Fisiologia

Fisiologia

I sistemi biologici sono sistemi dinamici, che mantengono la propria integrità ed evolvono nel corso della propria vita grazie a complessi processi di regolazione dei parametri interni e d'interazione con l'ambiente esterno. Obiettivo della fisiologia è comprendere tali processi sapendoli scomporre e descrivere sulla base di meccanismi riducibili a un'analisi dettagliata e quantitativa. La cellula appare come un sistema ordinato, che si mantiene apparentemente immutato grazie alla continua interazione con l'ambiente circostante, al continuo rinnovarsi dei propri componenti e degli equilibri dinamici e all'elaborata regolazione delle proprie funzioni elementari. Nella visione dinamica, concetto centrale nell'interpretare il funzionamento cellulare - così come, in generale, il comportamento degli esseri viventi - è quello di omeostasi. L'omeostasi è un insieme di meccanismi che permettono di mantenere una situazione relativamente stabile sebbene discosta dall'equilibrio termodinamico. Ciò è reso possibile dalla complessa interazione di processi attivi e passivi (occorre, cioè, che ogni reazione che fa ordine si accompagna a una reazione spontanea in grado di cedere l'energia necessaria).

Membrana cellulare

La membrana che delimita la cellula isolandone il contenuto dall'ambiente esterno risulta, nella maggior parte dei tipi cellulari, elettricamente polarizzata. Tale polarizzazione assume un interesse particolare nelle cellule eccitabili, quali neuroni e cellule muscolari, che hanno la capacità di generare segnali elettrici in risposta a stimoli specifici. Questi segnali consistono in flussi di corrente, ovvero di ioni carichi positivamente o negativamente, che attraversano la membrana generando rapide modificazioni del suo stato di polarizzazione a riposo definito potenziale di membrana. Un segnale elettrico di particolare importanza è rappresentato dal potenziale d'azione che è responsabile della trasmissione delle informazioni lungo le reti neurali e determina l'insorgenza di fenomeni biologici fondamentali per l'organismo, quali la contrazione dei muscoli e l'attività cardiaca. Segnali elettrici con caratteristiche diverse dal potenziale di azione sono responsabili di altre importanti funzioni.

La differenza di potenziale della membrana è estremamente variabile nei diversi tipi cellulari, ma il dato costante è rappresentato dal fatto che, in condizioni di riposo, il versante intracellulare della membrana risulta essere negativo rispetto al versante extracellulare. In assenza di stimoli che mutino lo stato elettrico della membrana, questa differenza di potenziale si mantiene costante nel tempo. Una modificazione del potenziale di membrana a riposo verso valori più negativi è definito iperpolarizzazione; se il potenziale della membrana diviene meno negativo si parla di depolarizzazione.

L'esistenza di una differenza di potenziale a cavallo della membrana implica che sui suoi versanti vi sia una disuguale distribuzione di cariche elettriche, ovvero di ioni. La differente concentrazione delle diverse specie ioniche suggerisce che la membrana si comporti come una barriera dotata di una permeabilità selettiva che separa due soluzioni (liquido extracellulare e citoplasma) con composizione chimica diversa. La membrana è dotata di permeabilità selettiva e i meccanismi che modificano essa sono i responsabili della polarizzazione della membrana a riposo, nonché dell'insorgenza di segnali elettrici nelle cellule eccitabili. Le diverse specie ioniche risultano distribuite in maniera molto disuguale sui versanti della membrana: nel compartimento extracellulare è presente una concentrazione più elevata di Na⁺, Cl^- e Ca²⁺, mentre nel compartimento intracellulare si ha una concentrazione maggiore di K⁺ e di anioni organici (A^-) rappresentati prevalentemente da amminoacidi e proteine.

Al di là delle differenze quantitative che si riscontrano nei diversi tipi di cellule, è possibile osservare che la concentrazione dello ione Na⁺ sul versante extracellulare è circa dieci volte maggiore di quella presente sul versante interno, mentre lo ione K⁺ risulta circa venti-quaranta volte più concentrato all'interno che all'esterno della membrana.

Struttura della membrana

La struttura della membrana è rappresentata da un doppio strato fosfolipidico che risulta impermeabile agli ioni. Si deve considerare, infatti, che i fosfolipidi (presenta un gruppo fosfato negativo che interferisce con la carica dello ione) di membrana hanno code apolari idrofobe, mentre gli ioni sono particelle elettricamente cariche immerse in una soluzione acquosa. Le molecole di H₂O, elettricamente polarizzate, vanno a circondare lo ione formando una sorta di corona: anello di solvatazione. L'energia richiesta affinché uno ione si liberi delle molecole di acqua e attraversi il doppio strato fosfolipidico della membrana è molto elevata e tale evento appare pertanto assai improbabile. La via prevalentemente utilizzata dagli ioni per transitare attraverso la membrana cellulare è costituita dai cosiddetti canali ionici, grosse macromolecole proteiche che attraversano da parte a parte il doppio strato fosfolipidico. Per comprendere i meccanismi responsabili della permeabilità selettiva della membrana a riposo, nonché delle sue modificazioni che determinano l'insorgenza dei segnali elettrici nelle cellule eccitabili, bisogna quindi analizzare innanzitutto la funzione dei canali ionici.

Canali ionici

I canali ionici sono macromolecole di natura glicoproteica costituite da proteine integrali di membrana di grandi dimensioni legate, sul versante esterno, a gruppi di carboidrati. La macromolecola proteica risulta formata da diverse subunità che circoscrivono un poro idrofilo attraverso il quale transitano gli ioni. Una caratteristica fondamentale dei canali ionici è la loro selettività: vi sono canali con un'elevata selettività per una determinata specie ionica e altri canali che si lasciano attraversare invece da diversi tipi di ioni. Consentono il passaggio di ioni, nella direzione determinata dal loro gradiente elettrochimico. Le due principali caratteristiche dei canali ionici sono la selettività ("poro") e l'apertura. Gli ioni possono passare all'interno del poro poiché è un ambiente idrofilo (carico, affine al passaggio degli ioni, dato dagli AA che costituiscono la proteina).

È possibile distinguere i canali ionici in due grandi classi: i canali passivi e quelli ad accesso variabile.

• Canali passivi: Cl^- e K⁺ - sono caratterizzati dal fatto che, ferma restando la loro selettività per una determinata specie ionica, essi risultano sempre aperti, cioè sempre transitabili dallo ione in questione. In altri termini, il flusso ionico attraverso i canali passivi, determinato dalla forza elettrochimica che si stabilisce fra i due versanti della membrana, si realizza senza alcuna limitazione. Coinvolti nella genesi del potenziale di membrana.
• Canali ad accesso variabile: o attivi (consumano energia), sono provvisti di un meccanismo che ne regola l'apertura a seguito di stimoli specifici di natura elettrica, chimica (chemiodipendente, meccanicodipendente - acetilcolina che apre -, voltaggio-dipendente) o meccanica. I canali passivi sono coinvolti nella genesi del potenziale di membrana a riposo, mentre i canali ad accesso variabile sono responsabili, nelle cellule eccitabili, dell'insorgenza dei segnali elettrici. I canali ionici ad accesso variabile possono trovarsi in tre distinti stati funzionali: aperto, chiuso e refrattario (inattivo).

Stato aperto

In risposta a stimoli specifici, il canale può passare dallo stato chiuso, che non consente il passaggio degli ioni, allo stato aperto che rende invece possibile il transito delle specie ioniche interessate. Il passaggio dallo stato chiuso ad aperto si realizza in maniera assai rapida (in pochi microsecondi). L'attivazione del canale non determina un flusso continuo di corrente, bensì l'insorgenza di una ripetizione di impulsi di durata variabile e ampiezza determinata. Questi segnali di corrente, con caratteristiche di tipo "tutto o nulla", si ripetono con frequenza variabile. La rimozione dello stimolo che ha aperto il canale ne determina la chiusura, consistente in una modificazione della configurazione del canale che impedisce il transito degli ioni. Sostanze esogene quali molecole organiche, tossine e veleni di origine animale possono influenzare lo stato di apertura dei canali ionici, determinando più frequentemente la loro chiusura.

Stato inattivo

L'inattivazione del canale è una condizione nella quale, pur perdurando lo stimolo specifico che determina l'apertura del canale, il transito degli ioni attraverso di esso è impedito da un meccanismo indipendente da quello che ne regola l'apertura e la chiusura. L'inattivazione può essere dovuta a una modificazione della conformazione di una porzione del canale distinta dal cancello di apertura, che si genera allorquando lo stimolo, per esempio una variazione del potenziale della membrana in un canale voltaggio-dipendente, si protrae nel tempo. In altri casi l'inattivazione può essere generata dall'ingresso dello stesso ione per il quale il canale è selettivo che, una volta raggiunto il versante intracellulare della membrana, si lega al canale operando il blocco della sua permeabilità come avviene per esempio per il canali del Ca²⁺. L'inattivazione può essere generata, infine, da un processo di defosforilazione di uno o più siti del canale essenziali alla sua funzione.

Appare dunque chiaro che un canale può passare dallo stato aperto sia allo stato chiuso sia a quello inattivo. Una volta che il canale si è inattivato, però, esso non potrà ritornare allo stato aperto se non passando prima attraverso lo stato chiuso. Questa caratteristica del canale risulta fondamentale per comprendere la cinetica del potenziale d'azione e i meccanismi che determinano il fenomeno della refrattarietà dei neuroni e delle cellule muscolari.

Canali ionici voltaggio-dipendenti

Sono canali regolati dal potenziale di membrana. Si attivano (aprono), a seguito del raggiungimento di un determinato valore detto soglia della membrana. I canali ionici voltaggio-dipendenti risultano chiusi quando la membrana è nel suo stato di polarizzazione a riposo (potenziale di membrana) e si attivano a seguito di sue variazioni.

Struttura

Ciascun canale si compone di 6 domini. Il S5 e S6 formano l'apertura del poro e fra loro c'è un'ansa di circa 20 AA che insieme alle 3 anse, forma il filtro di selettività. I segmenti S1 + S4 sono sensori del voltaggio (perché carichi negativamente o meno). Stimolo: cambiamento del potenziale, tensione dei filamenti, apertura del gate.

L'apertura di questi canali è legata alla presenza nel canale di un sensore del voltaggio costituito da una sequenza di amminoacidi carichi positivamente o negativamente. La quasi totalità di questi canali si apre a seguito di una depolarizzazione, ovvero di una riduzione della normale polarizzazione della membrana a riposo verso valori meno negativi. Vi sono, comunque, anche canali che si attivano quando si realizza un'iperpolarizzazione, cioè un'accentuazione della normale polarizzazione della membrana verso valori più negativi. I canali voltaggio-dipendenti sono responsabili dell'insorgenza del potenziale d'azione, il segnale elettrico che garantisce la propagazione delle informazioni lungo le fibre nervose e rende possibile la contrazione delle cellule muscolari. Essi giocano un ruolo chiave anche nei meccanismi che determinano la liberazione di neurotrasmettitori delle terminazioni nervose e di ormoni delle cellule endocrine. Sono altresì responsabili dell'attività ritmica spontanea delle cellule segnapassi del cuore e di taluni neuroni.

I canali voltaggio-dipendenti hanno un'elevata selettività per una determinata specie ionica (Na⁺, K⁺, Ca²⁺ e Cl^-) e sono caratterizzati da una specifica soglia di attivazione (valore minimo che il potenziale di membrana deve raggiungere affinché abbia inizio l'apertura dei canali). I canali Na⁺, K⁺ e Ca²⁺ voltaggio-dipendenti hanno numerosi aspetti strutturali comuni in quanto i geni che li codificano appartengono a una medesima famiglia e presentano tra loro un elevato grado di omologia.

Canale ionico voltaggio-dipendente del sodio

Si tratta di canali costituiti da una subunità alpha che può essere associata a una o due subunità beta. La subunità alpha è sufficiente a generare, da sola, un poro funzionale dotato di voltaggio-dipendenza e filtro di selettività, mentre la subunità beta svolge un ruolo modulatore della cinetica e della voltaggio-dipendenza del canale. Nei neuroni del sistema nervoso centrale i canali del sodio risultano formati da 2 subunità beta mentre nel muscolo solo da una. La catena polipeptidica della subunità alpha è organizzata in quattro domini omologhi ciascuno dei quali si compone di sei segmenti, con struttura ad alpha elica. Il sensore del voltaggio è rappresentato dal segmento S4 presente in ciascuno dei 4 domini, che contiene aminoacidi carichi positivamente (lisina o arginina). L'attivazione del canale durante la depolarizzazione si genererebbe mediante un movimento verso l'esterno dei segmenti S4, che verrebbe trasmesso alle anse poste tra i segmenti S5 e S6 (regione P), che costituiscono il filtro di selettività. Un'ansa corta che collega i domini III e IV è ritenuta invece, responsabile dell'inattivazione del canale. A seguito di una depolarizzazione protratta della membrana, quest'ansa si piegherebbe e andrebbe a occludere dall'interno il poro del canale rendendolo non più transitabile dallo ione.

Tra le proprietà funzionali abbiamo:

• Bassa soglia di attivazione: la manifestano e la loro apertura determina un intenso flusso di ioni Na⁺ che passano dal versante esterno a quello interno. Questo flusso di cariche è responsabile della rapida inversione della polarizzazione della membrana a riposo con conseguente insorgenza del potenziale di azione. I canali Na⁺ hanno un ruolo chiave, quindi, nella funzione delle cellule eccitabili (es. nodi di Ranvier).
• Rapida cinetica di inattivazione: perdurando lo stimolo che determina l'apertura del canale, quest'ultimo diviene rapidamente refrattario e, quindi, il flusso di Na⁺ attraverso la membrana si estingue. Questa proprietà è fondamentale nel determinare la breve durata del potenziale d'azione nelle cellule nervose e muscolari scheletriche e rende possibile la successione di depolarizzazioni ad alta frequenza, che risulta fondamentale sia per la trasmissione di segnali da parte delle cellule nervose sia per la genesi di una contrazione muscolare sostenuta nel tempo. L'inattivazione del canale del Na⁺ è responsabile del fenomeno noto come refrattarietà assoluta, ovvero l'incapacità della cellula nervosa o muscolare, quando è depolarizzata, di generare un nuovo potenziale d'azione in risposta a stimoli di qualunque intensità. Infatti, poiché un canale non può passare dallo stato refrattario allo stato aperto se non transitando attraverso lo stato chiuso e poiché la chiusura del canale si realizza allorquando la membrana si ripolarizza, fin tanto che la membrana permane in uno stato di depolarizzazione, il canale del Na⁺ resta inattivo e quindi refrattario a stimoli che ne inducano l'apertura.

Canale ionico voltaggio-dipendente del potassio

I canali del K⁺ si distinguono in diverse classi e presentano proprietà strutturali, biofisiche, funzionali e farmacologiche assai diverse. La gran parte dei canali del K⁺ risulta formata da quattro subunità alpha identiche che vanno a delimitare il poro. In taluni canali può essere presente anche una subunità beta con funzioni regolatorie. Ciascuna subunità alpha presenta un singolo dominio costituito, a sua volta, da sei segmenti transmembranari e l'ansa compresa tra i segmenti S5 e S6 delle quattro subunità alpha va a formare il filtro di selettività. Essendo il canale del K⁺ costituito da un solo dominio, l'inattivazione viene determinata dalla porzione N-terminale intracitoplasmatica della catena polipeptidica, diversamente da quanto accade per i canali del Na⁺, nei quali il fenomeno dell'inattivazione è legato all'ansa intracitoplasmatica presente tra i domini III e IV.

L'apertura dei canali K⁺ determina un flusso di questi ioni verso l'esterno della cellula e di conseguenza, uno spostamento del potenziale di membrana verso valori più negativi. Essi concorrono alla regolazione del potenziale di membrana dei neuroni e delle cellule muscolari modulandone l'eccitabilità. Durante il potenziale d'azione essi svolgono un ruolo fondamentale nel fenomeno di ripopolazione ovvero nel porre fine alla depolarizzazione e nel riportare il potenziale della membrana verso i valori di riposo. Regolano pertanto la durata del potenziale d'azione e la frequenza di scarica dei neuroni. I canali del K⁺ influenzano, infine, il potenziale di membrana di cellule non eccitabili, quali quelle del tubulo contorto prossimale nel rene e prendo parte ai complessi meccanismi di controllo del ciclo della proliferazione cellulare.

Canali voltaggio-dipendenti del calcio

Questi canali sono proteine oligomeriche formate da diverse subunità. La componente principale del canale è la subunità alpha che forma il poro del canale, conferisce ad esso le proprietà di voltaggio-dipendenza e lo rende sensibile a bloccanti di natura organica e tossine di origine animale. La subunità beta è di natura idrofila, è localizzata sul lato citoplasmatico della membrana cellulare e contiene un importante sito di fosforilazione per le protein-china...