e dal processo chimico sottostante il fenomeno considerato.

Direzionalità dei processi

Ogni reazione è bidirezionale e diversi fattori determinano la direzionalità della singola reazione: tra questi si osserva l’equilibrio elettrochimico e le pressioni oncotica ed osmotica, processi che, in ogni caso, rispettano le leggi della termodinamica.

Equilibrio

L’equilibrio che caratterizza le cellule è dinamico ed è garantito dal costante rinnovamento/consumo delle molecole presenti secondo un turnover caratteristico per ogni molecola considerata.

Trasporto di membrana

Scambi necessari al mantenimento dell’omeostasi cellulare.

Trasporto passivo

Scambio pro-gradiente elettrochimico ([ione] ai lati della membrana x [ioni] ai lati della membrana). Per molecole neutre il trasporto passivo bilancia la concentrazione delle molecole, mentre per le molecole cariche questo processo dipende dal gradiente elettrochimico che considera, oltre alla concentrazione delle singole molecole, anche il Vm.

Trasporto attivo

Primario, se associato a reazioni biochimiche o secondario se associato al trasferimento passivo di altre molecole.

Trasporto passivo

La diffusione è un trasporto passivo che dipende dalla forma della barriera e dalla capacità della molecola di muoversi di passarvi. Il coefficiente di diffusione permette di valutare la diffusione della molecola in relazione a proprietà chimico-fisiche della barriera (viscosità) e della molecola stessa (dimensione), mentre la legge di Fick sostiene che il flusso della molecola dipende dalla sua concentrazione nel compartimento di partenza: J indica il flusso dal compartimento 1-2, A/S (area/superficie); D il coefficiente di diffusione; C1-C2 [molecola] nei compartimenti 1-2.

Il trasporto passivo si osserva anche quando la membrana presenta pori, in questo caso non A/S ma dimensione e numero dei pori (NdR. e si parla di coefficiente di filtrazione, con 0<x<1). La diffusione regolata è quella che avviene attraverso canali di membrana, dipende anch’esso dalla [molecola] ad uno dei lati della membrana oltreché dal campo elettrico e dalla permeabilità della membrana (numero canali aperti x conduttanza): in base all’interazione con fattori intra- ed extracellulari si osservano variazioni conformazionali del canale (aperto-chiuso).

La diffusione facilitata si osserva quando una proteina transmembrana cambia conformazione in seguito al legame con una molecola che si associa al canale ESCLUSIVAMENTE in relazione alla differenza di concentrazione del substrato, dalla quantità di molecole di trasporto e dal tempo impiegato per il trasporto stesso.

• Trasportatore del glucosio (GLUT) Consente il trasporto di glucosio all’interno della cellula, data la differenza di concentrazione di questa molecola ai due lati dovuta alla formazione di glicogeno. Nella stessa famiglia è incluso il trasportatore SGLUT, sulla pt basolaterale della cellula, che consente il rilascio di glucosio in circolo.

Trasporto attivo

Nel trasporto primario si osserva una variazione conformazionale del canale nel quale da un lato la Kd per il substrato è maggiore rispetto al lato opposto: questo fenomeno produce lavoro (NdR. differenza di concentrazione) pertanto è necessario la reazione sia accoppiata ad una reazione favorita energeticamente. Questo trasporto è mediato delle ATPasi di membrana capaci di variazione conformazionale e di idrolisi di ATP (affinché il canale torni allo stato iniziale).

• ATPasi protoniche Consentono il trasporto di H dall’ambiente intra- a quello extracellulare (tubulo renale, stomaco) o dall’ambiente intra- a specifici organuli (es. lisosomi).
• ATPasi Ca²⁺ Poste sulla membrana plasmatica o sulla membrana del RE o RS (reticolo sarcoplasmatico) e hanno il compito di mantenere bassi i livelli di [Ca²⁺] nell’ambiente intra-.
• ATPasi Na⁺/K⁺ Ubiquitaria. Necessaria al mantenimento del Vm, positivo nell’ambiente extra. Scambia 3Na⁺ con 2K⁺ ad ogni ciclo per un trasporto contro gradiente.

Nel trasporto secondario, invece, il trasporto di una molecola è associato al trasporto secondo gradiente di un'altra molecola.

• Simporto – Sistema di cotrasporto ubiquitario nel quale il trasporto contro gradiente di una molecola è associato al trasporto secondo gradiente (e nella stessa direzione) di un’altra molecola: entrambe le molecole sono idrofiliche, pertanto, non diffondono liberamente nella membrana.

Cotrasportatori di piccole molecole organiche – In questa classe osserviamo simporti di aa associati al trasporto di Na e altri ioni, il trasportatore di glucosio SGLUT1-2 pt basolaterale degli enterociti, i neurotrasportatori altamente specifici per il neurotrasmettitore-substrato.

• Cotrasportatori ionici – Il controllo delle [ioniche] intracellulari è garantito principalmente dalla pompa Na⁺/K⁺ e da pompe regolatrici del Cl^-: tra queste troviamo le KCC (K⁺/Cl^-) che trasporta Cl^- fuori dalla cellula e NKCC (Na⁺/K⁺/2Cl^-) che trasporta il Cl^- nell’ambiente intra; regolando l’attività di queste pompe la cell regola il suo volume.

Nei neuroni in via di sviluppo sono presenti molti NKCC che riempiono di Cl^- il citosol cosicché quando si associa GABA-i il Cl^- in base al gradiente elettrochimico tende a fuoriuscire depolarizzando la cell (quindi GABA in questo caso è eccitatore e non inibitore).

• Antiporto – Sistema di cotrasporto nel quale il trasporto contro gradiente è associato di una molecola è associato al trasporto secondo gradiente di un’altra molecola nella direzione opposta.

Scambiatore 3Na⁺/1Ca²⁺ – Nonostante la bassa affinità della pompa per Ca²⁺ questo viene caricato (soprattutto a seguito di aumento [Ca²⁺]) mentre, contemporaneamente, Na⁺ è caricato a livello extra- a causa della sua alta concentrazione: la variazione conformazione rende meno affine la pompa per Ca²⁺ che pertanto è liberato a livello extra- e più affine per Na⁺ che, tuttavia, viene liberato a livello intra- a causa della sua bassa concentrazione.

• Scambiatori Na⁺/H⁺ e Cl^-/HCO₃^- – La prima pompa libera H⁺ nel lume del tubulo renale. H⁺, reagendo con HCO₃^- crea H₂O e CO₂ il quale entra a livello intra- e ridiviene H⁺ e HCO₃^- che è poi scambiato con Cl^- dalla seconda pompa.

Neurotrasportatori vescicolari – Pompe sulla membrana di organelli citoplasmatici come le vescicole ripiene di neurotrasmettitori: gli organuli sono ricchi di H⁺ (per le pompe ATPasiche) e scambiando questo ione permettono il funzionamento dei neurotrasportatori che, pertanto, ricaricano la vescicola di neurotrasmettitore.

L’omeostasi è un processo dinamico garantito dalla presenza di processi regolati da fattori esterni (feedforward) e processi regolati dal prodotto stesso del processo (feedback): i processi feedforward in base a risposte esterne possono variare, di molto, lo stato funzionale a cui si trovano mentre i processi feedback possono subire regolazione negativa, qualora l’aumento di [output] reprima il processo stesso o positiva quando l’aumento di [output] stimola il processo stesso garantendo la produzione di una risposta massimale (es. potenziale nervoso) che in generale rende possibili due soli stati funzionali, tutto o nulla.

Oltre al mantenimento dell’omeostasi la cellule va incontro a quella serie di reazioni che consentono di avviare il ciclo cellulare (non per tutta il corso della vita cellulare) e, nel caso di cell specializzate, al differenziamento in uno dei destini possibili per la cellula: questi tre processi avvengono simultaneamente nella cellula.

• Ciclo cellulare – Successione di fasi suddivise principalmente in mitosi, momento di duplicazione dei cromosomi, e interfase, momento di accrescimento cellulare, replicazione del DNA (fase S) e duplicazione degli organelli citoplasmatici: in questa fase si osserva la regolazione del ciclo da pt di fattori interni ed esterni quali i GF (growth factor – quello neurale, NFG, è importante per lo sviluppo di dendriti e assoni) che agiscono come substrati di recettori tirosin-chinasici che attivano geni early response o delayed-response (tardivi – tra questi i geni codificanti per le cicline, proteine regolatrici del ciclo cellulare).
• Apoptosi – p53, frequentemente oggetto di mutazioni oncogene, è un fattore di trascrizione che, a fronte di specifici segnali induce l’arresto del ciclo cellulare portandosi all’interno del nucleo e bloccando la sua stessa codifica. Se il blocco perdura la cell va incontro a morte cellulare programmata.
• Differenziamento cellulare – Capacità della cell di acquisire, irreversibilmente, caratteristiche altamente specifiche. Nel corso del differenziamento cell la cellula acquisisce memoria cellulare, responsabile del comportamento specifico di un particolare tipo cell all’interno di contesti diversi. Maggiore è il grado di differenziamento raggiunto minore è la capacità replicativa della cellula.

È importante considerare, tuttavia, il fenomeno di memoria posizionale per il quale da uno stesso tipo di cell specializzata si possono sviluppare tessuti diversi a seconda della posizione adottata dalla cell all’interno dell’organismo: questo fenomeno è garantito dai geni omeostatici, responsabili del comportamento della singola cell in relazione alle cell circostanti.

Regolazione delle funzioni cellulari

Mediante interazioni elettrostatiche, tra cui la possibilità di formare legami deboli o la creazione di legami covalenti reversibile l’attività della singola cellula risulta finemente regolata. Le funzioni cellulari sono prevalentemente regolate dall’attività enzimatica per la quale un enzima, accogliendo una molecola, ne consente il passaggio vs diversi stati transizionali anche in base a modulazioni subite dallo stesso enzima. Altro esempio di regolazione delle funzioni cellulari è dato dal gating dei canali ionici, ovvero il fenomeno per il quale l’associazione di una molecola segnale intra- ed extracellulare ad una canale ionico ne modifica, temporaneamente, la probabilità di variazione conformazionale (chiuso-aperto): in questa categoria sono inclusi le proteine che consentono la trasduzione del segnale come le proteine G o le cell L delle triadi.

• Proteina G trimerica – Classica proteina G attivata dalla recezione del segnale extracellulare (es. adrenalina). L’attivazione comporta la separazione della subunità α dalle subunità βγ per accoppiamento di α-GTP che si porterà ad attivare altre proteine.
• Proteina G monometrica – La proteina G è inattiva quando lega GDP (e inibitore per il distacco di GDP), si attiva quando lega GTP e conclude l’attività (es. aa legato a tRNA sulla nuova catena polipeptidica in formazione) solo quando GTP-GDP per attività GTPasica della stessa proteina G.
• Canali L delle triadi – Canali collocati a livello delle triadi (cisterna terminale – tubulo T – cisterna terminale) delle miocellule che, in seguito a variazione del Vm (si porta sino ai tubuli T) vanno incontro a variazione conformazionale che permette alle cell L di interagire con proteine canali per Ca²⁺ collocate sul RS (reticolo sarcoplasmatico) che si aprono liberando Ca²⁺ nel citoplasma della miocellula.

La cellula è ovviamente regolata anche da innumerevoli segnali provenienti dall’ambiente extracellulare come legami tra molecole e recettori canale, a recettori accoppiati a proteine G, a recettori tirosin chinasici e a recettori intracellulari (in caso di molecole lipofiliche).

Canali ionici e potenziale di membrana

La membrana plasmatica isola il contenuto cellulare dall’ambiente esterno e, di per sé, risulta possedere un potenziale di membrana dato dalla differente carica esistente ai due lati della membrana: variando il potenziale di membrana (Vm) nella cellula saranno indotte iperpolarizzazione o depolarizzazione con il conseguenti variazioni all’attività cell (es. potenziale d’azione per la trasmissione neurale). Il Vm è rilevato per inserimento un microelettrodo largo 1μm all’interno della membrana e ripieno di soluzione salina (conduttore) che risulta collegato a due elettrodi consentono di valutare ΔV, differenza di potenziale, che solitamente ha valore negativo in quanto il versante intracellulare della membrana ha valore (in mV) negativo.

La differenza di potenziale osservabile ai due lati della membrana è dato dalla diversa [ioni] nell’ambiente intra- ed extracellulare che, principalmente è dovuto alla permeabilità selettiva, data dai canali ionici, della membrana plasmatica: all’esterno si osservano alte concentrazioni di Na⁺, Cl^- e Ca²⁺ mentre all’interno sono presenti grandi quantità di K⁺ e ioni fosfato (di residui proteici).

Canali ionici

Proteine transmembrana multi-subunità omomerici (con subunità tutte identiche) o eteromerici (con subunità diverse) nei quali ogni subunità è formata da domini distinti ciascuno dei quali è formato da αeliche che attraversano da parte a parte la membrana: nell’insieme le subunità formano un poro che, aprendosi, lascia scorrere gli ioni secondo gradiente elettrochimico. Il canale ionico risulta selettivo per la presenza di un filtro di selettività, formato da residui aminoacidi, che si lega “temporaneamente” allo ione per cui è selettivo liberandolo dallo strato di solvatazione: una volta che lo ione è associato al filtro questo è poi trasportato dall’altro lato della membrana grazie alla forza del gradiente elettrochimico.

• Canali ionici passivi – Canali che, seppur selettivi per uno specifico ione, risultano costantemente aperti e, pertanto, sono responsabili del potenziale di membrana a riposo.
• Canali ionici ad accesso variabile – Aperti in seguito a specifica stimolazione.
• Chiuso/Aperto – Il canale passa da una conformazione chiusa ad una aperta, in risposta ad uno specifico segnale e, mentre è aperto il flusso di corrente non risulta costante ma si osservano flussi di durata ed ampiezza variabile (“tutto o nulla”) nei quali lo ione attraversa la membrana. L’apertura si manifesta come la rotazione di alcune subunità del canale.
• Inattivo – Inattivazione del canale a seguito di protrazione della sua stimolazione: questa inattivazione è possibile per una variazione conformazione delle subunità interne al canale (come nel canale per Na⁺), per il legame dello ione, passato sul versante citosolico, alla pt interna del canale (canale per Ca²⁺) o per defosforilazione del canale. Un canale inattivo per tornare allo stato attivo deve prima passare per la conformazione “chiusa”.

Tecnica del patch clamp

Microelettrodo di vetro con diametro 1μm associato alla membrana a cui viene applicata una pressione negativa (suzione) affinché l’elettrodo aderisca perfettamente (cell attached) alla membrana: una volta ottenuta questa configurazione e bloccati, farmacologicamente, i canali non oggetto di studio è possibile studiare il flusso di corrente a livello di un solo canale ionico.

Probabilità apertura – Valore determinato dal rapporto del tempo di effettiva apertura del canale (quando è legato al ligando NON è sempre aperto ma determina flussi momentanei di ioni) e il tempo dell’osservazione: il valore oscilla tra 0<x<1, se il valore P=1 allora il canale risulta costantemente aperto.

Tempo medio di apertura e chiusura – Valore medio del T° di apertura di un canale e dell’intervallo che occorre tra due fasi “aperte” dello stesso canale: con questo parametro è possibile valutare l’efficacia di apertura del canale.

Conduttanza – Capacità del canale di far passare cariche elettriche: i canali resistori (ohmici) presentano relazione lineare tra il gradiente elettrochimico e la conduttanza stessa mentre canali rettificanti conducono meglio a determinati valori di voltaggio. La conduttanza è il reciproco della resistenza (γ=1/R) e si misura in Siemens (reciproco Ohm Ohm =V/I).

Dalla legge di Ohm si ottiene i=ΔV . R (dove γ =1/R) quindi i=γ . ΔV; su grafico con x=i e y=ΔV-applicata è possibile valutare la conduttanza.

Canali voltaggio dipendenti

Canali con elevata selettività chiusi al valore del potenziale di riposo ed aperti in condizioni di variazione del potenziale (depolarizzazione e iperpolarizzazione) a causa della presenza, internamente al canale, di una sequenza di aa sensibili al voltaggio. Sono presenti molecole, naturali o farmacologiche che, legandosi al canale voltaggio-dipendente ne bloccano la funzione: tra questi la lidocaina si associa ad un sito (su α-elica S6 del IV dominio) del canale Na⁺ voltaggio-dipendente bloccando.