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processo passivo

• processo attivo

Farmaco abbastanza lipofilo passerà mediante trasporto passivo, e più aumenta la “resistenza” più

sarà propenso ad un trasporto attivo.

Quasi tutti i farmaci in commercio sono farmaci liposolubili. È necessario che tutti i farmaci

vengano metabolizzati per essere eliminati. La lipofilia va contro il fatto che il farmaco venga

escreto. Il processo di biotrsformazione epatica è fondamentale perché tutte le caratteristiche

chimico fisiche che favoriscono l’assorbimento sfavoriscono l’escrezione. La biotrasformazione

aumenta l’idrofilia della molecola permettendo al farmaco di essere più facilmente escreto dal

nostro organismo.

In funzione del tipo di passaggio, la cinetica di attraversamento delle membrane può essere o di

primo ordine o di ordine zero a seconda che sia necessaria la presenza di un carrier. Cinetica di

ordine zero quando il farmaco utilizza un trasportatore, una cinetica di primo ordine si riferisce alla

diffusione passiva.

In una cinetica di primo ordine (diffusione passiva) nell’unità di tempo, quello che sarà assorbito,

sarà una frazione costante, proporzionale alla quantità di farmaco che ancora è a disposizione per

l’assorbimento. Ci sarà una frazione elevata al momento della somministrazione e man mano che

l’assorbimento procede, diminuisce la quantità, ossia la frazione che rimane da assorbire.

Nel caso in cui un farmaco sia meno lipofilo, cinetica di ordine zero, nell’unità di tempo verrà

assorbita una quantità costante di farmaco che dipende dai trasportatori disponibili (concetto di

saturabilità).

Nella cinetica di primo ordine la velocità di assorbimento sarà più alta. Nel caso di ordine zero la

velocità è costante, in quanto è sempre quella stessa quantità a disposizione per l’assorbimento.

Se si volesse aumentare l’assorbimento di un farmaco somministrato per via orale, nel caso in cui il

farmaco passi per via passiva, variando il dosaggio si può variare la quantità di farmaco che viene

assorbita. In una cinetica di ordine zero, anche raddoppiando il dosaggio, non siamo in grado di

modulare l’assorbimento. I trasportatori, inoltre, possono essere più competenti per altre molecole.

Usualmente si cercano di sviluppare farmaci che siano lipofili e che il meccanismo di assorbimento

sia mediante diffusione passiva per evitare meccanismi di competizione quando si hanno i

trasportatori e di poter modificare l’assorbimento modificando le dosi.

Il coefficiente di ripartizione è il parametro

che si associa alle caratteristiche chimico-

fisiche del farmaco: si determina calcolando la

proporzione di farmaco che si trova nella fase organica rispetto alla fase acquosa e siamo in grado di

stabilire se il farmaco sarà sufficientemente lipofilo per attraversare le membrane.

Se >1 il farmaco è lipofilo e diffonde facilmente

• Se<1 il farmaco è idrofilo e non diffonde facilmente

• 18

La diffusione semplice o diffusione passiva

Sostanze liposolubili penetrano le membrane cellulari liberamente mediante processo di diffusione.

Il numero di molecole che attraversano la memebrana è data:

1. coefficiente di permeabilità

2. dalla differenza di concentrazione ai due lati della memebrana Δc

3. dal grado di ionizzazione della sostanza e dal pH ( man mano che aumenta il pH si ha un

intrappolamento ionico (farmaco acido più concentrato).

La stragrande maggioranza dei farmaci convenzionali sono acidi o basi deboli, sufficientemente

lipofili nella forma ionizzata. Ciò determina che in funzione del pH della soluzione in cui si

trovano, possono trovarsi in forma dissociata. Se consideriamo tre distretti in cui il farmaco si

troverà sicuramente (succo gastrico, plasma, urine) e considerando le variazioni di pH in questi tre

ambienti (acido nell’ambiente gastrico, leggermente alcalino nelle urine e neutro nel plasma), la

quantità di farmaco a disposizione del farmaco attraverso le membrane sarà influenzato dalla

quantità della forma dissociata o indissociata, che dipende dal pH, visto che solo la forma

indissociata potrà attraversa la memebrana per forma passiva. Aspirina e barbiturici (farmaci

ipnotico-sedativi) sono acidi e basi deboli. L’aspirina, acido debole a livello del succo gastrico si

troverà in forma indissociata e per questo motivo può essere assorbita dalla mucosa gastrica. Nel

caso dei barbiturici bisogna aumentare l’escrezione urinaria. A pH alcalino si troverà in forma

dissociata e potrà essere eliminato con le urine. Si procede all’alcalinazzione delle urine. Una base

debole avrà poca probabilità di essere assorbito a livello gastrico e a livello renale avrà un buon

grado di assorbimento, che non favorirà l’eliminazione.

Caratteristiche della superficie assorbente

Estensione: l’assorbimento di un farmaco è direttamente proporzionale all’estensione della

• superficie per l’assorbimento. Per questo che la maggior parte dei farmaci viene assorbito a

livello intestinale, grazie alla presenza dei villi e dei microvilli che aumentano nettamente la

superficie assorbente. Lo stesso principio comporta che i gas anestetici somministrati per vi

inalatoria siano assorbiti nella loro quasi totalità a livello alveolare.

Spessore: l’assorbimento è inversamente proporzionale allo spessore della superficie di

• assorbimento. Ciò spiega il lento assorbimento a livello dell’epidermide e il rapido

assorbimento a livello degli alveoli polmonari

grado di vascolarizzazione: maggiori sono la vascolarizzazione e il flusso ematico della

• zona di somministrazione, maggiore è la velocità di assorbimento. Un farmaco iniettato per

vi intramuscolare raggiunge il circolo più rapidamente rispetto a quanto impiegherebbe se

iniettato per via sottocutanea a quanto il tessuto muscolare è più riccamente vascolarizzato.

Stati infiammatori locali o aumenti del flusso ematico dovuti a richieste funzionali (attività

fisica nel muscolo, esposizione della cute a fonti di calore), possono modificare

profondamente la velocità di assorbimento di un farmaco. Sostanze vasocostrittrici sono

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spesso iniettate insieme agli anestetici locali per ridurne la velocità di assorbimento e

consentire una maggiore durata dell’anestesia locale.

Formulazione

Condizione che si può modulare a piacimento.

Viene riconosciuta una ulteriore fase della

farmacocinetica, la fase farmaceutica, che precede

la farmacocinetica vera e propria. La fase

farmaceutica è quella fase per cui la formulazione

per cui sto somministrando il mio farmaco fa in

modo che il principio attivo sia disponibile per

l’assorbimento. È la fase in cui la formulazione

con cui sto dando il mio farmaco viene disgregata

per rendere disponibile il principio attivo nel sito di somministrazione. Questa fase esiste solo per la

via di somministrazione orale. Se si utilizza un farmaco in soluzione, principio attivo più solubile,

questa fase viene saltata.

Le sostanze che vanno a costituire la formulazione in toto del principio attivo vengono definiti

eccipienti. Ci si deve assicurare che essi siano privi di qualsiasi effetto sia farmacologico che

tossico, ossia che siano sostanze inerti. La difficoltà sta nel trovare eccipienti che non si dimostrino

con attività biologica. Il vero eccipiente dovrebbe avere effetti positivi nella fase farmaceutica e non

interazioni con composti organici. In qualche caso, l’eccipiente viene aggiunto con funzioni diverse,

con solventi e diluenti che vengono disgregati e disciolti durante il traffico gastrointestinale.

Possono servire a dolcificare una formulazione, servono ad aumentare la stabilità chimica della

molecola, aromi, disgreganti. La formulazione farmaceutica ha lo scopo di dare origine ad una

formulazione in modo da recedere disponibile il principio attivo al sito di assorbimento, rendere

stabile la molecola, e dare caratteristiche gradevoli al farmaco.

Il parametro che si associa al processo di assorbimento è la

biodisponibilità. La biodisponibilità è un valore percentuale, che si

calcola come rapporto tra AUC (area sottesa alla curva di

orale

concentrazione plasmatica dopo somministrazione di una dose per la

via di cui voglio studiare la biodisponibilità) su AUC (area

immessa

calcolata per via endovenosa). In genere, la biodisponibilità di un

farmaco somministrato per via orale sta tra il 40-60%. Ci sono

farmaci che hanno anche una via di biodisponibilità del 90% (anche

nelle vie di somministrazione orale).

Bioequivalenza dei farmaci

La legge prevede che dopo circa 10anni, l’azienda che ha sviluppato il farmaco, perda la titolalità

del farmaco. Non possono mettere in commercio lo stesso farmaco, ma fare formulazioni con lo

stesso principio attivo. Non si chiama farmaco generico, ma farmaco equivalente.

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Un farmaco bioequivalente è un farmaco che presenta lo stesso principio attivo di quello già in

commercio. L’azienda deve dimostrare che la biodisponibilità del prodotto sia efficace. Due

prodotti si definiscono equivalenti farmaceutici se contengono la stessa quantità di principio attiva,

abbiano la stessa forma farmaceutica e se la differenza nella biodisponibilità del prodotto originale e

del farmaco che sto commercializzando non sia statisticamente diversa (± del 20%).

21 15/03/2017

La distribuzione

È il processo che implica la distribuzione del farmaco dal compartimento plasmatico a quelli

extraplasmatici (interstiziale e intracellulare). Alla fine di questo processo si ha il farmaco in

equilibrio tra tutti questi compartimenti liquidi. Questo è un processo importante perché permette al

farmaco di raggiungere con una concentrazione ottimale il suo bersaglio farmacologico. La

distribuzione dipende anche da dove è localizzato il target:

5. Se si ha un recettore di membrana come bersaglio, l’interazione farmaco-target avverrà al di

fuori della cellula. In questo caso è sufficiente che il farmaco si distribuisca bene tra i liquidi

interstiziali e plasmatici, tralasciando quelli intracellulari;

6. Se il bersaglio è invece localizzato a livello citoplasmatico, il processo di distribuzione deve

riguardare tutti e tre le tipologie di fluidi.

Perciò è importante la distribuzione del farmaco in tutti e tre i fluidi, ma è anche importante la

localizzazione del bersaglio farmacologico.

Farmaco libero e farmaco legato

Quando si parla di distribuzione e

raggiungimento dell’equilibrio del farmaco, si

considera una situazione dove solo il farmaco

libero è in grado muoversi da un fluido all’altro.

Sono però frequenti le condizioni in cui sia nel

plasma che nei liquidi extraplasmatici il farmaco

si trova legato a proteine, per le quali ha una

certa affinità. Per questo motivo nel considerare

il processo distributivo devo tener conto sia

della quota libera che della quota legata del

farmaco. L’entità della forma legata inficia la distribuzione: se un farmaco ha poca probabilità di

legarsi a macromolecole endogene, maggiore sarà la sua distribuzione.

Tuttavia il legame a queste macromolecole è reversibile. Quindi la porzione di farmaco legata e

libera è in equilibrio. Man mano che la quota libera viene distribuita, il farmaco legato si

distaccherà dalle macromolecole in modo da riequilibrare la quota legata con la quota libera.

È un processo dinamico. Le macromolecole con cui è in grado di interagire il farmaco sono

tantissime e quindi se a livello di un organo o di un tessuto il farmaco raggiunge concentrazioni

elevate, esso può andare a legare macromolecole che non sono il suo bersaglio farmacologico.

Questo può determinare lo sviluppo di effetti tossici.

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Il farmaco ad un certo punto deve riuscire a raggiungere gli organi escretori come il fegato e i reni.

In questi due organi il farmaco ci arriva maggiormente, non attraverso la distribuzione, ma

attraverso il plasma. Questo perché fegato e reni sono riccamente irrorati. Quindi la distribuzione

deve garantire da un lato che il farmaco lasci il plasma, ma dall’altro deve garantire che il farmaco

attraverso la circolazione possa raggiungere tali organi e quindi essere escreto (il farmaco deve

uscire dal plasma, ma deve anche tornare alla circolazione).

Ripartizione del farmaco nelle fasi

liquide

La percentuale di questi fluidi nel nostro organismo è molto

diversa. Perciò la distribuzione del farmaco nei fluidi corporei

dipende dalla quantità/proporzione relativa di questi:

 Il plasma rappresenta circa il 4,5% del peso corporeo;

 I fluidi extracellulari comprendono: fluido

interstiziale (16%) e linfa (1,2%);

 I fluidi intracellulari (30-40%) sono la somma di tutti

i contenuti fluidi delle cellule;

 I fluidi transcellulari (2,5%) comprendono LCS, intraoculare, peritoneale, pleurale e

sinoviale.

Fattori che influenzano la distribuzione

Caratteristiche chimico-fisiche del farmaco (grado di lipofilia)

• 

Affinità del farmaco per specifici tessuti tropismo tissutale

• Flusso ematico e permeabilità capillare (struttura dei vasi è diversa nei diversi tessuti)

• Presenza di barriere anatomiche funzionali, come barriera ematoencefalica e barriera

• placentale

Legame del farmaco con le proteine soprattutto quelle plasmatiche o con altri costituenti

• tissutali

Nella distribuzione il farmaco non diffonde in tutto l’organismo, ma il processo è regolato da molti

fattori e il farmaco si distribuisce nei diversi distretti in maniera assolutamente autonoma e

differente rispetto agli altri farmaci.

Caratteristiche chimico-fisiche

Essenziale è il grado di lipofilia. Questo impatta soprattutto sulla cinetica di assorbimento.

L’impatto della lipofilia sulla distribuzione è legata alla capacità di un farmaco dotato di buona

lipofilia di trovarsi in equilibrio nei tre fluidi principali: plasma, liquidi interstiziali e liquidi

cellulari. Quindi ci si aspetta che il farmaco non abbia degli ostacoli nel distribuirsi in modo

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equilibrato in questi fluidi (passa tranquillamente

attraverso le membrane biologiche). Maggiore è

l’idrofilia minore sarà l’efficienza nella

distribuzione. In particolare avremo che non sarà

distribuito in modo equilibrato fra i tre fluidi.

L’importanza della lipofilia è maggiore se il target

farmacologico si trova a livello intracellulare,

mentre è meno importante quando devo

sviluppare un farmaco che ha come bersaglio un

recettore di membrana (siamo a livello

extracellulare). In questo caso posso giocare sulla lipofilia: più il farmaco che sviluppo non è in

grado di arrivare a livello intracellulare, più aumenterò la sua concentrazione extracellulare e quindi

potrò avere un maggiore effetto farmacologico. Quindi il grado ottimale di lipofilia dipende dal tipo

di farmaco e anche dal tipo di target farmacologico.

Affinità specifica per i tessuti

Se all’interno di un tessuto il farmaco trova una macromolecola per la quale ha una particolare

affinità ma che non è il target, questa affinità determina che durante la distribuzione il farmaco si

possa accumulare nel tessuto. Se non ha affinità per macromolecole, una volta giunto nel tessuto

svolge la propria funzione e una volta terminata potrà rientrare nel plasma per poter essere

metabolizzato. Queste macromolecole sono rappresentate da costituenti cellulari e tissutali come

proteine, fosfolipidi e nucleoporine. Normalmente il farmaco si lega a macromolecole ma il legame

ha bassa affinità e quindi è reversibile. Perciò ad un certo punto si staccherà.

Se l’affinità è molto forte possiamo avere un legame irreversibile e quindi il farmaco si accumula.

In questo caso parliamo di tropismo tissutale. Esempi:

Le tetracicline (antibatterici) una volta distribuite e arrivate al tessuto osseo tendono a

• legare il calcio. Solo la quota non legata potrà andare incontro a metabolismo e poi

escrezione. La parte che si lega determina un accumulo nell’osso di tetracicline. Quindi

possiamo avere che non riusciranno a svolgere la propria funzione farmacologica sulle

infezioni batteriche (con la circolazione sistemica le tetracicline passano per le ossa dove si

accumulano);

Tiopentale (anestetico) verso il tessuto adiposo;

• Clorochina (antimalarico) verso il fegato;

• Amiodarone (antiritmico) verso la tiroide.

Conseguenze:

Dal punto di vista della distribuzione avremo una distribuzione più rallentata rispetto ad un

• farmaco che non presenta tropismo tissutale. Quindi sarà meno la quantità di farmaco che

riuscirà a raggiungere il target farmacologico;

24

Potenziale effetto tossico nel tessuto verso cui ha tropismo. Può legare macromolecole non

• target. Ad esempio le tetracicline hanno effetto tossico nel tessuto osseo (rinnovamento del

tessuto è inficiato);

Farmaco può accumularsi nel tessuto organo verso cui ha tropismo e successivamente grazie

• a condizioni particolari, dissociarsi dalle macromolecole rientrando in circolo. Infatti anche

dopo un lungo tempo dalla somministrazione possiamo ritrovare il farmaco distribuito tra i

vari fluidi. Ad esempio le tetracicline possono essere liberate durante eventi di

rimodellamento osseo anche dopo diversi mesi.

Anatomia del torrente circolatorio

Alcuni organi e tessuti sono meglio raggiunti da farmaci rispetto ad altri. Questo dipende da:

Flusso ematico

d) = più un tessuto è irrorato maggiore sarà la velocità con cui il farmaco

raggiunge quel distretto. In base a quanto un organo/tessuto è irrorato, questo può essere

distinto in:

 Perfusione rapida = cervello, fegato, rene e cuore. Il fatto che il cervello sia riccamente

vascolarizzato non è sempre un vantaggio dal punto di vista farmacologico perché vuol dire che

ogni farmaco riesce a raggiungere facilmente tale organo. Questo può risultare funzionale solo

se è il cervello stesso ad essere il target del farmaco. Tuttavia i danni sono evitati grazie alla

presenza della barriera ematoencefalica. Quindi il farmaco potenzialmente potrebbe avere un

efficiente distribuzione nel cervello, ma in realtà non è così. Infatti il cervello è l’organo meno

raggiungibile dai farmaci. Questo al contrario crea un problema quando voglio sviluppare un

farmaco che deve agire sul SNC.

 Perfusione media = muscoli e pelle. Proprio per questo motivo tali tessuti vengono utilizzati

come vie di somministrazione;

 Perfusione ridotta = tessuto osseo e adiposo.

A parità di permeabilità, tessuti ben perfusi accumulano il farmaco molto più rapidamente dei

tessuti meno perfusi.

Permeabilità capillare

e) = le

caratteristiche morfo-funzionali dei

capillari sono un altro parametro che

influenza il processo di distribuzione dei

farmaci. Queste caratteristiche variano a

seconda del distretto corporeo in cui si

trovano. La permeabilità capillare

diminuisce proporzionalmente alla

morfologia dei capillari che può andare da

capillari ampiamente fenestrati (epatici)

a capillari con giunzioni occludenti e serrate (barriera ematoencefalica). Oltre a queste

25

due situazione estreme ci sono comunque casi intermedi. La distribuzione sarà favorita in

quei tessuti dove i capillari sono più lassi.

Il fegato è uno degli organi più irrorati e possiede capillari con ampie fenestrature. Queste

caratteristiche rendono conto del fatto che nel fegato il farmaco deve andare incontro a

biotrasformazione, in modo da detossificare l’organismo. Man mano che cambia la morfologia del

capillare questa caratteristica diminuisce la distribuzione del farmaco.

Nel cervello abbiamo invece capillari circondati da cellule della glia (astrociti) che ne riducono

notevolmente la permeabilità.

Quindi la distribuzione di un farmaco non è mai omogenea nell’organismo.

Presenza di barriere anatomiche

Queste barriere anatomiche limitano l’ingresso dei farmaci nei siti critici corporei come ad esempio

nel SNC e nell’embrione.

Barriera placentare = barriera più permissiva/lassa di quella ematoencefalica, affinché

o al feto possano giungere i nutrienti dalla madre. Il pH del plasma fetale è di 7,0-7,2 mentre

quello del plasma della madre è di 7,4. Questo comporta una tendenza all’intrappolamento

di farmaci basici. Infatti il feto è generalmente esposto ai farmaci assunti dalla madre. È

difficile prevedere in che quantità un farmaco è in grado di passare la barriera placentare.

Barriera ematoencefalica = i

o capillari dell’endotelio cerebrale sono

caratterizzati dalla presenza di tight

junctions e di cellule che riducono

ulteriormente il grado di

distribuzione. Tale barriera rende

conto del fatto che il cervello sia uno

degli organi meno raggiunti dal

processo di distribuzione dei farmaci,

a meno che:

 Siano farmaci dotati di un

adeguato coefficiente di ripartizione (adeguato grado di lipofilia) così da attraversare

passivamente secondo gradiente di concentrazione la barriera ematoencefalica;

 Siano farmaci in grado di legarsi a trasportatori specifici a livello della barriera

ematoencefalica, necessari al trasporto di molecole endogene che servono al SN.

Tuttavia l’impermeabilità della barriera ematoencefalica è ridotta in corso di un’infiammazione o

infezione (meningite). Inoltre lo stato di impermeabilità è ridotto a livello dei plessi coroidei e di

altre regioni periventricolari, dove hanno normalmente luogo i processi di filtrazione e di

secrezione. 26

Caratteristiche endotelio della barriera:

Assenza di fenestrature;

• Presenza di giunzioni strette ed occludenti;

• Presenza lamina basale;

• Presenza di periciti e astrociti. Queste cellule formano un ulteriore strato cellulare che deve

• essere superato per poter entrare all’interno del SNC.

Proprio per la struttura dell’endotelio cerebrale, quando sviluppo un farmaco che ha come target il

SNC devo considerare il sistema nel suo complesso. Per favorire il passaggio di un farmaco

attraverso la barriera possiamo modificare la molecola in modo che abbia un’affinità per questi

trasportatori. La determinazione della possibilità di superarla è uno dei test che vengono fatti il

prima possibile in laboratorio durante il processo di sviluppo del farmaco. Questo

indipendentemente da se il target farmacologico sia situato a livello del SNC o meno. Sono stati

sviluppati sistemi in vitro per la valutazione dell’eventuale capacità del farmaco di superarla.

I test di screening più utilizzati prevedono la presenza di un sistema bicamerale e sono

complessivamente 4 (farne più di uno aumenta la predittività):

1. Modello co-coltura senza contatto = nella camera superiore vengono fatte crescere cellule

endoteliali, mentre nella camera sottostante vengono fatti crescere periciti e astrociti. In

questo modo si mima un sistema bicamerale in cui il farmaco deve riuscire a superare il

sistema endoteliale e il sistema cellulare.

2. Modello medium condizionato = un monostrato di cellule endoteliali viene fatto crescere

in un mezzo di coltura che era stato precedentemente prelevato da un terreno di coltura di

cellule astrocitarie e periciti. In questo modo è possibile osservare se quest’ultime due

tipologie cellulari producono delle molecole che influenzeranno il passaggio del farmaco a

livello dell’endotelio.

3. Modello di co-coltura con contatto =

sistema bicamerale in cui si mima il

contatto fisico facendo crescere cellule

endoteliali, periciti e astrociti sulle due

facce della superficie che separa le due

camere. Questo è il metodo più

utilizzato in laboratorio.

4. Modello di coltura mista = cellule

endoteliali, periciti e astrociti vengono

fatti crescere all’interno della stessa

camera. Spesso si perde il rapporto

relativo tra le cellule che vi è a livello fisiologico, in quanto crescono con tassi differenti.

27

Oggi si stanno sperimentando sistemi di delivery che favoriscono il superamento della barriera

ematoencefalica:

- Utilizzo di nanoparticelle = può servire a far arrivare la nanoparticella al SNC con legato il

farmaco. A livello del SNC il farmaco verrà rilasciato;

- Utilizzo di ultrasuoni focalizzati o

dell’ipertermia = sono metodi fisici che

determinano un aumento transiente della

permeabilità della barriera. Questo è

dovuto al fatto che vengono rotte

temporaneamente le giunzioni occludenti.

Gli ultrasuoni vengono focalizzati in

un’area precisa del SNC e determina una

temporanea lassità della barriera. Il sistema

poi tornerà alla condizione iniziale. Quindi

il farmaco attraverso la circolazione

sistemica riuscirà ad arrivare al SNC.

- Coniugazione del farmaco ad un ligando che può essere riconosciuto dai recettori della

barriera. In questo modo il farmaco potrà essere trasportato attraverso la barriera ed entrare

nel SNC. Altra modalità è la coniugazione del farmaco a peptidi in modo da mediare sempre

il passaggio.

- Utilizzo di cellule (ad esempio staminali, che quindi presentano una fisiologica proprietà di

riuscire ad arrivare al SNC) come cavallo di troia. All’interno delle cellule verrà posto il

farmaco e questo entrerà nel SNC. 28 20/03/2017

Legame dei farmaci alle proteine plasmatiche

La distribuzione può essere vista come un processo omogeneo.

L’ultimo fattore che regola il processo di distribuzione dei farmaci è il legame del farmaco con le

proteine plasmatiche. Questo fattore è il principale nel regolare la distribuzione dei farmaci.

In tutti i compartimenti liquidi

dell’organismo il farmaco può trovare

strutte proteiche e quindi legarsi. Solo la

quota libera sarà i grado di attraversare

le membrane biologiche.

L’albumina è considerata un serbatoio,

in quanto essa manifesta un buon grado

di affinità per i farmaci. L’albumina è il

grado di legare molecole che sono acidi

deboli. Farmaci più basici tendono ad

essere maggiormente affini per la beta-

globulina. Albumina e beta-globulina

sono serbatoi plasmatici dei farmaci perché il legame alle proteine plasmatiche è un legame

reversibile, rendendo disponibile alla distribuzione il farmaco legato e per questo vengono definite

come serbatoi.

Il legame alle proteine plasmatiche è uno dei fattori che determina la velocità con cui il farmaco si

distribuirà nell’organismo ed è anche indice di interazione con le proteine plasmatiche. Il legame

alle proteine plasmatiche è saturabile, e l’entità di questo legame, ossia la quantità di farmaco libera,

dipenderà dalla dose di somministrazione.

Si definisce e si usa determinare l’affinità di un farmaco per le proteine plasmatiche calcolando il

rapporto tra la concentrazione totale del farmaco legato e la concentrazione del farmaco a

livello plasmatico. Il farmaco si definisce fortemente legato se tale rapporto è superiore a 0,9,

altrimenti si dice scarsamente legato se è inferiore a 0,2. I farmaci con rapporto 0,9 avranno una

distribuzione troppo lenta, e pertanto non vengono usati, in quanto non abbiamo la garanzia che essi

arrivino al bersaglio molecolare a una concentrazione attiva farmacologicamente. Farmaci

scarsamente legati (rapporto inferiore a 0,2) verranno metabolizzati così velocemente che la loro

permanenza nell’organismo sarà troppo veloce e la loro interazione con il sito d’azione sarà molto

scarsa. Pertanto i due estremi hanno degli svantaggi:

0,9 troppo rallentata la distribuzione → no effetto farmacologico

• 0,2 si vede l’effetto farmacologico, ma la durata con cui il farmaco sarà a contatto con il

• bersaglio sarà troppo lenta. 29

Una distribuzione sufficientemente buona vuol dire avere la concentrazione ottimale al bersaglio, la

velocità mi garantisce il tempo in cui quella concentrazione di farmaco sarà a contatto con il

bersaglio.

Dobbiamo sempre considerare che il legame del farmaco alle proteine plasmatiche è saturabile e la

quantità di farmaco in forma libera forma e in forma legata dipende dall’affinità e dalla dose.

Distinguiamo i farmaci in funzione dell’affinità (dato dal rapporto dose libera su dose legata) e

anche in due ipotetiche classi: farmaci la cui dose sia in grado di saturare le proteine plasmatiche e

farmaci la cui dose non sono in grado di saturare le proteine plasmatiche.

Abbiamo farmaci in cui la dose somministrata

rende conto del fatto che i siti proteici non sono

saturati e quelli in cui la posologia prevede un

dosaggio in grado di saturare le proteine

plasmatiche. A parità di affinità, la diversa dose

come influenza il legame alle stesse? Nel momento

in cui usiamo farmaci non in grado di saturare le

proteine plasmatiche il rapporto relativo tra la

forma legata e libera sarà a favore di quella legata.

Se i farmaci vengono somministrati a dosi saturanti, qualsiasi dose in

più rappresenta una frazione di farmaco libera. La relativa

concentrazione di farmaco nella sua forma libera/legata dipende da

due fattori: l’affinità e dal dosaggio somministrato.

Se aumento i dosaggi in modo tale da aumentare la quota libera del

farmaco, perché vado a saturare il legame con le proteine plasmatiche,

possono aumentare la quantità di farmaco libera per il processo di

distribuzione.

Conseguenze del legame farmaco proteine:

ritarda l’accesso del farmaco al sito di azione

• un elevato legame con le proteine rallenta l’eliminazione del

• farmaco (metabolismo e/o escrezione attraverso la filtrazione

glomerulare). L’arrivo a questi organi è determinata dalla

quantità di farmaco al plasma. La quantità di farmaco che

subirà la biotrasformazione epatica sarà la quantità di farmaco

che si trova in forma libera.

si possono creare fenomeni di competizione per il legame ad

• uno stesso sito. Quando vi è uno stato di competizione si

possono avere due condizioni distinte:

quota legata più alta (classe 1) e somministriamo un

◦ farmaco di classe 2 (farmaco a dose saturante delle

30

proteine plasmatiche): l’effetto più grande si vedrà sul farmaco di classe 1. Il farmaco di

classe 1 si dissocerà dalle proteine plasmatiche e la quota si sposta a favore di quella

libera. Farmaci che comunque manifestano una buona affinità per le proteine

plasmatiche tendono ad essere svantaggiate perché possono avere competizione. Per

determinar tutto questo, si procede ad un saggio di dialisi e al calcolo del PPB (binding

alle proteine plasmatiche). Si hanno due camere separate da una memebrana di dialisi,

che è permeabile al farmaco libero ma che non permetterà il passaggio delle forme

legate. Viene incubato plasma umano con una concentrazione nota del farmaco.

All’equilibrio si avrà l’equilibrio della forma libera del farmaco e nella camera si andrà a

calcolare la forma di farmaco unbound, che sarà dato dal rapporto tra la concentrazione

di farmaco libera rispetto alla forma totale di farmaco. Questo rapporto espresso in

percentuale ci dice l’entità del farmaco.

PPB=20%: il tempo di permanenza al sito attivo non sarà elevato

▪ PPB>90% il farmaco non si distribuirà bene

▪ 20%<PPB> 50% condizione ottimale. Mi permette di giocare sulla quota libera

▪ attraverso il dosaggio che somministro.

Al di sopra del 50% potrebbe rappresentare un rischio nell’innalzamento della quota

▪ libera.

quota libera più alta

Esiste un paramento numerico che rende conto di tutta questa fase è il volume di distribuzione

apparente.

Volume di distribuzione

deve essere inteso come un paramento che riesce ad esprimere la capacità del farmaco di penetrare

nei tessuti in funzione della sua concentrazione plasmatica. Si parla di volume di distribuzione

apparente perché in funzione di ciò che rimane nella concentrazione plasmatica ci da l’idea che esso

occuperebbe se la quantità totale di farmaco nell'organismo fosse in soluzione ad una

concentrazione uguale a quella. Si calcola come rapporto tra M (quantità di farmaco presente

nell’organismo/ concentrazione plasmatica del farmaco ad un tempo definito). L’unità di misura è

litro/kilo.

Un volume di distribuzione elevato è indice che la maggior parte del farmaco si trova a

• livello extraplasmatico. 31

Volume di distribuzione basso vuol dire alta concentrazione nel plasma.

Un farmaco fortemente legato con alta affinità alle

proteine plasmatiche, avrà un volume di distribuzione

alto o basso? Basso, perché si troverà legato alle

proteine plasmatiche.

Il volume di distribuzione è un parametro che ci

identifica la distribuzione e ci da indicazioni anche

sulle fasi successive della farmacocinetica.

Più la concentrazione plasmatica di un farmaco è

elevata rispetto alla dose iniziale, più il valore

numerico del Vd sarà piccolo, ad indicare che il farmaco è scarsamente distribuito. Al contrario, una

bassa concentrazione plasmatica rispetto alla dose indicherà che il farmaco si è distribuito in altri

distretti dell’organismo ed avrà quindi un elevato volume di distribuzione.

→ L’emivita: tempo di dimezzamento. (calcolata sulla parte destra della curva). Più lungo sarà il

tempo di dimezzamento, maggiore sarà il tempo che il farmaco permane nell’organismo. Un

volume di distribuzione elevato, denominatore basso, poco nel plasma vuol dire che il farmaco si

trova nello spazio extraplsmatico, è associato ad un’emivita maggiore e meno a disposizione nel

metabolismo per l’escrezione. Un’emivita è direttamente proporzionale al suo volume di

distribuzione.

Un Vd grande ha un’importante influenza sul tempo di dimezzamento di un farmaco, poiché

• l’eliminazione di un farmaco dipende dalla quantità di farmaco che raggiunge il rene o il

fegato.

L’apporto di farmaco agli organi deputati all’eliminazione dipende non solo dal flusso

• sanguigno, ma anche dalla frazione di farmaco presente nel plasma.

Se il Vd di un farmaco è grande, la maggior parte del farmaco si trova nello spazio

• extraplasmatico e non è disponibile per gli organi escretori.

Un farmaco con un Vd elevato avrà un’ emivita e una durata d’azione maggiore rispetto ad

• un farmaco con un Vd minore 32

Metabolismo dei farmaci

Biotrasformazione del farmaco. È un aspetto importante e soggetto a numerose variabili. Il

metabolismo serve a trasformare molecole lipofile e assenti di cariche per facilitarne la loro

eliminazione, rendendole più idrosolubile. La funzione del metabolismo è anche quella di far

cessare l’attività farmacologica, in modo da renderla una molecola polare. Il metabolismo dei

farmaci molte volte può portare alla formazione di intermedi che non sono inattivi. Il fegato è

l’organo a livello del quale è presente tutto il pool enzimatico che servono a trasformare i farmaci.

Vi sono altri distretti dell’organismo che possono partecipare alla biotrasformazione dei farmaci,

come nel caso dei reni, dei polmoni e l’intestino (anche per azione della flora batterica).

Il processo di biotrasformazione epatica dei farmaci viene suddiviso in:

metabolismo di fase 1: rappresenta tutte quelle reazioni catalizzate da enzimi, che

• utilizzano come substrato il farmaco, inseriscono nella molecola di farmaco un gruppo

funzionale implicato nelle reazioni di fase 2. Si ha la formazione di metaboliti di fase 1. Tali

metaboliti vengono utilizzati dagli enzimi che vengono coniugati da forme endogene.

Formando dei complessi polari che sono la forma finale che viene eliminata dall’organismo.

metabolismo di fase 2: sono reazioni di coniugazione, con molecole endogene, in modo da

• avere il metabolita finale che ha tutte le caratteristiche necessarie per la sua eliminazione.

Non tutti i farmaci seguono questo schema. Alcuni farmaci possono saltare le reazioni di fase 1 o

possono presentare i vari gruppi funzionali e vengono a mancare i metaboliti primari di fase 1.

possono capitare dei casi dove il metabolita di fase 1 può essere direttamente escreto. Nella

stragrande maggioranza dei casi si hanno il susseguirsi delle fasi.

I metaboliti che possono generarsi sono inattivi o con una certa attività biologica. L'attività

biologica può dar luogo anche ad effetti tossici o anche ad un effetto farmacologico. Il

paracetamolo, metabolita tossico, subisce diverse vie biotrasformative. La reazione di fase 1 a cui

va in contro è una idrossilazione che da origine al parabenzochinone (matbolitia di fase 1) che ha

alta reattiva e tossica, ed è in grado di legare proteine e acidi nucleici. Questo metabolita viene

subito utilizzato nelle reazioni di fase 2 con la formazione dell’acido mercaptiurico che potrà essere

eliminato. Le reazioni di fase 2 sono processi saturabili. Se assumiamo un sovra dosaggio di

paracetamolo o non rispettiamo le tempistiche, per un po’ non abbiamo la formazione di

parabenzochinono, ma se la frequenza con cui assumiamo il paracetamolo si avrà l'accumulo del

33

metabolita intermedio. Accumulo di parabenzochinone porta danno alle macromolecola e

patotossicità da paracetamolo. Per questo che si deve aspettare almeno 4 ore per garantirci che il

parabenzochinonne possa essere coniugato e terminato.

Dal metabolismo dei farmaci si originano metaboliti dotati di attività biologica in cui si ha attività

farmacologica:

metaboliti farmacologicamente attivi: mantiene la capacità di legare lo stesso bersaglio

• terapeutico

manifesta attività farmacologica diversa

Le benzodiazepine sono una classe di farmaci ampiamente usate, in quanto hanno effetto

ansiolitico, sedativo, antiepilettici e danno luogo a metaboliti che sono ancora in grado di legare lo

stesso bersaglio. Si continua ad avere nel paziente un effetto terapeutico anche se la concentrazione

scende al di sotto della minima concentrazione attiva. La durata totale dell’effetto del farmaco

dipende dalla concentrazione plasmatica del metabolita.

Più raro è il caso i cui la biotrasformazione epatica produce una molecola diversa da quello del

composto di origine, come nel caso dell’ipronazide che acquista la capacità di inibire l’enzima

deputato alla biosintesi della parete dei batteri che portano alla tubercolosi.

La biotrasformazione epatica serve ad attivare una molecola originariamente somministrata in una

forma inattiva. Il profarmaco è una molecola inattiva dal punto di vista farmacologico che subisce

una trasformazione enzimatica nel nostro organismo. La bioattivazione epatica si attua perché molto

spesso il farmaco in questione non ha un processo di assorbimento ottimale. La codeina viene

biotrasformata in morfina che può entrare in circolo e attuare il suo effetto. Anche la codeina è un

profarmaco della morfina, ma non apporta a grosse quantità di farmaco.

La bioattivazione può anche essere extraepatica, dove si formula una molecola come profarmaco in

modo che la sua bioattivazione avvenga in un distretto esterno al fegato. Tale bioattivazione è tipica

di quei farmaci che:

1. hanno bisogno di diminuire la tossicità: si promuove la formazione del principio attivo solo

dove serve e deve incontrare il bersaglio terapeutico e si riduce la tossicità sistemica (come

nel caso di farmaci antitumorali)

2. hanno problemi nel processo della distribuzione, come nell’attraversamento della barriera

ematoencefalica. Si crea un profarmaco che è in grado di passare la barriera ematoencefalica

e che si bioattivano dopo il passaggio di tale barriera. Ad esempio la levodopa, che serve per

il trattamento per il morbo di Parkinson, che è dato da un calo della dopamina, non è in

grado di attraversare la barriera ematoencafalica, mentre la levodopa è un profarmaco

precursore della dopamina ed è convertita da una carbossilasi che rilascia la dopamina.

34 22/03/17

Le reazioni metaboliche epatiche a cui il farmaco va incontro sono suddivisibili in reazioni di fase I

(reazioni di funzionalizzazione) e fase II (reazioni di coniugazione). Si formano complessi più

polari rispetto al farmaco di partenza e quindi più eliminabili. I farmaci vengono escreti come

prodotti di coniugazione attraverso la bile oppure attraverso la filtrazione glomerulare. Si ricorda

che raramente un metabolita di fase I viene eliminato come tale, però ci sono casi rari in cui

presenta un gruppo funzionale di fase I, saltando la fase II. Nelle reazioni di fase II le molecole

endogene a cui si legano i metaboliti possono essere acidi (acetati, acidi glucoronico, acido

solforico), aa (glicina cisteina), glutatione.

La maggior parte dei farmaci in fase II vengono coniugati ad acido glucoronico e glutatione. Questi,

una volta legati, vengono escreti a livello intestinale attraverso la bile (acido glucoronico), oppure

con il glutatione (tripeptide) formando acidi mercapturici escreti attraverso le urine. La fase I

comprende numerosi enzimi coinvolti nella reazione di ossidazione, idrolisi, riduzione. E'

fondamentale sottolineare che nella fase II le molecole legati ad acido glucoronico e glutatione sono

metaboliti sempre inattivi (perchè nel legame viene modificata la molecola). Mentre la fase I che da

origine ai metaboliti intermedi, ovvero molecole leggermente modificate, che hanno la capacità di

legare macromolecole nell'organismo e quindi essere metaboliti reattivi, tossici o metabolicamente

attivi. Per questo motivo il metabolismo di tipo I risulta essere quello più studiato. Tra le reazioni di

fase I quella di ossidazione è la più importante perchè ha implicazioni importanti.

In generale, lo studio del metabolismo dei farmaci viene fatto prima possibile nello sviluppo di un

farmaco, in quanto tanto più lo studio in vitro di rapida esecuzione possono essere predittivi, quanto

più si ha la possibilità di portare in sviluppo i farmaci migliori per il loro utilizzo sull'uomo.

Il fegato è l'organo deputato al metabolismo, all'interno degli epatociti la maggior parte degli enzimi

deputati alle reazioni di coniugazione di fase II sono enzimi solubili: li troviamo nel citosol; mentre

la maggior parte degli enzimi che catalizzano le reazioni di ossidazione, idrolisi, riduzione nella

35

fase I si trovano nelle membrane endocellulari (ancorati sul REL oppure nei mitocondri). Questo

permette di studiare le due fasi in maniera separata. Per lo studio predittivo dei farmaci si comincia

con l'analisi in vitro della stabilità metabolica del farmaco. Se il metabolismo ha lo scopo di porre

termine all'attività farmacologica, la stabilità metabolica del composto parentale deve essere

sufficientemente legato, il principio attivo non deve essere immediatamente bioinattivato perchè

altrimenti non si raggiungerebbe mai la concentrazione plasmatica massima che deve stare nella

finestra terapeutica; ma neanche troppo stabile perchè non sarebbe in grado di andare incontro a un

metabolismo efficiente, e si avrà in circolo il farmaco per lungo tempo.

Come si studia la attività metabolica in vitro?

Essa ci dirà quale sarà la stabilità del metabolismo

epatico, in modo da classificare da questo punto di vista

la molecola in esame. Vi sono diversi modelli biologici

che possono essere studiati. I principali sono estratti dal

fegato umano che possiede enzimi rappresentativi di fase

I e II. Si possono utilizzare gli epatociti, quindi la cellula

intera, facendo la digestione del tessuto prelevato,

possono essere usati subito in piastra oppure

criopreservati, ovvero utilizzati successivamente nel

tempo. In realtà quello che è considerato il preparato

biologico ottimale è l'utilizzo di microsomi epatici

umani. Essi rappresentano un artefatto del processo di

centrifugazione differenziale a cui è sottoposto

l'omogenato umano. Questo artefatto è rappresentato da

frammenti di REL degli epatociti che vanno a formare

strutture circolari nella fase I.

Come si fa questo preparato?

L'omogenato di tessuto epatico umano viene sottoposto a una

centrifugazione a bassa velocità, ovvero 10000 gravità, si ottiene una

separazione di due fasi:

-un pellet che conterrà mitocondri, nuclei, frammenti di membrana

plasmatica dell'epatocita, tutto ciò che non ci interessa.

- un surnatante che viene chiamato frazione S9, il quale conterrà tutta

parte solubile dell'epatocita ovvero il citosol dove si trovano gli enzimi

biostrasformativi di fase II, e frammenti di REL con ancorati enzimi di

fase I. In questo modo si studia il metabolismo mediato sia da enzimi di

fase I, sia da quelli solubili di fase II. Studio completo.

Se questa frazione S9 viene poi sottoposta ad un'ultracentrifugazione di

100000 gravità, si ottiene un ulteriore la separazione di due fasi:

36

-un surnatante che rappresenta solo la frazione citosolica dell'epatocita, e che quindi conterrà solo

gli enzimi di fase II.

- pellet con frammenti di REL, i quali precipitando, danno origine a microsomi: fondamentali per

studiare, la reazione e la formazione di metaboliti di fase I (attivi e pericolosi).

Quindi il surnatante in questo caso potrà essere utilizzato per studiare il metabolismo specifico

catalizzato da enzimi di fase II. I microsomi, sono invece usati per la formazione di metaboliti

primari, grazie all'azione di enzimi biotrasformativi di fase I.

Come si studia la stabilità metabolica in vitro? Si fa uno studio predittivo, veloce: si usa il

preparato biologico, ovvero microsomi o epatociti interi, si incuba il campione con la molecola su

cui si vuole testare l'attività metabolica ad una temperatura ottimale e un tempo sufficiente

(soprattutto per le reazioni di ossidazione), poi al termine del periodo di incubazione tramite

cromatografia liquida associata alla spettrometria di massa si va ad analizzare il farmaco parentale

che è rimasto immodificato dopo l'incubazione (NON SI VA A INDIVIDUARE QUALI TIPI DI

METABOLITI SI FORMANO), si verifica perciò quanto sarà metabolicamente stabile è la

molecola. Si trova la percentuale di principio attivo rimasto chimicamente immodificato dopo

l'incubazione (percent remaining). Ciò che si determinerà prima e dopo l'incubazione del composto

è la quantità di farmaco che è stato introdotto! In particolare in un campione non verranno inseriti

epatociti o microsomi e nell'altro invece verranno messi: si avrà la quantificazione in assenza

biotrasformazione (in assenza di preparato biologico); e si avrà anche la quantificazione del

farmaco immodificato durante l'incubazione nei preparati biologici. Esprimendo il valore

percentuale del composto rimanente rispetto al totale si ottiene il percent remaining a un tempo

fisso, che solitamente è dopo 30 min o dopo 60 min.

Microsomi/epatociti: 0.3 - 3mg/mL proteina (generalmente 1mg/mL) in tampone fosfato

• composto in studio: ( i.e. 1 M)

• Incubazione per 30 minuti a 37°C in presenza di NADPH

• Osservazione: 0 – 30 min

• Analisi LC/MS/MS del composto parentale

• Percentuale di principio attivo immodificato rimanente (percent remaining).

Il percent raminig p il rapporto percentuale fra la concentrazione del principio attivo immodificato

al termine dell’incubazione (es. 30 minuti, C ) e quella iniziale (C )

30 0

Con questo metodo di screening è possibile classificare le molecole in sviluppo in tre classi:

Composti scarsamente stabili con percent remaing <30% (stabilità metabolica nei confronti

• di enzimi metabolici umani, non di tutti gli esseri viventi)

Composti moderatamente stabili con percent remaining tra 30-80%

• 37

composti metabolicamente stabili con percent remaining > 80%

La quantità giusta è tra 30 e 80% perchè tempo adeguato, finestra terapeutica

Si scartano perciò i composti metabolicamente stabili e scarsamente stabili, ma consideriamo quelli

con range ampio ovvero con stabilità metabolica moderata (metabolismo non troppo veloce per

raggiungere la stabilità terapeutica ottimale, ma neanche così stabili dal punto di vista metabolico

perchè la persistenza è un problema: vedi accumulo di più dosi → tossicità).

Questo test, però come detto in precedenza, non permette di studiare i metaboliti che si formeranno:

una volta che la molecola è stata approvata dal punto di vista metabolico e quindi il suo processo di

sviluppo sarà portato avanti, verranno fatti test (attraverso i processi cromotografici), con cui si

identificherà ogni singolo metabolita di fase I e II a partire dal composto parentale: in linea teorica

si testerà la tossicità e l'attività farmacologica.

Enzimi del metabolismo degli xenobiotici

Tra le reazioni di fase I, si considera una

reazione di funzionalizzazione che è

l'ossidazione. Tra enzimi di fase I che

partecipano ai processi, si parlerà della

reazione catalizzata dal sistema enzimatico

citocromo p450. Quest'ultimo assume un

importanza fondamentale nel metabolismo

dei farmaci, in quanto può determinare

tante conseguenze nella terapia

farmacologica. Si stima che più dell'80%

dei farmaci in commercio subiscano la

reazione di ossidazione

catalizzata da p450

come principale via

trasformativa a livello

epatico. Tale enzima è deputato al catabolismo di numerose sostanze endogene,

in particolare vitamine, ormoni steroidei, acidi grassi. Questo aspetto è

importante perchè il sistema nell'attività farmacologica sarà in grado anche di

biostrasformare composti endogeni. Questo enzima è presente anche con livelli

di espressione più bassi anche in tutti altri tessuti: i livelli maggiori sono nel

fegato (a livello del reticolo endoplasmatico “frazione microsomiale”), SNC

e intestino.

Il citocromo p450 è un emoproteina, caratterizzato dalla presenza di un

gruppo eme in cui il ferro in forma ridotta o ossidata è responsabile della

reazione di ossidazione che questa emoproteina catalizza. Perchè si chiama

citocromo p450? Perchè nella sua forma ridotta, in cui il ferro ha valore 2+ è

legato al monossido di carbonio o ossigeno, e in questa forma assorbe la luce

38

a lunghezza d'onda di 450nm. Qual è il suo ruolo nel

metabolismo dei farmaci? E' una monoossigenasi dal

punto di vista enzimatico: inserisce un atomo di

ossigeno nella molecola substrato (farmaco). Qual'è

la reazione di biotrasformazione dei farmaci

substrati? Il citocromo p450 nella sua forma ossidata

3+

(Fe ), presenza affinità per le molecole substrato

ovvero il farmaco. Si forma un primo complesso

citocromo p450+farmaco, a questo punto per

introdurre un atomo d'ossogeno, in modo che il

metabolita primario presenti un gruppo ossidrile, il

citocromo deve poter legare l'ossigeno, ma per far ciò

si deve trovare in forma ridotta perchè solo in questa modo presenta l'affinità per esso: arriva un

elettrone da NADPH, il citocromo p450 riduttasi dona un elettrone al citocromo p450, il ferro si

riduce, si ha un composto binario (citocromo p450 ridotto+farmaco che può legare l'ossigeno), si

forma poi un composto ternario instabile (citocromo p450 ridotto+farmaco+ossigeno). Trattandosi

di una monoossigenasi si possono fare le seguenti osservazioni: un atomo della molecola di

ossigeno si lega al farmaco, l'altro atomo di ossigeno insieme a due protoni che giungono

contempranemente a due elettroni forma acqua. A questo punto giunge un secondo elettrone che

può essere donato dal NADPH e trasferito al complesso mediante il citocromo p450 reduttasi,

oppure il donatore può essere il NADH che attraverso il citocromo B5 media l'arrivo del secondo

elettrone. Il farmaco si stacca dal complesso e il ferro torna in stato 3+: in questo modo il citocromo

p450 può legare un altra molecola substrato e far partire un altro ciclo.

39

Qual'è la rilevanza nella terapia farmacologica?

Proprio per il suo ruolo importante nel metabolizzare a livello epatico sia molecole endogene, sia

perchè deputato al metabolismo di xenobiotici (molecola esogena con cui si può avvenire in

contatto: alimenti, inquinanti ambientali, farmaci), il citocromo p450 nel processo di evoluzione ha

portato alla formazione di numerose isoforme differenti. Sono più di 60 geni diversi ognuno dei

quali codifica per una diversa isoforma di p450. L'attività e la reazione è la medesima, perchè si

tratta sempre di una monoossigenasi, però ogni specifica isoforma riconosce substrati differenti.

La nomenclatura del citocromo p450 prevede:

-abbreviazione di citocromo p450

-un numero che designa la famiglia esempio citocromo p450 della famiglia 1,2,3,4

-una lettera che va ad identificare la sotto-famiglia esempio citocromo 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 3C

ecc.

- un altro numero che indica il gene specifico nell'isoforma specifica. Esempio si parlerà di

citocromo p450 3A4 (famiglia 3, sottofamiglia A, isoforma specifica 4)

Se si va ad osservare durante il processo di evoluzione delle isoforme, si può notare che le famiglie

1,2,3 si sono conservate durante il processo evolutivo e hanno dato origine a numerose isoforme

differenti:

-La famiglia 1, Famiglia A e B, e a sua volta isoforma 1A1, 2B1

-La famiglia 2 Sottofamiglia A,B,C,D,E,F con le diverse isoforme, e così per la terza.

Mentre le famiglie dalla 4 in avanti si sono conservate di più. Qual è la differenza? Le famiglie che

hanno dato origine a una diversificazione maggiore rispetto alle altr sono le isoforme di citocromo

p450 deputate al riconoscimento e biotrasformazione delle sostanze esogene, quindi questo indica

che per quanto riguarda il metabolismo dei farmaci solo le prime 3 famiglie sono implicate. Le

famiglie di citocromo p450 deputate l metabolismo e all'omeostasi delle sostanze endogene non

siano mai coinvolte nel metabolismo dei farmaci. All'interno delle prime 3 famiglie, il relativo

contributo di ogni specifica isoforma nel metabolismo dei farmaci in uso è visibile nella slide:

-la maggior parte dei farmaci in commercio (36% di

questi) subiscono reazione di fase I mediata dalle

isoforme 3E4, 3E5 del citocromo p450

-il 19% dei farmaci subisce un metabolismo

dell'isoforma 2B6 del citocromo p450

e così via

Tanti farmaci → tanti enzimi → tante isoforme Le

reazioni di ossidazioni sono le più frequenti (reazioni ad imbuto) e catalizzate dal citocromo p450.

Tra le isoforme solo alcune famiglie (la 2 e la 3 nello specifico) e sottofamiglie sono imputabili al

metabolismo dei farmaci. 40

Il metabolismo dei farmaci rispetto a tutte le altre fasi della cinetica è quello meno prevedibile, e

quindi più soggetto a variazioni indipendenti dalla somministrazione farmacologica. Esistono

diversi fattori che si distinguono in fattori ambientali e fattori genetici che possono modificare la

biotrasfromazione epatica.

I fattori ambientali sono:

-età: l'attività del pool di enzimi trasformativi epatici che è diversa in conseguenza all'età. La

posologia ottimale fornita è studiata sull'adulto, ma no bisogna dimenticare che le capacità

metaboliche epatiche sono ridotte sia nei bambini e che negli anziani (velocità di un farmaco alla

stessa dose che viene metabolizzato è diversa). Questo rappresenta un problema perchè non esistono

trial specifici che permettano di studare i farmaci ideali, posologie ideali per l'età pediatrica, spesso

non si fa altro che dare ai bambini dosi diversificate del farmaco che però è stato studiato

nell'adulto. Ciò potrebbe portare all'alterazione del processo della farmacocinetica! Ad esempio nel

bambino la barriera ematoencefalica è ridotta. Dunque l'età altera il metabolismo dei farmaci.

RICORDA: Invecchiamento fisiologico sopra i 75 anni.

-altre situazioni come lo stato di gravidanza altera le attività metaboliche.

-patologie (epatiti, infezioni virali, alterazioni delle transaminasi). Qualsiasi patologia epatica

concomitante alla malattia che bisogna curare, può alterare di molto le capacità metaboliche.

La patologia epatica però si può diagnosticare, così come l'età e quindi si può porre attenzione nella

somministrazione di un farmaco. I fattori ambientali che modificano di molto il metabolismo dei

farmaci e che difficilmente si può controllare come medici quando si fa una terapia è lo stile di vita:

Tra le sostanze tra cui si fa più abuso/uso e che alterano il metabolismo dei farmaci sono l'alcol e il

fumo. Esempio: a parità di patologia da curare, e di altri fattori (età, funzionalità epatica ecc),

posologia uguale, il metabolismo può essere molto diverso in funzione dell'aboso di tali sostanze. In

entrambi i casi l'abuso, determina l'assuzione continuativa di etanolo o nicotina determinano un

aumento del metabolismo epatico: un alcolista avrà un metabolismo epatico accelerato rispetto

all'atteso: il farmaco potrebbe avere meno effetto, si abbassa la Cmax e potrebbe scendere al di

sotto della minima concentrazione attiva. Lo stesso avviene con il tabacco.

L'assunzione occasionale (ingestione acuta) di alcol, ha anch'esso effetto sul metabolismo: ne

riduce la velocità di metabolismo dei farmaci (l'alcol è un caso particolare!!). NON SI DEVONO

ASSUMERE FARMACI IN CONCOMITANZA DI ALCOL

Per tantissimi anni si è pensato che la variabilità individuale nella risposta a una terapia

farmacologica fosse imputabile solo a fattori ambientali. Anche una popolazione omogenea in cui il

range di età è limitato, se venisse dato lo stesso farmaco, con lo stesso dosaggio, per curare la

medesima patologia ci sarebbe una grande variabilità nella risposta alla terapia. Difficilmente è

causato solo a fattori ambientali!

Negli ultimi anni è stato dimostrato che la variabilità individuale a una risposta farmacologica

imputabile a un alterato metabolismo di un farmaco, abbia in realtà una base genetica. Nasce una

41

branca della farmacologia detta farmacogenetica: studia la correlazione tra patrimonio genetico in

relazione a enzimi metabolizzanti e l'alterata risposta alla terapia farmacologica.

Ricorda la strategia empirica: se c'è una diagnosi della patologia, la legge obbliga il medico a

fornire il farmaco alla dose descritta e per un tempo determinato indipendentemente dall'individuo e

dal corredo genetico.

Cosa si intende per fattori genetici imputabili ad un alterato metabolismo del farmaco, che si riflette

in risposte diverse da individui differenti, i quali assumono la stessa identica terapia farmacologica?

La variabilità genetica associata ad un alterato metabolismo dei farmaci è quello che oggigiorno

rende conto di più quelle che sono le risposte assolutamente imprevedibili che un individuo può

avere nei confronti di una terapia convenzionale. Le risposte sono dovute alla variabilità dei geni

codificanti per enzimi deputati al metabolismo dei farmaci e in particolare alle diverse isoforme del

citocromo p450.

Qual'è l'impatto delle varianti geniche? Le famiglie del citocromo p450 sono responsabili

dell'ossidazione dei farmaci (soprattutto la 2 e la 3). Nelle diverse isoforme responsabili del

metabolismo dei farmaci sono stati identificate alcune varianti polimorfiche. Per esempio: per

quanto riguarda il gene che codifica per citocromo p450 nella sua isoforma 2D6, il quale nella sua

forma wt metabolizza quasi il 20% dei farmaci a disposizione, sono state identificate delle varianti

alleliche. Ci sono individui con citocromo p450 2D6 con variante allelica 1 wt, e altri con variante

allelica 2 wt ecc. con attività enzimatica diversa.

Il gene che codifica per questa isoforma di citocromo p450 è stato trovato in varianti polimorfiche

numerose (con il progetto di genoma umano). La maggior parte di queste non hanno un impatto

biologico. Però bisogna considerare la variante 4, 5,10,17: ognuna presenta una modificazione che

rende conto di una variabilità rispetto la forma wt nella attività degli enzimi.

-Per esempio la variante 4 è associata alla produzione di un citocromo completamente inattivo: gli

individui che portano questa variante che a sua volta è dovuta a un polimorfismo a singolo

nucleotide, il quale determina uno splicing non corretto, porta alla formazione di una proteina

inattiva. Questi individui non hanno un citocromo p4502D6 funzionante.

-L'individuo che porta la variante 5 derivante da una delezione, non c'è espressione di questa forma

di citocromo 2D6

-Nella variante 10 avviene nel polimorfismo a singolo nucleotide una doppia sostituzione di due aa

nella sequenza enzimatica. Queste sostituzioni aumentano il tournover della proteina rendendola più

instabile. Individui che portano la variante 10 avranno l'enzima che si forma correttamente dotati di

attività catalitica, ma essendo instabile a causa del tournover accelerato, l'attività metabolica finale

risulta ridotta rispetto a un individuo wt.

- nella variante 17 si verifica una tripla sostituzione aa, in questa forma il citocromo p450 rispetto a

wt presenta una riduzione nella sua affinità verso il substrato (farmaco). Funziona, ma è ridotta la

capacità biostrasformativa. 42

-Per il citocromo p450 2D6 sono stati trovati casi di multiduplicazione genica: pazienti che

presentano geni in più copie e questo aumentando l'espressione dell'isoforma del citocromo p450

determina in questi pazienti un aumento dell'attività enzimatica.

La figura è indicata la frequenza delle varianti alleliche specifiche nelle differenti etnie: nella razza

caucasica la frequenza con cui è presente l'allele 4 è del 20% quindi significativo. Questo avviene

dal punto di vista genetico.

Cosa succede dal punto di vista fenotipico?

-Ci sono individui vengono chiamati metabolizzatori mediamente poveri: la presenza della forma

wt del gene codificante per la specifica isoforma del citocromo p450 rende l'attività dell'individuo

che la porta, metabolizzatore estensivo. Tutti gli studi di sviluppo farmacologico sono fatti su

individui che presentano una normale capacità biostrasformativa, con variante wt, e quindi sono

considerati dal punto di vista metabolico, per ogni specifica isoforma metabolizzatori estensivi. La

posologia, ovvero la dose prescelta deve dare una curva di concentrazione plasmatica in cui la

concentrazione del farmaco deve stare nella finestra terapeutica.

-Se si da la stessa dose a individui che presentano varianti che portano ad avere una ridotta attività

dell'enzima, questi fenotipicamente sono o metabolizzatori intermedi o metabolizzatori poveri. Chi

porta la variante 10 o 17 sarà fenotipicamente un metabolizzatore intermedio perchè c'è ancora

una attività enzimatica residua. Soggetti portano la variante 5, saranno metabolizzatori poveri.

-Individui che porteranno una multiduplicazione genica con aumento dell'espressione di porteina

questi avranno un attività metabolica molto più rapida rispetto a wt e fenotipicamente verranno

chiamati metabolizzatori ultrarapidi.

Ognuna di queste condizioni fenotipiche è associata a un genotipo diverso. Non è possibile sapere

in antecedenza che tipo dimetabolizzatore sarà l'individuo e quindi le terapie mediche

presuppongono che la dose e intervallo di somministrazione siano uguali per tutti!

Se un metabolizzatore intermedio povero assume la dose di farmaco standard, questa sarà

metabolizzata lentamente, la curva di concentrazione plasmatica si alza fino a sforare la minima

concentrazione tossica. Tali individui saranno dei normali responders in termini di efficacia, perchè

la concentrazione minima attiva viene raggiunta, ma possono sforare la finestra di tossicità e quindi

il paziente nella risposta terapeutica avrà effetti tossici non previsti! Se questa dose normalmente

potrebbe dare effetti collaterali (mal di pancia, cefalea), in questo caso può dare effetti tossici

maggiori, letali. E' un quadro che si potrebbe avere nell'overdose di farmaci.

L'individuo che porta la variante 5 è un metabolizzatore povero (stesso citocromo), tutti i farmaci

che utilizzano quella specifica isoforma di citocromo, avranno un incremento della curva di

concentrazione plasmatica. Per tutti questi farmaci ci si aspetta un incremento della tossicità dei

farmaci tanto da essere letale? L'individuo che porta la variante 5 non esprime l'enzima, ha un

rallentato metabolismo e la curva di concentrazione citoplasmatica si alza. Substrati di questo

citocromo sono ad esempio 10 farmaci. In tutti questi 10 farmaci si incrementerà la Cmax? Sì,

perchè il metabolismo è analogalmente rallentato. Cosa cambia per ogni singolo farmaco? la

finestra terapeutica. Quindi per tutti i farmaci che vengono metabolizzati per quell'isoforma ci sarà

43

lo stesso incremento della concentrazione plasmatica, ma il fatto che possa uscire dalla finestra

terapeutica dipenderà da farmaco a farmaco.

Farmaci con indice terapeutico ristretto sono farmaci per i quali qualsiasi alterazione del

metabolismo, sia geneticamente determinato, o determinato da fattori ambientali, determina un

incremento nella concentrazione plasmatica che anche se piccolo da una risposta indesiderata.

Farmaci con indici terapeutici grandi sono più sicuri, in quanto la risposta anche in presenza di

variabili genetiche, ambientali o legati al metabolismo potrebbero avere un influenza relativamente

bassa.

Se fosse possobile prevedere a priori genotipizzando il paziente, gli eventuali rischi in presenza di

una di queste varianti di un metabolizzatore povero e intermedio, permetterebbe di diminuire il

dosaggio fino a riportare la curva alla concentrazione plasmatica che sta all'interno della finestra

terapeutica! Ovvero fare la terapia personalizzata.

Se fosse invece un metabolizzatore ultrarapido, a cui somministro la dose convenzionale di

farmaco, presenti una curva di concentrazione plasmatica che potrebbe non raggiungere la minima

concentrazione attiva. In questo caso nella indivialità della terapia farmacologica si osserverà la

risposta alla terapia (è non responders quindi pericoloso perchè non si sta curando la patologia che

andrà avanti). La genotipizzazione permetterebbe di aumentare il dosaggio.

Però bisogna considerare oltre alla concentrazione di farmaco anche la variazione della

concentrazione dei metaboliti. Cosa succederà in questo caso?

-A un metabolizzatore povero e medio l'evento negativo è legato all'aumento della concentrazione

del farmaco parentale, in quanto i metaboliti saranno a una concentrazione bassa nel caso in cui

sono attivi. Questi individui risulteranno responsivi, ma aumenta esacerbazione degli effetti tossici

da parte del farmaco parentale.

-Per il metabolizzatore ultrarapido si avrà una diminuzione della concentrazione del composto

parentale, ma aumenteranno i metaboliti che producono. Non risponde alla terapia, che risulta

inefficace. Pertanto si avrà un esacerbazione per gli effetti tossici da parte dei metaboliti.

Cosa succede se ad essere somministrato agli individui è il pro-farmaco?

Negli intermedi poveri ci si aspetta che non ci sia effetto: il pro-farmaco si accumula e non c'è

conversione a principio attivo e non raggiungerebbe la minima concentrazione attiva. Se il pro-

farmaco viene somministrato a un metabolizzatore ultrarapido si potranno avere effetti, ma si avrà

anche un aumento della minima concentrazione tossica. 27/03/2017

Induzione farmaco-metabolita

Il citocromo p450 può essere oggetto sia del processo di induzione dei farmaci sia di inibizione. Le

conseguenze dei processi portano ad un alterato metabolismo, in modo analogo alla base genetica.

La variabilità dell’attività catalitica di questo citocromo, non è di base genetica, ma sono gli stessi

farmaci, a livello catabolico, ad indurla o inibirla. Molti farmaci che abbiamo già in uso, che non

44

sono stati testati a priori per questa capacità, rimangono induttori o inibitori del sistema del

critocromo p450. Si hanno conseguenze nella modificazione della curva di concentrazione

plasmatica dei farmaci. L’inibizione di questo sistema avviene a livello della prima

somministrazione del farmaco, il processo di induzione si ottiene a seguito di una somministrazione

ripetuta, cronica. Tale processo viene definito come “induzione farmaco-metabolica” che si traduce

in un aumento del metabolismo e normalmente a una riduzione dell’azione farmacologica, non solo

della sostanza induttrice, ma anche di farmaci somministrati contemporaneamente all’induttore. Si

avrà una diminuzione della CMAX che riduce l’intensità dell’effetto farmacologico e, se va al di

sotto della minima concentrazione attiva, si arriva alla scomparsa dell’effetto.

L’induzione metabolica non riguarda solo il farmaco ma anche tante altre sostanze, come

xenobiotici che possono essere somministrati.

L’induzione farmaco-metabolica si traduce in una accelerazione del metabolismo e, normalmente,

in una riduzione dell’azione farmacologica non solo della sostanza induttrice, ma anche di farmaci

somministrati contemporaneamente all’induttore.

Esistono alcuni farmaci per i quali il meccanismo di induzione farmaco-metabolica è stato

caratterizzato e sono in grado di legare alcuni recettori nucleari, che una volta attivati, traslocano

nel nucleo, legano le sequenze specifiche e attivano la trascrizione del gene codificante il citocromo

p450, sono i cosiddetti recettori off-targets. Sono noti anche altri farmaci di regolazione post

trascrizionale, che aumentano l’azione del citocromo p450 stabilizzando l’mRNA; altri ancora

agiscono più a valle e rallentano il tournover proteico, stabilizzando la proteina.

Aspetti importanti dell’induzione farmaco-metabolica:

l’aumento dell’attività enzimatica avviene in seguito alla somministrazione cronica.

• 45

Tempo necessario 1-2 settimane. Non esistono farmaci induttori che provochino l’aumento

• del metabolismo in meno di due settimane.

Biosintesi ex-novo degli enzimi

• dopo la sospensione dell’induttore l’attività biotrasformativa della via enzimatica indotta

• torna lentamente alla norma.

Conseguenze dell’induzione enzimatica:

aumenta la velocità con cui avviene la biotrasformazione epatica del farmaco

• aumenta la velocità di formazione dei metaboliti

• diminuzione dell’emivita plasmatica, che indica il tempo per il quale il farmaco permane

• nell’organismo. Tempo necessario affinché la CMAX si dimezzi.

diminuzione delle concentrazione plasmatiche totali di farmaco

• diminuzione degli effetti farmacologici qualora i metaboliti siano inattivi (tolleranza

• metabolica).

Tolleranza ai farmaci

La tolleranza farmacologica è definita come l'incapacità di una dose di un farmaco, di evocare, dopo

dosi aggiuntive, il medesimo effetto dato dalla prima somministrazione. È la perdita di una dose

efficace di farmaco di continuare a dare origine all’effetto desiderato. Si ha la perdita di efficacia, a

parità di dose, a seguito di somministrazioni ripetute.

Tolleranza metabolica o di natura farmacocinetica: i farmaci induttori metabolici, che

• sono in grado di aumentare una specifica isoforma di p450, portano allo sviluppo di

tolleranza al farmaco.

Farmacodinamica: è legata ad una desensitizzazione o down regulation dei recettori

• bersaglio del farmaco. In questo caso l’aumento del dosaggio non ha alcun vantaggio.

L’unica strategia per ridurre le conseguenze di questa tolleranza è di predisporre un piano di

trattamento che preveda un periodo di sospensione.

Inibizione metabolica

Riduzione temporanea o prolungata dell’attività degli enzimi responsabili del metabolismo dei

farmaci.

A seguito del rallentamento del metabolismo si avrà un aumento della CMAX e si avrà anche un

aumento degli effetti aversi e degli effetti tossici.

Nella maggior parte dei casi essa determina:

un prolungamento della durata degli effetti del farmaco il cui metabolismo è inibito

• (aumento dell’emivita e della permanenza del farmaco nel organismo)

46

un aumento dell'intensità degli effetti

• un aumento della tossicità (numero e gravità degli effetti indesiderati)

Bisogna capire la durata del tipo di inibizione

I meccanismi di inibizione del citocromo p450 più tipici e le conseguenze degli inibitori metabolici

sono:

1. inibizione reversibile: ripresa dell’attività enzimatica nel

momento in cui sospendo il trattamento farmacologico. Sono

substrati dell’enzima ed inibiscono quindi la metabolizzazione

di altri composti per competizione (inibitori competitivi).

Alcuni inibitori modificano l’attività catalitica dell’enzima

legandosi a siti allosterici (inibitori non competitivi). La

conseguenza prevede la sospensione dell’attività del farmaco che porta ad una ripresa

all’attività metabolica normale. Dal punto di vista molecolare si hanno farmaci inibitori

reversibili del p450, che sono substrati del citocromo.

2. inibizione quasi irreversibile (tempo dipendente): alcuni metaboliti

prodotti dalla biotrasformazione del farmaco parentale, formano un

complesso con l’enzima, si ha una trasformazione dei complessi, nei

cosiddetti complessi metabolici intermedi, che non si dissociano in

maniera rapida, ma rimangono stabilmente associati. Più è lungo il

tempo che il citocromo viene sequestrato più ridotta è la sua attività

catalitica. Viene definita quasi irreversibile perché non si hanno legami forti e i legami che

danno origine al complesso è facilmente reversibile. Si tratta di complessi metabolici

intermedi poco stabili. in vivo, la durata per cui questi complessi permangono, fa si che

questo tipo di inibizione si chiami tempo dipendente. La stabilità di questi intermedi

complessi è talmente lunga che fa si che in questi pazienti si veda una riduzione reversibile

fino alla sospensione del trattamento del metabolismo mediato da questo sistema.

3. inibizione irreversibile: farmaci inibitori del citocromo p450 sono quelli

che se scoperti in via di sviluppo vengono prontamente abbandonati. Tale

inibizione viene definita anche come inibizione suicida, perché lo stesso

metabolita dall’inibizione parentale porta all’inattivazione irreversibile.

Farmaci contenenti certi gruppi funzionali possono essere ossidati dal cit

p450 ed intermedi reattivi, che si legano covalentemente all’enzima prima

del loro distacco dal sito attivo, causandone l'inattivazione irreversibile.

L’inibizione irreversibile del CYP450 avviene per formazione di radicali

intermedi che alchilano l’eme, l’eme per il ferro e si forma una porfirina

anormale N-alchilata.

Alcuni farmaci utilizzano più di una via biotrasformativa e ciò vuol dire che i farmaci hanno una via

preferenziale biotrasformativa e alcune vie biotrasformative secondarie, che nel caso in cui quella

principali non funzioni, possono attivarsi, diventando preponderanti in assenza di quella principale.

47

L’inibizione degli enzimi metabolizzanti causa una aumento dei livelli plasmatici dei farmaci da

essi biotrasmati e quindi un incremento e di un prolungamento della loro azione. Se il farmaco il cui

metabolismo è inibito ha un ristretto margine terapeutico, le conseguenze possono essere

clinicamente rilevanti. Le conseguenze possono essere particolarmente gravi se l’enzima inibitore è

il solo o il principale responsabile della biotrasformazione del farmaco.

Possono esistere vie metaboliche secondarie che diventano la via principale quando essa è alterata.

Se il metabolismo risulta indotto o inibito, mi aspetto che l’entità della variazione della curva di

contrazione plastica, sia egualmente variata. Non per tutti i farmaci che agiscono si ha lo stesso

effetto, in quanto ogni farmaco ha la propria finestra terapeutica.

Se il farmaco ha una finestra terapeutica ristretta anche le più piccole variazioni della cmax possono

determinare la fuoriuscita dall’indice terapeutico.

Data l’importanza del processo di induzione- inibizione, un’altra delle valutazioni che si effettuano

durante il processo di sviluppo di un farmaco è l’azione del citocromo del p450. Vi sono sistemi

piuttosto rapidi per determinare se le varie molecole in sviluppo possiedono queste caratteristiche

negative. Si hanno due modalità diverse per screenare l’inibizione e l’induzione.

Inibizione: si incuba su piastra la molecola

• con preparato biologico (epatociti) per alcuni

minuti. Per studiare l’attività del citocromo

p450, in presenza o in assenza della molecola

in studio, si aggiunge un substrato di citp450.

Per ogni isoforma di p450 nota per

biotrasformare i farmaci, esiste un substrato

noto preferenziale. Per ogni isoforma di p450

otterrò una curva, che in assenza della

molecola darà un’attività del 100%,

all’aumentare della concentrazione della molecola, mi aspetto una sigmoide che cresce

all’aumentare della concentrazione. Se l’attività non cambia non c’è l’effetto dell’inibizione.

Si procede, poi, al calcolo del parametro che ci indica l’entità dell’inibizione del citocromo.

IC (concentrazione di farmaco che è in grado di determinare l’inibizione del 50%

50

dell’attività catalitica) deve essere lontana dalla concentrazione del farmaco che mi serve per

ottenere l’effetto. Più è bassa IC50 più è minima la concentrazione di farmaco in grado di

determinare l’inibizione.

Induzione: non si usano solo epatociti incubati con il composto, ma si usano epatociti che

• crescono fino a confluenza e si fanno incubare con il composto per due giorni, che mima, in

vitro, l’esposizione cronica del paziente al farmaco e si continua con lo stesso procedimento:

substrato selettivo, determino l’attività con analisi dei prodotti e si ottiene una curva, dove

metto la percentuale di induzione sull’asse delle y.

48

Eliminazione

Ultimo processo della farmaco cinetica. Quello che viene eliminato: piccola percentuale di farmaco

non modificato, grande percentuale dei suoi metaboliti (di fase 1: molecola parentale con piccole

modificazioni e metaboliti di fase 2: molecole coniugate con glutatione o acido glucoronico)

Le due principali vie di eliminazione dei farmaci sono la via biliare e la via renale. Attraverso la

via biliare vengono eliminati farmaci con grosso peso molecolare. La maggior parte dei farmaci

coniugati vengono eliminati attraverso la bile e pertanto li troviamo nell’intestino. I metaboliti

coniugati all’acido glucoronico seguono prevalentemente la via epatica. I metaboliti polari di fase 1

e quelli coniugati con glutatione seguono la via renale. Esistono anche altre vie attraverso cui il

farmaco e i suoi metaboliti possono essere escreti: secrezione dei farmaci attraverso la via

mammaria, via polmonare, annessi cutanei (unghie, capelli).

Escrezione mammaria

Di norma i farmaci, quando somministratati a dosi normali, passano nel latte in modica quantità, tali

da non provocare disturbi al lattante. In genere l’allattamento è sconsigliato se il farmaco ha un

rapporto di concentrazione latte/plasma di 1. Rapporti maggiori di 1 sono correlati ad una buona

probabilità di ritrovare il farmaco nel latte materno. Molti agenti antineoplastici sono

particolarmente dannosi per il bambino e si trovano ad alte concentrazioni nel latte. Tra le sostanze

che normalmente possono essere escrete e passare al latte vi sono molte sostanze d’abuso.

Escrezione polmonare

solo gli anestetici generali e l’alcol etilico presentano questa via di escrezione

49

Annessi cutanei

soprattutto i capelli. Temporalmente parlando, nella curva di concentrazione plasmatica, la

rilevabilità della farmacocinetica è in termini di ore. Essendo la via renale la via principale di

eliminazione dei farmaci, risulta essere una modalità facile per ottenere il campione, ma anche qui

la rilevabilità del farmaco è temporalmente limitata a dei giorni. I capelli ci permettono di

determinare l’assunzione di alcui farmaci per mesi e questo è uno dei motivi per cui la matrice dei

capelli sta guadagnando sempre più importanza, soprattuto a livello forense. Se nel primo

centimetro non vi è traccia della sostanza, tale sostanza non è stata assunta di recente, a seconda dei

centimetri si può datare l’assunzione, in quanto il capello cresce di un centimetro al mese ( in

teoria). Questo è un metodo importante per controllare l’efficacia dei trattamenti attuati nei pazienti

che abusano di diverse sostanze illecite. Matrice importante dal punto di vista temporale. 29/03/2017

Escrezione epatica

L’escrezione dei farmaci nella bile è influenzata principalmente da due caratteristiche fisiche: la

polarità e il peso molecolare del metabolita che si deve eliminare. La presenza di un gruppo polare

ed è per questo che i composti vengono coniugati ad acido glucoronico. Vengono escreti dalla bile

solo composti con un perso molecolare maggiore di 300-500.

50

Ciclico entero epatico

Si ricorda l’effetto di primo passaggio epatico discusso nella fase di assorbimento: quando un

farmaco viene somministrato per via orale, passa indenne nello stomaco e viene assorbito

nell’intestino. Il passaggio dall’intestino al torrente circolatorio, fa si che il farmaco venga assorbito

nel sistema portale epatico e quindi giunge al fegato prima di essere immesso nel circolo sistemico.

L’effetto di passaggio epatico: parte del farmaco può già subire metabolismo epatico ed essere

inattivato, prima di entrare nella circolazione sistemica. In sostanza diminuisce la quantità di

farmaco che arriva immodificata al torrente circolatorio, ovvero quella biodisponibile.

I farmaci sia che vengano metabolizzati subito, sia che lo facciano successivamente, danno origine a

metaboliti, i quali si coniugano all’acido glucoronico, vengono escreti dalla bile e riversati

nell’intestino. Cosa succede? Nell’intestino esistono degli enzimi batterici che sono le beta

gluconoridasi, la cui presenza è fisiologica e catalizzano la scissione dei complessi coniugati, dando

origine ad acido glucoronico libero e parte di questo farmaco originato dalla scissione può essere

reso disponibile ancora per l’assorbimento intestinale e non essere escreto: rientra nella

circolazione, nel fegato, viene coniugato all’acido glucoronico, riversato dalla bile nell’intestino.

Questo evento viene detto circolo enteroepatico. L’eliminazione di composti di fase II coniugati è

lenta perché appunto sussiste questo meccanismo. Se l’effetto di primo passaggio epatico sfavorisce

la biodisponibilità dei farmaci somministrati per via orale, il processo di circolo entero-epatico

rallenta l’eliminazione dei farmaci coniugati all’acido glucoronico che utilizzano questa via. I

farmaci non coniugati non saranno soggetti a questo processo.

Eliminazione renale: filtrazione glomerulare

La differenza tra escrezione renale e biliare: mentre nell’escrezione biliare il farmaco viene

riversato così come tale nell’intestino, il farmaco che viene escreto con le urine è una quantità che

non deriva semplicemente dal suo passaggio nel nefrone, ma si tratta di una quantità finale che

51

deriva dalla sommatoria di tre eventi che possono avvenire nel nefrone. Il nefrone è l’unità

funzionale del rene, presenta 3 zone che differiscono per la funzione che viene svolta:

1. glomerulo renale dove avviene la filtrazione:

passaggio delle sostanze dal plasma al tubulo

e dotti collettori.

L’eliminazione dei farmaci avviene anche

mediante altri due processi a livello del

tubulo prossimale e distale.

2. Processo di secrezione attiva: arrivo al

tubulo prossimale dal torrente circolatorio

3. processo di riassorbimento passivo: ritorno

dal tubulo al torrente circolatorio per il

meccanismo di riassorbimento.

La sommatoria di questi processi a cui un composto farmacologico può essere sottoposto, indica la

quantità di farmaco che si presenterà nelle urine. Quindi mediante questa via è possibile modulare e

discriminare quali sostanze devono essere mantenute nell’organismo (glucosio) e quali molecole

devono invece essere detossificate, quindi subire un processo di secrezione tubulare attiva

(farmaci).

In linea generale per quanto riguarda la

filtrazione glomerulare questo è un processo

non influenzato da condizioni esterne come

potrebbero essere il pH del mezzo (che invece

regola i processi nei tubuli renali). L’unica

limitazione è che nella filtrazione glomerulare,

è il fatto che solo la frazione di farmaci in

forma libera possono essere filtrati, mentre la

frazione legata alle proteine plasmatiche

rimarrà nell’organismo. Però si sa che questo

si staccherà, verrà ripristinato l’equilibrio tra

la quota libera e legata, quella libera potrà

essere distribuita, filtrata ed escreta a livello renale (successivamente eliminata). Farmaci legati alle

proteine plasmatiche rimangono nell’organismo più a lungo perché oltre alla distribuzione più lenta,

anche il processo di eliminazione lo sarà altrettanto. Il farmaco libero passa dal torrente circolatorio

all’esterno, inversamente da ciò che avviene nell’assorbimento. Il legame alle proteine plasmatiche

determinerà quale sarà, in quantità di tempo, la quantità di farmaco che subirà la filtrazione

glomerulare. 52

Quello che si trova nel tubulo contorto

prossimale è la quantità di farmaco filtrata

a livello glomerulare. Questa quantità può

essere aumentata se il farmaco è soggetto al

processo di secrezione attiva. Il processo di

secrezione attiva è mediato da trasportatori,

che servono a eliminare le sostanze di

scarto del metabolismo endogeno; se il

farmaco è simile a questi, potrebbe essere

oggetto di meccanismi di secrezione attiva.

Queste condizioni, analogia strutturale con

le molecole endogene e esistenza di

trasportato efficienti, fa si che, solo pochi

farmaci sono sottoposti a un meccanismo di secrezione attiva. Sicuramente si tratta di molti farmaci

coniugati: quelli di fase I in quanto, la funzionalizzazione aumenta la polarità del composto; quelli

coniugati con il glutatione che possono essere substrato di trasportatori, la cui secrezione, ne

aumenta la concentrazione a livello del tubulo, oppure alcuni farmaci anionici che usano

trasportatori endogeni ad esempio le penicilline. Le penicilline sono antibiotici che subiscono

processi di secrezione attiva. Tale processo è saturabile perché dipende dal numero di trasportatori,

e in particolare nel tubulo contorto prossimale con farmaci di questo tipo,si avrà una concentrazione

di farmaco eliminato più alta rispetto a quella che ci si aspetta in seguito alla sola filtrazione

glomerulare. La secrezione attiva implementa la secrezione dei farmaci.

In seguito si arriva al tubulo distale, dove la compenetrazione di farmaco è più alta perché è

avvenuto il processo di secrezione attiva qui i farmaci possono subire un processo di

riassorbimento. Il passaggio è passivo: da tubulo al torrente circolatorio. Nel meccanismo di

riassorbimento passivo non vengono utilizzati carriers endogeni, ma il riassorbimento è dovuto

semplicemente al fatto che, in quelle condizioni fisiologiche (pH urinario) a livello del tubulo

distale possono avere ancora delle caratteristiche chimico-fisiche non polari, tali da permettere un

riassorbimento solo passivo. 53

Eliminazione per via renale:

Quello che è possibile ipotizzare in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche sono:

farmaci liposolubili tendono a essere escreti a concentrazioni simili a quelle presenti nel

• plasma. La loro concentrazione dipende soprattuto dal volume delle urine.

Farmaci polari tendono a essere escreti nelle urin a concentrazioni superiori rispetto a quelle

• presenti nel plasma.

Farmaci coniugati si comportano in maniera simile alle sostanze polari, ma possono essere

• escreti in misura maggiore perché soggetti a meccanismi di secrezione attiva.

I farmaci che si ionizzano facilmente, cioè acidi e basi, vengono escreti in maniera pH

• dipendente.

Un discorso particolare va fato per acidi e basi deboli, la quantità eliminata dipenderò dallo stato di

ionizzazione di acido e base debole, quale a sua volta dipenderà dal pH del mezzo. Il riassorbimento

passivo nell’ultima fase, è funzione diretta delle caratteristiche chimico-fisiche che vengono

presentate nell’urina dal farmaco. A livello del tubulo prendiamo in considerazione due cari: urina

acida e urina alcalina.

Un acido debole o un suo metabolita, nello specifico acido acetilsalicilico, in ambiente

• acido, si trova per lo più in forma indissociata e quindi può essere riassorbito

54

una base debole come l’anfetamina in un’urina acida sarà in forma dissociata, ionizzata e

• quindi non sarò in grado di essere riassorbita.

Se si vuole potenziare l’eliminazione di un acido debole come quello dell’aspirina in una

condizione acida, si alcalinizzerò le urine. Questo permette di aumentare la forma protonata del

salicilato e quindi favorire l’eliminazione. In caso di sovradosaggio farmacologico spesso si fa

questo, ovvero favorire l’eliminazione del farmaco (ionizzato) assunto in sovradosaggio

alcalinizzando o acidificando le urine.

Una base debole in urina alcalina verrà assorbita perché si trova in forma indissociata per

• aumentare l’eliminazione delle basi deboli si fa acidificare l’urina.

Clearance organo

anche per l’escrezione esiste un paramento che definisce la modalità di eliminazione del farmaco,

ovvero la clearance d’organo. In particolare per quanto riguarda la clearance renale, essa è

definita come volume di plasma che viene depurato dal farmaco nell’unità di tempo. È l’indice

numerico che rappresenta il processo di escrezione. La clearance in generale è dato dal rapporto tra

volume di urina prodotta nell’unità di tempo (min) per la concentrazione di farmaco che si trova

nelle urine, rispetto a quello che si trova nel plasma.

Le sostanze endogene, non si troverà nell’urina e quindi avrà una clearance uguale a zero. Per i

farmaci sono stati definiti dei range:

un farmaco durante il suo processo di eliminazione renale può essere solo filtrato, filtrato e

• secreto, oppure filtrato e anche riassorbito.

Un farmaco che ha una clerance uguale al volume di filtrazione glomerulare che è pari a 130

• ml/min, sarà un farmaco che subirà sola la filtrazione glomerulare.

Se invece il farmaco presenta una clearance <130ml/min, avrà subito un processo di

• riassorbimento passivo, perché rispetto alla quantità di volume di plasma depurato nell’unità

di tempo, troviamo la concentrazione delle urine più bassa rispetto a quella plasmatica.

Un valore di clearance >130ml/min indica la capacità del farmaco di essere stato oggetto a

• fenomeni di secrezione attiva. La concentrazione di farmaco è alta nelle urine. Per farmaci

con secrezione attiva importante, la clearance può arrivare fino a 650 ml/min.

55

Farmacodinamica

Farmacocinetica: colloquialmente rappresenta ciò che l'uomo fa al farmaco. La

• farmacocinetica deve dare origine a una curva di concentrazione plasmatica, in modo tale

che la concentrazione massima plasmatica necessaria per evocare al bersaglio un effetto

sufficiente di farmaco.

Farmacodinamica: rappresenta ciò che il farmaco fa all'uomo. Studia in maniera generale

• quale è la conseguenza dell'interazione del farmaco con il suo bersaglio.

Terminologia:

Farmacodinamica è definibile dal punto di vista disciplinare, come la branca della farmacologia che

studia gli effetti biochimici e terapeutici, farmacologici e il meccanismo d'azione dei farmaci. In

realtà studia la sequenza degli eventi farmaco-effetto, delinea le interazioni fisiche o chimiche tra

farmaco e recettore. Gli effetti terapeutici e tossici dei farmaci traggno origine dalle loro interazioni

con molecole (bersagli) presenti nell’organismo. Per lo più i farmaci agiscono combinandosi con

macromolecola specifiche in modo tale da alterarne le proprietà biochimiche e biofisiche. Bisogna

fare una distinzione:

Bersaglio di un farmaco: qualsiasi macromolecola presente nell'organismo la cui

• interazione con il farmaco da origine a un effetto terapeutico.

Il legame del farmaco con il suo bersaglio deve essere in grado di indurre una variazione

• dello stato fisiologico del nostro organismo. Un farmaco quindi per essere definito tale,

deve causare un alterazione e dare origine a un effetto. E' un modulatore di sistemi

endogeni, ovvero deve spostare una via verso un altra e non inibirla, altrimenti sarebbe un

distruttore (come il veleno)! Farmaco interagisce con un bersaglio molecolare causando

alterazioni biochimiche-fisiche.

Inibitore enzimatico reversibile è un classico esempio avente le caratteristiche sopra citate:

modulatore della attività enzimatica, dipendente dalla dose, non funziona più se termina.

La fisiologia è il normale rapporto tra diversi sistemi e vie biologiche

• La patologia è l'alterazione di questo equilibrio

Il farmaco, attraverso la sua capacità modulatoria, deve ristabilire l'equilibrio fisiologico.

Tra i bersagli farmacologici si hanno macromolecole come: proteine strutturali, enzimi,

trasportatori, acidi nucleici. Ma la maggior parte dei farmaci interagisce attraverso dei recettori

fisiologici. La farmacodinamica quindi può anche essere definita come la sequenza di eventi che

avvengono tra un ligando e il recettore fisiologico.

56

Concetti di farmacodinamica

Un recettore farmacologico per essere considerato bersaglio di un farmaco deve avere 4

caratteristiche (dogma delle 4 s):

sensibilità: dire che il recettore è sensibile presuppone la capacità di un farmaco di dare

• origine all'effetto a basse dosi ( ≤ nM). Il livello di sensibilità è dell'ordine di grandezza della

nanomolarità. Più si aumentano le concentrazioni, più probabilità di vedere l'effetto. Il

significato è non dare dosi da cavallo: in questo caso il farmaco risulta un perturbatore! Il

farmaco deve modulare non perturbare il sistema! Per avere un effetto, il segnale ligando-

recettore deve essere amplificato a livello cellulare: per questo motivo i recettori sono

bersaglio dei farmaci, perchè biologicamente in base alla cascata di pathway, i recettori

permettono l'amplificazione di segnale e comportano di conseguenza a una risposta

cellulare o sistemica.

selettività: un recettore è selettivo se è sensibile e risponde solo a sostanze accumunate

• dalle stesse caratteristiche strutturali (conformazione fisica). Per questo che si parla ad

esempio di famiglie di farmaci. Queste hanno un farmacoforo che garantisce la selettività,

ed è comune in tutte le molecole della famiglia Tutto il resto della molecola serve per

modificarne le proprietà e ottenere una buona farmacocinentica.

Isomeri ottici, oppure il varfarin sono attivi sono in una determinata conformazione.

specificità: qualsiasi ligando che lega il recettore, in funzione della sua sensibilità e

• selettività, è in grado di dare lo stesso tipo di risposta all'interno della stessa cellula. Se si

hanno 10 molecole e si conosce la struttura che permette la sensibilità, selettività per il

composto. Non si va a formare un altra molecola con queste caratteristiche (analoga) o di

ristudiarla completamente. La risposta sarà specifica.

L'effetto farmacologico è dato da tutte queste tre caratteristiche!!!

saturabilità: essendo i recettori saturabili, l'effetto del

• farmaco dipenderà dalla disponibilità dei siti recettoriali

a cui si lega. Esempio si potrebbe fare un farmaco

ottimo da tutti i punti di vista, ma la risposta dipende

dai siti messi a disposizione. Se si riesce ad ottenere un

effetto farmacologico occupando un certo numero di

siti, e se questi non è completamente saturabile

nell'immediato dal farmaco, allora si può ottenere un

effetto farmacologico. 57

Curva dose-effetto

Il secondo tipo di curva, oltre quella

plasmatica, è la curva dose-effetto o dose-

risposta: è una curva che mette in relazione la

concentrazione o la dose di farmaco con

l'effetto farmacologico.

Esprimendo sull'asse delle x la

concentrazione di farmaco in base

logaritmica, la curva dose-effetto verrà

rappresentato con una sigmoide (log

concentrazione-effetto). Ogni farmaco può

dare un effetto massimo, in funzione del

numero di siti recettoriali disponibili, ovvero saturabili. Si può aumentare la dose, ma non avrà

l'effetto, perchè il plateu è imputabile alla saturabilità dei recettori bersaglio.

l’effetto di un farmaco è proporzionale al numero di recettori occupati, quindi aumenta

• all’aumentare della dose.

l’effetto massimo si verifica quando tutti i recettori sono occupati.

Prima teoria della farmacodinamica

Alla luce di queste caratteristiche, la prima teoria farmacologica che è stata proposta, è una teoria

che spiegherebbe l'azione di farmaci a livello dinamico dell'interazione farmaco-recettore che dice:

"l'effetto di un farmaco sarà più intenso, quanto sarà il numero di recettori attivati dal farmaco".

Questa teoria viene detta teoria occupazionale di Clark: gli effetti farmacologici sono

direttamente proporzionali al numero di recettori attivati. Arriverà ad un effetto massimo

quando tutti i recettori saranno occupati. Questa teoria si basa però su presupposti che ne corso del

tempo si sono rivelati non sempre veri: è vero che l'effetto farmacologico dipende dal numero di

recettori attivati, ma che questo effetto sia solamente dipendente dal numero di recettori occupati

no!

Anche se la teoria di Clark è ancora un pietra miliare nella farmacodinamica, alcune delle sue

assunzioni si sono dimostrate non corrette:

1. la formazione di alcuni complessi farmaco-recettore non è reversibile

2. i siti recettoriali non sono sempre indipendenti

3. la formazione di un complesso può non essere bimolecolare

4. la risposta massimale può avvenire prima che tutti i siti vengano occupati

5. la risposta non è correlata in maniera lineare alla porzione di recettori occupati

I presupposti errati da considerare sono: 58

Ognivolta che un ligando si lega a un recettore, si ha l'attivazione del recettore. Clarck

• diceva: "Qualsiasi molecola si leghi al suo recettore (solo perchè lo ha legato e occupato),

ha un effetto e può dare origine a una risposta". In realtà non tutti gli eventi del recettore

partecipano all'effetto finale, ovvero alla risposta terapeutca viene meno la teoria

occupazionale

a risposta di un farmaco è dose dipendente: questo è vero, ma ci sono farmaci che anche

• aumentando la dose, si potranno non avere effetti.

L'interazione farmaco recettore segue l'azione di massa molecolare: costante di associazione e

dissociazione. Ma in realtà la teoria di Clark spiega ancora oggi, solo gli agonisti puri.

Si definisce agonista un famraco che si lega ad un recettore e genera una risposta biologica.

Generalmente un agonista riproduce gli effetti dei composti endogeni.

Un agonista puro è tale, se legandosi al recettore, evoca una risposta analoga a quella evocata

dall'agonista endogeno per quel recettore, generando un effetto che è massimo, una volta saturato

tutti i recettori. Questo è il vero tipo di ligando recettoriale descritto dalla teoria occupazionale.

Si ottiene nel caso di un full agonist una sigmoide: se si

mette in relazione la dose e l'effetto espresso in

percentuale; se l'effetto è massimo ,si ottiene un valore

del 100%, che corrisponde nella maggior parte dei casi,

a una situazione cui tutti i siti sono stati saturati. Quale

sarà l'utilità di un agonista di un farmaco? Il recettore

possiede già un agonista è quello endogeno. Nella cura

di una patologia l'intervento farmacologico modula,

spostando e potenziando un sistema rispetto agli altri.

Normalmente si cerca di sviluppare agonisti pieni

recettoriali farmacologici, che siano più potenti del

ligando endogeno per quel recettore, il quale comporta

la patologia.

Si vedono nella slide due curve dose-effetto. Una rappresentata da un agonista del recettore e l'altro

è l'agonista pieno.

Potenza di un farmaco

Si introduce il primo concetto di farmacodinamica, ovvero la potenza di un farmaco, che è indice

della dipendenza dell’effetto dalla dose del farmaco: attraverso un confronto delle curve dose-

effetto (dati da due farmaci con la stessa struttura e sullo stesso recettore). La potenza relativa di

questi due farmaci si valuta considerando la concentrazione di farmaco in grado di evocare il 50%

dell'effetto massimo possibile. EC50=concentrazione efficac → dose in grado di evocare il 50%

dell'effetto massimo possibile. 59

Efficacia è il punto massimo della sigmoide. Per gli agonisti

riflette l’affinità del farmaco per il recettore.

Il farmaco più potente è quello a sx perchè ha EC50 è più

piccola, quindi è necessaria una concentrazione più bassa per

dare lo stesso effetto. Più la curva è a sx, più il farmaco è

efficiente.

Nel caso in cui:

molecole leganti lo stesso recettore → stesso sistema → curva

C

Sono ligandi che pur essendo tutti occupando tutti i recettori disponibili, non danno l'effetto

massimo. Si chiamano agonisti parziali. Magari sono più potenti di un agonista pieno.

Come le interazioni molecolari rendono conto di questo?

Farmaco C (agonista parziale )

• Farmaco B (agonista pieno)

• Farmaco A

Farmaco C ha un efficacia più bassa del farmaco B, ma

però C è più potente del farmaco B, e meno potente del

farmaco A.

Si da più peso all'efficacia o alla potenza di un farmaco nello

sviluppo? L'effetto massimo a cui arriva l'agonista parziale non

dipende dal numero di recettori. Un farmaco più potente, vuol dire,

utilizzare dosi più basse di farmaco.

Ci sono agonisti parziali che stanno nel range: tra 100% dell'effetto

evocato dell'agonista pieno e 0% dato da un antagonista. Esiste

una regola generale privilengianto la potenza o l'effetto? Il

farmaco deve essere un modulatore di un sistema endogeno e deve

possedere due caratteristiche:

1. deve essere abbastanza potente per utilizzare dosaggi bassi e non perturbare il sistema,

2. non è necessario ottenere un effetto terapeutico, tramite un efficacia massima. Quasi mai le

posologie somministrate corrispondono alla curva dose-effetto con dose massima. Infatti

anche in agonisti pieni, le posologie non corrispondono alle dosi saturanti! Corrispondono

quasi sempre a 60% dell'effetto ricavabile dalla curva dose/risposta. Molti agonisti parziali

nonostante l'efficacia è ridotta, arrivano a una efficacia che anche se non giunge a 100%, ma

supera il 50%, è ideale per l'uso terapeutico. Questa è la dose a cui si giunge anche per un

agonista pieno. Si prediligerà la potenza: verranno usati dosi minori, che vuol dire incapacità

di legare molecole off targets e quindi effetti tossici.

60

Si ottengono anche curve come la C: non esistono effetti → si parla di antagonisti farmacologici

ovvero molecole in grado di legare con le stesse caratteristiche di sensibilità, selettività, specificità,

saturabilità il bersaglio, ma da questo legame non scaturisce l'effetto biologico. Recettori sono stati

occupati, ma non vi è effetto.

Perchè usati? La loro interazione modula l'incontro dell'agonista endogeno con il recettore. Sono

modulatori di un sistema, e ne diminuiscono la potenza.

Riassumendo:

l'agonista → potenzia il sistema, l'azione

• dell'agonista endogeno

l'antagonista → depotenzia l'attività del

• sistema, e riducendo l'incontro con l'agonista

endogeno ma non ha effetti sul sistema.

Dal punto di vista farmacodinamico, l'antagonista da

soltanto una curva piatta, perchè l'interazione non da

effetto.

I ligandi farmacologici recettoriali in termini di curve

dose-effetto possono essere definiti come:

agonisti farmacologici pieni (plateu 100% ,

• effetto 100%)

agonista parziale (la potenzia può essere variabile)

• antagonista (non genera curva dose-effetto, piatta)

Queste tre tipologie di ligandi modulano positivamente o negativamente il sistema endogeno,

andando a ridurre o aumentare l'attività che l'agonista endogeno ha sul sistema.

Ultima categoria di ligandi sono gli agonisti inversi, che si suddividono in agonisti essere pieni o

parziali. In base al fatto che possano arrivare alla massima occupazione del recettore oppure no.

Un agonista inverso è un agonista recettoriale dalla cui interazione si scaturisce un effetto

biologico opposto a quello evocato dall'agonista endogeno. 05/04/17

Riassunto delle definizioni:

-Un agonista puro è tale, se legandosi al recettore, evoca una risposta analoga a quella evocata

dall'agonista endogeno per quel recettore, generando un effetto che è massimo, una volta saturato

tutti i recettori.

-Agonisti parziali: allo stesso recettore possono legare farmaci che aumentano all'aumentare della

dose, ma raggiungono un valore massimo che risulta inferiore rispetto all'effetto massimo pur

avendo occupato tutti i siti disponibili. 61

-La curva dose effetto può dare origine a effetti inesistenti e si parla quindi di antagonisti

recettoriali: ligando al recettore che non è in grado, pur arrivando a saturazione a dare un effetto

biologico. Dal punto di vista terapeutico, gli antagonisti vengono usati perchè modulano

negativamente la risposta fisiologica del ligando endogeno al recettore, ma di per sè non sono in

grado di evocare una risposta.

-Agonisti inversi sono pieni o parziali: è un farmaco che da origine qualitativamente a una

risposta opposta a quella data dal ligando fisiologico del recettore. Si definiscono pieni se sono in

grado di dare un effetto che è direttamente proporzionale al numero di recettori occupati (diventa

massimale quando arriva a saturazione); oppure agonisti inversi parziali se pur occupando tutti i

recettori disponibili, non sono in grado di evocare un effetto massimo possibile.

Questo oltre a determinare la diversa tipologia di farmaci che possono legare lo stesso bersaglio

farmacologico, presuppone il fatto che la teoria occupazionale non valga, ovvero non basta che il

ligando leghi il recettore a dosi basse, con una buona capacità di legame (effetto temporale

importante), ma ci deve essere qualcosa d'altro che media quello che dal legame porta alla risposta.

Per lo stesso recettore questo può essere diverso in funzione di altri ligandi. Tra l'evento

farmacocinetico (che porta il farmaco ad essere messo a disposizione del recettore) e la risposta

terapeutica (che si vede nel paziente), ci sono due eventi fondamentali in funzione dei quali l'arrivo

del farmaco correla con la sua efficacia:

-Primo step è l'occupazione: il farmaco

deve legare in modo significativo il suo

recettore. La teoria precedentemente

esposta faceva riferimento solo a questo

step. Perchè un farmaco dia origine a una

risposta biologica verso il suo legame con

il recettore bersaglio, deve occuparlo. Il

grado di occupazione del recettore

necessario perchè poi avvenga lo step

successivo, è regolato da una proprietà della molecola farmacologica ovvero, dall'affinità per il suo

recettore. L'affinità per gli agonisti puri rappresenta un indice diretto della loro potenza. Più è

affine, minore sarà la dose necessaria per attivare il recettore.

-Secondo step è l'attivazione del recettore che consegue all'occupazione del farmaco, è invece

regolata da un' altra proprietà del complesso farmaco-recettore che prende il nome di efficacia.

L'effetto finale della risposta terapeutica è regolata sia qualitativamente che quantitativamente dalla

sua affinità verso il recettore e dalla efficacia dovuta all'attivazione che consegue a questo legame.

In questo caso l'affinità è un indice diretto dell'efficacia del farmaco. L'efficacia è indice dell'effetto

massimo che si raggiungerà.

Un agonista puro e un agonista parziale differiscono per l'occupazione o attivazione?

Ricorda che anche un antagonista può occupare un sito, ma per quanto riguarda la curva dose-

effetto risulterà piatta perchè manca l'attivazione che consegue all'occupazione. Da ciò risulta che

62

l'attivazione è l'indice diretto dell'effetto massimo che il farmaco può dare. Un agonista parziale, un

agonista puro, antagonista avranno la stessa affinità per il recettore e quindi il primo step è uguale

per tutti e tre, ma ciò che fa si che queste curve siano diverse è l'attivazione.

Si possono avere stati di occupazione di uno stesso recettore analoghi da parte di farmaci diversi,

regolato dalla affinità: la quale indica come, se e in che modo il farmaco occuperà in recettore. Ciò

che scaturisce dal legame ossia l'attivazione, viene indicato da un altro parametro: l'attività

intrinseca del farmaco (α) che definisce il tipo di ligando (agonista inverso, antagonista ecc). Si

definisce attività entrinseca il parametro che indica la capacità del farmaco di dare inizio alla

risposta biologica una volta che sia legato al recettore. Non tutte le caratteristiche farmaco-recettore

garantiscono una risposta farmacologica. In particolare negli antagonisti non contribuisce nessuno,

negli agonisti puri tutti, negli agonisti parziali la metà.

E=α[ AR ]

Da ciò si deduce che un farmaco deve possedere entrambi aspetti per avere un effetto biologico,

terapeutico e biologico: bisogna garantire lo sviluppo di farmaci che hanno una buona affinità per il

recettore a bassi dosaggi e garantire una attività intrinseca.

L'attività intrinseca può assumere valori differenti:

Si calcola facendo un rapporto tra l'effetto massimo del farmaco di cui si sta studiando l'attività

intrinseca (che tipo di ligando sarà), ne studio la curva dose effetto e trovo l'effetto massimo.

Quest’ultimo lo rapporto all'effetto massimo derivato dalla costruzione della curva dose-effetto fatta

sullo stesso recettore usando il farmaco più efficace sul quel recettore (idealmente agonista puro).

Da ciò scaturisce che:

se attività intrinseca è 1 identifica un agonista puro (effetto massimo calcolato con l'attività

• intrinseca è uguale all'effetto calcolato con un il farmaco più efficace).

se il valore è compreso tra 0 e 1 si avrà a che fare con un agonista parziale

• se il valore è zero si avrà a che fare con un antagonista.

Quindi si calcola il primo step ovvero l'affinità poi si procede con l'allestimento delle curve dosi-

effetto. Dal rapporto e dalla determinazione dell'attività intrinseca, permette di capire la tipologia di

ligando. Ad esempio gli agonisti inversi avranno valori negativi.

Si potrà avere in funzione della affinità, in funzione della attività intrinseca: molecole che

differiscono però in termini di efficacia e di potenza. Esempio

A=agonista pieno raggiunge il 100% dell'effetto

B=agonista pieno

C= agonista parziale 63

Chi è più potente dei tre? A Chi tra B e C è più potente? l'attività intrinseca è in funzione solo

dell'efficacia massima raggiungibile. Ma non è indice della potenza. Infatti il C è più potente di B!

Ci sono antagonisti con affinità maggiore per un recettore rispetto a un agonista, ma in termini di

efficacia sono inattivi.

MEMO: Affinità indice di potenza

attività intrinseca è indice dell'efficacia Sono indipendenti, ma la loro sommatoria da l'effetto

farmacologico. Gli altri due aspetto di cui bisogna parlare sono quindi:

Efficacia

Efficacia: dipende direttamente dalla attività intrinseca

del farmaco. Si definisce l'entità massima dell'effetto

che il farmaco può indurre.

Per ogni farmaco si può determinare un efficacia

massima, che risulta differente in base all'effetto

massimo raggiugibile attraverso l'interazione con quel

recettore. L'efficacia non dipende dalla dose che si

somministra. Se attività intrinseca è bassa, non avrò un

maggior effetto, anche se aumento la dose. C'è

sicuramente una diretta proporzionalità tra dose e

effetto, ma solo durante l'occupazione. L'effetto finale raggiungibile non dipende dal dosaggio, ma

solo dall'attività intrinseca del farmaco.

L’altezza della curva dose-risposta rispecchia l’efficacia.

Potenza

La potenza è definita come la capacità di farmaco di

indurre l'effetto a dosi basse, ovvero di instaurare un

legame con il recettore anche dosaggi bassi. E' il parametro

maggiormente legato alla dose, se si confrontano dei

farmaci agonisti pieni (100%), hanno tutti attività intrinseca

è 1, in cosa differiscono le curve? Dipendono dalla affinità

per il recettore (primo step). Più farmaco è potente, minore

sarà la dose necessaria per raggiungere il 50% del effetto

massimo possibile.

Un ottimo farmaco è un farmaco in cui affinità è ottima, ma

lo è anche l'efficacia. Se l'affinità è bassa non avrò l'effetto farmacologico, lo stesso se l'efficacia è

bassa. 64

Antagonisti

Se per gli agonisti puri, parziali, inversi parziali e pieni tutto dipende dall'attività intrinseca per

avere una risposta, gli antagonisti hanno solo l'attività occupazionale per il recettore, se hanno una

buona attività,ma non sono in grado di indurre una risposta biologica. L’effetto farmacologico di un

antagonista è dovuto alla sua proprietà di inibire l’effetto dell’agonista che agisce attraverso lo

stesso recettore. L'uso degli antagonisti in farmacologia è complesso rispetto agli agonisti, perchè

non implicano un segnale di interazione con il recettore in funzione dei ligandi endogeni. Quelli

messi in commercio devono avere un'ottima affinità per il recettore, ma anche l'effetto che gli

antagonisti avranno sui diversi agonisti endogeni, potrà sarà diverso in funzione del tipo di legame

che il farmaco antagonista andrà a fare con il recettore. Suddividiamo gli antagonisti farmacologici

in antagonisti farmacologici competitivi e non competitivi. Ci si riferisce agli antagonisti

competitivi come a quei ligandi recettoriali che competono con l'agonista endogeno per lo stesso

sito di legame recettoriale.

In funzione di che cosa cambierà nella risposta dell'agonista in funzione dell'antagonista

competitivo? Il processo di occupazione? L'antagonista sottrae i siti di occupazione all'agonista

endogeno in funzione della affinità. Negli antagonisti farmacologici da cui si ricava l'effetto

terapeutico avranno un'affinità elevata per il recettore (anche perchè gli agonisti hanno un elevata

affinità!!).

-Antagonisti competitivi: si immagina una curva dose-

effetto dell'agonista pieno che quindi raggiunge un plateu

e quindi avrà un affinità del 100%. Come cambierà la

curva dell'agonista endogeno in presenza di diverse

concentrazioni di antagonisti competitivi? Si sposterà

verso destra: l'agonista endogeno raggiungerà sempre

l'effetto massimo, e quindi l'antagonista competitivo ne

altera l'affinità, ovvero lo stato occupazionale del

recettore. Questo step è legato alla sua potenza:

l'antagonista farmacologico varierà la potenza

dell'agonista endogeno, ma non la sua efficacia! Di fatti in presenta di un antagonista competitivo,

la curva del'agonista endogeno si sposta verso destra. Diminuisce la potenza dell'agonista puro, ma

si raggiungerà sempre l'effetto massimo, perchè se aumento la dose dell'agonista, questo spiazzerà

l'antagonista! L'effetto farmacologico indotto da un antagonista competitivo, è sormontabile. In

presenza di antagonista la curva si sposta, se l'effetto evocato da agonista legato al recettore è del

60%, ma in presenza dell'antagonista nella nuova curva sarà meno del 20%. Da qui scaturisce

l'utilità in campo farmacologico degli antagonisti.

l’antagonista compete in modo reversibile o spiazza l’agonista dal recettore

• poiché l’occupazione da parte di un antagonista non produce alcuna rispsota, l’azione

• dell’agonista è bloccata 65

tuttavia alte concentrazioni di agonista possono ripristinare la situazione precedetne e dare

• luogo alla rispoata recettoriale.

-Antagonisti farmacologici non competitivi: sono ligandi che legano il recettore bersaglio su siti

diversi, rispetto al sito di legame per l'agonosta. Tali siti diversi sono detti allosterici. Si possono

avere farmaci non competitivi che legano il recettore su un sito allosterico: dal legame con

l'agonista recettoriale derivante dall'interazione dell'antagonista non competitivo, modula solo

quello che sarà la capacità di essere attivato. Esempio un recettore legato a G proteine. L'agonista lo

lega, da questo legame lo attiva e quindi ciò determina l'attivazione di G protein, l'intervento

dell'antagonista non modifica il sito di legame all'agonista, ma solo la capacità del recettore a

seguito del legame con l'agonista di cambiare conformazione per indurre un pathway di traduzione

intracellulare. Oppure il legame con un antagonista su un sito non allosterico può portare alla

modifica del recettore sul sito di legame all'agonista oppure entrambe le cose. Se si ha un

antagonista non competitivo che lega il sito recettoriale e cambia il sito di legame all'agonista,

questi tipi di ligandi sono in grado di modificare l'affinità del ligando endogeno per il recettore,

perchè il legame nel sito allosterico ha portato a una modificazione del byding. Se invece il sito

riguarda il sito che comporta la formazione di messaggeri a valle, l'affinità dell'agonista per il

recettore non cambia.

Si può avere un effetto dovuto alla riduzione

dell'affinità, per la potenza dell'agonista endogeno o

perchè si usa un antagonista competitivo che compete

per lo stesso sito e cambia la potenza ma non l'affinità, o

perchè l'antagonista noncompetitivo in cui il legame con

il sito allosterico modifica il byding con l'agonista

endogeno variando attività ( ma non è sormontabile

l'effetto aumentando la dose perchè il sito è diverso e

questo comporta una diminuzione dell'affinità).

Gli antagonisti non competitivi modulano l'efficacia

dell'agonista endogeno, ma non la potenza. Questo legame non è variato, EC50 è sempre uguale

cambia l'efficacia ovvero affinità per il recettore, la curva si abbassa per l'agonista.

l’antagonista può legarsi al recettore in n sito diverso vicino a quello dell’agonista

• il sito di legame può essere abbastanza vicino da sovrapporsi al sito di legame agonista-

• recettore in modo da nasconderlo all’agonista

oppure il sito di binding dell'antagonista può essere vicino al sito attivo e può causare un

• cambiamento conformazionale che impedisce il legame dell’agonista.

Oppure il sito di binding dell’antagonista può causare un cambiamento conformazionale che

• impedisce l’attivazione del pathway a valle.

66

Antagonismo farmacologico non-recettoriale

Si può andare a modulare negativamente un pathway farmacologico. SI parla si antagonista

funzionale, recettori simili che sono attivati da agonisti endogeni diversi. E' il modo che ha

l'organismo per mantenere un tono: sulle fibre muscolari del bronco che in equilibrio, si avrà il

mantenimento di un tono. L'antagonista sarà in grado di formare un disequilibrio sullo stesso

organo/tessuto.

L'ultima classe di ligando recettoriali sono gli agonisti inversi: sono farmaci che sono in grado di

dare una risposta qualitativamente opposta a quella evocata dall'agonista endogeno. Per spigare il

loro comportamento riprendiamo l'occupazione e attività entrinseca. Bisogna aggiugere a questi due

un terzo concetto, il cui significato è stato rilevato nelle curve: i recettori fino ad ora sono state

considerate entità statiche, in realtà sono strutture dinamiche, in cui il farmaco arriva ad esso e lo

trova in uno stato inattivo (capacità di occuparlo). Lo stato attivo e inattivo è determinato

dall'interazione con il ligando. In situazione di assenza di ligandi, l'equilibrio è sempre spostato

verso lo stato inattivo del recettore; gli agonisti pieni legano il recettore e poi spostano l'equilibrio

verso lo stato attivato del recettore: l'occupazione del farmaco con il recettore determina lo

spostamento dello stato attivo del recettore, come se l'affinità dell'agonista pieno fosse maggiore per

lo stato attivato. Comporta a un massimo d'effetto quando l'occupazione è totale. L'agonista

stabilizza il recettore nella forma attiva, e poi l'equilibrio viene spostato verso la forma attiva del

recettore.

In presenza di un antagonista, avviene l'opposto perchè ha affinità per la forma inattiva, viene

stabilizzato lo stato inattivo del recettore.

Sugli agonisti parziali ci sono due ipotesi. Sono in grado di stabilizzare sia la conformazione attiva

e inattiva: ovvero legano il recettore e manifestano medesima affinità per le due conformazioni. Si

67

comportano in alcune circostanze come agonisti pieni oppure come antagonisti in altre circostanze.

Il risultato sarà un effetto che dipenderà solo dalla quantità di popolazione recettoriale che è stata

stabilizzata nella conformazione attiva, che non sarà mai massima. Ma dirà quando un agonista

parziale darà l'effetto massimo raggiungibile.

L'agonista inverso è un ligando che ha una certa affinità per la forma dei recettori cosidetta

costitutivamente attiva. Esistono recettori costitutivamente attivati che generano una risposta in

assenza di ligando. Gli agonisti inversi hanno come bersaglio questo tipo di recettori. Ligandi

farmacologici che manifestano l'affinità per essi, li legano e stabilizzano la conformazione inattiva.

Perchè? Viene meno l'attività costitutiva del recettore. Danno un effetto opposto in mancanza della

risposta biologica costitutiva nel recettore.

Nello schema: la risposta evocata da un farmaco è la risultanza di uno spostamento di equilibrio

verso la conformazione del recettore che può essere non modificato nel caso di un antagonista

(forma inattiva equilibrio non spostato), oppure l'equilibrio viene spostato dall'agonista pieno verso

la forma attiva, e in mezzo agonisti parziali che in funzione dell'attività intrinseca inducono

risposte positive, ma mai massimali. Dalla parte opposta troviamo un agonista pieno e in mezzo

tutti gli agonisti parziali che dipendono dall'attività intrinseca.

Agonista parziale

Due possibili spiegazioni:

la molecola si lega in due modi diversi al recettore. In un’orientazione agisce da agonista,

• nell’altra da antagonista. Il risultato è che l’attività del recettore dipende dalla frazione di siti

occupati dalla molecola nelle due diverse orientazioni.

l’agonista parziale interagisce con il recettore in modo non ottimale, per cui il binding non

• causa un cambiamento conformazionale tale da permettere una trasmissione completa del

segnale. Il cambiamento conformazionale è sufficiente per una risposta parziale.

Come si studia l'affinità di un farmaco per il suo recettore

L'affinità si studia ancor prima delle curve dose effetto. Si fa attraverso studi di bynding

fondamentali per determinare in qualsiasi molecola. Si definisce un numero che sia precisa

indicazione dell'affinità per il recettore. Gli studi di bynding non identificano il tipo di ligando, ma

solo l'affinità. 10/04/2017

Lo studio dell’affinità viene caratterizzato dallo studio di binding. L’efficacia viene studiata

mediante l’allestimento in vitro delle curve dose-effetto.

Per studiare l’affinità di un ligando recettoriale al suo recettore si effettuano i saggi di binding

farmaco-recettore. Questi tipi di saggi rimangono ad oggi i punti di partenza fondamentali per

caratterizzare il primo evento farmaco-dimanico che una nuova molecola in sviluppo manifesta.

68

I saggi di binding

possono essere realizzati in due modi

saggi di binding per saturazione: possono essere fatti solo quando la molecola in studio

• può essere radiomarcata con un radioisotopo e si potrà seguire in maniera diretta il legame

della molecola con il recettore prescelto.

saggi di binding per competizione: si attuano quando non è possibile radiomarcare la

• molecola in studio. Si procede con uno studio di binding indiretto, per competizione, dove si

usa un altra molecola radiomarcata che compete con quel recettore. L'affinità verrà

determinata studiando la capacità della mia molecola in studio di andare a competere con il

radioligando.

La modalità diretta è quella da privilegiare.

Vengono fatti per poter marcare la molecola con un isotopo, radionuclide, che ci permetterà di

visualizzare il legame della molecola con il recettore.

Saggi di binding per saturazione:

Si effettua utilizzando e incubando, in una serie di

provette, la molecola radiomarcata a diverse

concentrazioni crescenti (unica variabile presente

nell’esperimento). Il ligando viene incubato con un

preparato biologico che contiene il recettore verso il

cui si sta studiando l’affinità della molecola. Si dovrà

usare anche un tampone a pH desiderato e un tempo

di incubazione sufficiente per raggiungere l'equilibrio.

All’equilibrio vi sarà una certa quantità di farmaco

legata al recettore e una certa quantità libera.

Le prime variabili che si possono avere sono quelle che riguardano la scelta per il preparato

biologico, che deve contenere il recettore bersaglio. In funzione del tipo del preparato biologico che

sceglieremo la traslabilità della determinazione dell’affinità del farmaco, per il mio recettore, e

quello che potrà succedere nel nostro organismo potrà sarà differente.

I preparati biologici possono essere:

preparati tissutali (umani/murini): si intende un omogenato di un tessuto in cui si ha la

• presenza del recettore.

Vantaggi: rispetta al meglio la situazione fisiologica del recettore, non vi sono artefatti

◦ dovuti ad una preparazione differente. È da considerarsi come la condizione ottimale

Svantaggi: ci sono dei tessuti che sono difficili da ottenere come preparato da usare per

◦ sperimentazione dall’uomo. Nel momento in cui prediligo la scelta dell’omogenato

tissutale, ma il tessuto in cui esso è presente è difficile da utilizzare dall’uomo, si

69

procede con il preparato murino. Se i livelli di espressione del recettore, in questi tessuti,

sono molto bassi non si procede più all’utilizzo di preparati tissutali, in quanto

potrebbero alterare notevolmente l’esperimento e quindi si preferiscono le cellule in

cultura.

Cellule in cultura: sono cellule in cui si può ampliare la densità del recettore. Se sono

• ancora umane si presenta il recettore nella sua condizione fisiologica. Quando anche

l’utilizzo di cellule in coltura può non essere fattibile, non si ha la corretta espressione del

recettore o perché la linea cellulare non è ottenibile per esperimenti in vitro, allora si

procede con linee cellulari umani in cui si fanno esprimere il recettore umano di interesse.

Cellule trasfettate: cellule umane che normalmente non esprimono il recettore. Il recettore

• viene presentato al ligando in un contesto non più fisiologico.

Radioisotopo 3 125

radionuclide da utilizzare per marcare la molecola in studio: [ H] e [ I]. Si preferiscono, per gli

studi di affinità i legami con radioisotopo in quanto non modifica la struttura chimica della

molecola.

la sostituzione di un atomo con il corrispondente radioisotopo, all’interno del farmaco, non

• induce un cambiamento nella sua struttura chimica. La modificazione che introduco non

deve cambiare la modalità con cui la molecola andrà a legare il recettore. Trizio e iodio 125

non inducono quasi mai dei cambiamenti di questo tipo. Per questo ancora oggi si

prediligono, per studiare l’affinità, dei saggi che dal punto di vista della sicurezza sono

pericolosi, rispetto all’uso dei fluorocromi. Un fluoroforo modifica in maniera significativa

la molecola rispetto al radioisotopo. Per questo che per gli

studi di affinità si attuano con isotopi radioattivi.

Tempo di decadimento

• attività specifica (la quantità di radioattività presente in una

• data unità molare del composto)

In ogni provetta, caratterizzata solo da una concentrazione diversa

del radioligando, si avrà il tampone, il preparato biologico e il

radioligando. All’equilibrio si avrà, all’interno della provetta, in

funzione della relazione di recettore inserito, una certa quantità di

ligando legato al recettore e una quantità di radioligando libero. Si

andrà a misurare la radioattività del ligando legato al

radiorecettore. Il recettore libero R non potrà essere misurato ma

possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.

Per poter calcola la quantità del complesso RD è necessaria

un’operazione di separazione (bound) della quantità di ligando radiomarcato D libero in soluzione

non legato al tessuto (free). 70

Metodi di seprazione del RD dal mezzo di reazione

Separazione per filtrazione: il metodo più semplice e classico è quello della filtrazione su

• membrane in fibra di vetro. Un tessuto contente il recettore legato

al radiolidango aderisce a filtro, il radioligando attraversa la

memebrana.

Limiti e precauzioni della filtrazione

Le proteine ostruiscono il filtro

◦ il ligando tende a legarsi alle fibre del filtro

◦ elevata velocità di filtrazione (deve essere in 4-5 secondi per evitare ce il ligando

◦ radiomarcato si stacchi dal recettore. In genere il 5% di RD)

In funzione del preparato biologico più complesso, omogenato tissutale, a livello del filtro

possono rimanere intrappolate altre macromolecole e ciò può limitare il processo di

filtrazione. Si può perdere una certa quantità di farmaco-recettore e si ottiene un dato di

sottostima. Oppure può accadere il contrario, il preparato biologico è ottimale, ma il tipo di

molecola radiomarcata può avere una certa quantità di radioligando libero e quindi si ha una

sovrastima. Se la filtrazione avviene ad elevata velocità questi limiti vengono superati.

Centrifugazione: a velocità ottimale permette di separare la frazione free da

• quella coniugata per differenza di peso. Nel surnatante rimarrà il

radioligando libero e il pellet sarà la frazione arricchita di radioligando-

recettore. Ha una variabilità maggiore rispetto a quello di filtazione,

soprattuto perché è più facile che nel pellet rimanga intrappolata anche una

quantità di radioligando libero.

Dialisi: è un metodo che si sceglie quando si hanno dei dati poco significativi, in cui

• l’affinità è parecchio bassa per il ligando. Si usano due camere separate da una memebrana

di dialisi che sarà permeabile al farmaco libero e non permetterà il passaggio al complesso

farmaco recettore. All’equilibrio si posizionerà il farmaco libero da entrambi i lati della

memebrana. Al termine del tempo di incubazione del saggio si avrà la stessa concentrazione

di farmaco libero nelle due camere. Per determinare la radioattività del complesso farmaco-

71

recettore, si procede con la conta della radioattività in entrambe le camere, si fa la differenza

e questa sarà esclusivamente la radioattività che deriva dai complessi farmaco recettore.

La misura sperimentale è la misura di radioattività per ognuna delle concentrazioni crescenti che ho

usato di radioligando.

Si ottengono curve che crescono di continuo e

non arrivano mai alla saturazione. Vengono

chiamate curve di bindg totale. Quando

aumento le concentrazione di radiolingando esso

potrebbe legarsi, in maniera aspecifica, ad altre

macromolecole del preparato biologico, ecco

perché la curva di binding non va mai a

saturazione. É stato osservato che questa

quantità di binding aspecifico aumenta nei

preparati biologici più complessi, come negli

omogenati tissutali. Ciò non permette di

determinare correttamente l’affinità del ligando al recettore. Si deve eliminare questa quantità di

binding aspecifico. La curva di binding totale è quindi data dalla somma tra legame specifico e

aspecifico.

Determinazione legame aspecifico.

In una serie di provette si aggiunge ligando marcato a concentrazione crescenti in presenza di una

concentrazione elevata (almeno 1000 volte rispetto al ligando marcato) di ligando non marcato.

Stesso tempo di incubazione e si misura la radioattività. Il preparato biologico contine i recettori, il

tampone desiderato. Si incubano le provette alla temperatura desiderata per il tempo necessario per

raggiungere l’equilibrio e quindi si filtrano campioni per separare il complesso ligando.-recettore.

La curva cresce al crescere della concentrazione del ligando, è una retta. Pero ogni punto

sperimentale si fa la differenza:

binding totale- binding a specifico

e si ottiene la curva di binding

specifico, che arriva a saturazione.

In tutte le provette, l’eccesso di

ligando non marcato spiazzerà il

radioligando da tutti i siti

recettoriale, mentre non lo farà nel

caso del radioligando nei siti

aspecifici. La radioattività che si

misurerà sarà solo quella residua e

quindi sarà quella dovuta

esclusivamente a legami aspecifici. Sull’asse delle y si ha la misura del legame aspecifico mentre

sulle x si avrà la concentrazione del radioligando. Si ottiene una retta che viene denominata come

curva di binding aspecifico. Dalla sottrazione punto per punto delle due curve, si ottiene la curva di

72

binding specifico, che è la vera curva che riflette il legame della molecola in studio con il recettore.

Tale curva arriva a saturazione.

Dalla curva di Binding specifico si possono ricavare:

K : concentrazione di radioligando in grado di

• D

determinare l’occupazione del 50% dei

recettori presenti nel preparato biologico. Più

piccola sarà K più alta sarà l’affinità del

d

recettore, perché è necessaria una

concentrazione bassa di ligando per andar a

determinare l’occupazione e il legame

significativo del recettore. Gli studi di binding

recettoriali possono venir allestiti per studiare

patologie.

B : indica la densità recettoriale nel preparato biologico. Si esprime in moli/mg di

• max

proteina.

Come cambia la curva di binding se utilizzo una agonista o un antagonista? La curva non cambia,

rimane sempre la stessa.

La K per gli agonisti è anche un indice di potenza. Una buona K deve essere dell’ordine del

d d

nanomolare ma sotto l’1nm è la situazione ottimale. È proprio il confronto delle K che ci permette

d

di definire se l’affinità del mio farmaco per il recettore bersaglio è significativa, ma ci serve anche

per stabilire la specificità del legame del farmaco con il recettore bersaglio.

Esempio: l’analisi di 4 farmaci diversi, tutti inibitori

tirosin-chinasici, già usati in clinica. Si è in grado di

definire l’uso di una posologia di farmaco senza

l’interazione con altri legami. Capita che un farmaco con

una buona K venga scartato in quanto non riesce a

d

discriminare in maniera significativa gli altri bersagli

molecolari e si ritrovano K sovrapponibili. Lo studio di

d

binding permette di individuare la K non solo verso il

d

recettore considerato il binding biologico, ma anche nei

confronti di altre molecole.

La curva di binding per saturazione è sovrapponibile alle

curve concentrazione-effetto. La K determinata con gli

d

studi di biding per gli agonisti è anche indice di potenza.

Si ha un effetto massimo, che corrisponde al plateau

73

della curva, che corrisponde all’occupazione totale dei recettori e si può determinare la EC50, che

per gli agonisti corrisponde alla K .

d

Ci sono dei casi in cui le due curve non sono sovrapponibili,

dove la curva concentrazione-effetto sia spostata verso

sinistra rispetto alla curva di binding. Ciò indica che la K d

non coincide con la EC50. Siccome la K corrisponde alla

d

concentrazione in grado di occupare il 50% dei recettori

disponibili e l’EC50 è la concentrazione di evocare il 50%

dell’effetto massimo possibile, siamo in presenza di una

densità recettoriale superiore rispetto a quella necessaria ad

effettuare l’effetto biologico. Quando non si verifica questo

effetto è perché non si ha un numero sufficiente di recettori

che sono occupati. Affinché vi sia una buona sensibilità

all’azione di un ligando, i tessuti esprimono gli spare receptor,

ossia un numero di recettori che eccede il numero di recettori che

sarebbe sufficiente per dar origine alla risposta massima di quel

tessuto. Il binding determina l’occupazione dei recettori sui

recettori disponibili, ma se il tessuto esprime recettori di riserva

ecco che la K e l’EC50 sembrano due parametri diversi.

d

Il confronto dello studio di binding serve:

determinare la K per il recettore bersaglio

• d

per stabilire la specificità del farmaco per il recettore bersaglio

• determinare se il recettore è presente in tessuti, che per aumentare la sensibilità al ligando,

• sono in grado di esprimere i recettori di riserva.

Saggio per competizione Nelle provette vi sarà la

concentrazione crescente del ligando

in studio, che però non è marcata. Vi

sarà in oltre una concentrazione fissa

di un noto radioligando marcato a

saturazione. In funzione della

concentrazione crescente della

molecola in studio, parte del

radioligando che ha occupato tutti i

recettori disponibili del preparato

biologico, si avrà lo spiazzamento

che sarà in diretta funzione dell'aumento della concentrazione della molecola non marcata. Si

misura sempre la radioattività, che è dovuta ai complessi ligando-marcato recettore, però in questo

74

caso è quello noto, che si era messo a concentrazione saturante. Nella provetta con concentrazione

zero della molecola in studio si avrà la radioattività massima, mentre man mano che aumenterà la

concentrazione della molecola in studio, la radioattività decresce.

Si ottiene una curva in cui si ha lo spiazzamento del

ligando radiomarcato. All’aumentare della

concentrazione del ligando di cui voglio studiare

l’affinità la radioattività decresce. La radioattività in

studio ha al suo interno una quota di legame aspecifico.

La curva non va mai a zero, perché è presente una certa

quota di radioattività aspecifica. In questo caso la

determinazione del legame aspecifico è un valore fisso,

perché la concentrazione di ligando radioattivo che

stiamo usando è sempre la stessa ed è massima. Basta

toglierlo da ogni punto sperimentale e la curva va a

zero.

Il parametro che si ricava da questa curva è la IC50, concentrazione della molecola in studio in

grado di spiazzare il radioligando dal 50% dei recettori disponibile. Più piccola IC50 più grande

sarà l’affinità del farmaco per il recettore.

In genere per togliere la variabilità, data dalla scelta del radioligando utilizzato, si va a normalizzare

il valore di IC5 ottenuto, in modo da ottenere come parametro di affinità, quella che viene chiamata

K .

i

- concentrazione del radioligando utilizzato nel saggio di binding

-natura del radioligando impiegato 12/04/17

Le curve dose risposta permettono di definire sia la

tipologia di ligando e permettono di studiare gli ultimi tre

parametri legati al farmaco. La curva dose-effetto/dose-

risposta possono essere studiate sia in vitro che in vivo.

Quando si studia l'effetto e interazione di un farmaco con il

suo bersaglio attraverso una modalità sperimentale, ovvero

in vitro (esempio colture cellulari), si parla di curve concentrazione-risposta oppure

75

concentrazione-effetto. Saranno curve che mettono in relazione concentrazione del farmaco a cui

si espone il sistema in vitro, riguardo all'effetto desiderato. Le vere curve dose-effetto sono quelle

che derivano dagli studi in vivo: si correla la dose di farmaco somministrato, mediante via

particolare di somministrazione, a un animale da sperimentazione e l'effetto su di esso. Quindi

quando si vede una curva concentrazione-risposta si comprende che lo studio è fatto in vitro, mentre

se si vede una curva dose-effetto viene fatto in vivo.

Qual è la differenza importante? Ciò che interessa di più è la curva dose-effetto. Ad esempio si

valuta l'attività antitumorale di un farmaco: si può allestire una curva concentrazione-effetto in vitro

di una cultura di cellule tumorali umane esposte a diverse concentrazioni di farmaco, che come

effetto danno l'apoptosi. In vivo si mette in correlazione dosi crescenti di farmaco somministrato

con il volume di tumore, che da effetto. Si studia l'effetto desiderato, attraverso i due sistemi diversi

curva concentrazione-risposta e dose-risposta. Di cosa lo studio in vitro non tiene conto? Di tutti gli

aspetti riguardanti la farmacocinetica. Si valuterà l'efficacia, ma non che il farmaco arrivi al

bersaglio. L'effetto è il contenuto nelle vere curve dose-effetto! Utili entrambi, però le più

importanti sono le curve dose effetto e quindi è più importante utilizzare l'animale in toto. Esempio:

studiare l'effetto di un farmaco contro un tumore al pancreas sul topo e da effetto, poi portato

sull'uomo non da effetto.

Quali sono le info dalle curve dose-effetto? Ci danno

informazioni su ciò che avverrà nella situazione reale:

sull'efficacia, il plateu è indicativo dell'effetto massimo

raggiungibile con quel ligando ed è attraverso questo che si

definisce un agonista parziale, pieno, attività intrinseca ecc. e poi

definisce la potenza, ovvero calcolo della EC50. Più bassa è la

dose, minore sarà la quantità di farmaco necessario che arrivi al

bersaglio per dare l'effetto. Nella curva dose-effetto rappresentata, oltre all'effetto massimo

(efficacia), oltre all'EC50 del farmaco, l'allestimento della curva dice la maneggevolezza del

farmaco che si ricava attraverso la determinazione del coefficiente angolare (pendenza) della curva.

Perchè lavalutazione della pendenza di una curva è importante nella manegevolezza clinica del

farmaco? Piccoli spostamenti di dosaggi hanno un impatto molto forte sulla risposta, infatti se la

curva ha pendenza ripida (molto pericoloso). Più pendente, più variabilità nella risposta (asse X).

Una curva con una pendenza poco ripida, i dosaggi hanno un impatto poco rilevante nella risposta.

Si può avere la stessa EC50, stesso effetto massimo, stessa efficacia, ma la pendenza della curva

indica la sua maneggevolezza nell'eq chimico. In entrambi i casi gli estremi non vanno bene, la

curva troppo ripida è pericolosa, ma anche una pendenza blanda maneggevole e più sicuro non

permette di raggiungere il risultato desiderato, se non variando tantissimo la dose da somministrare.

L'ultima cosa che l'allestimento ci dice è la variabilità: Nella curva ipotetica rappresentata per ogni

dose che si utilizzerà, si avrà una certa numerosità nell'animale (es 5 animali ricevono la dose di

1g/kg, 5 che ricevono una dose 10g/kg). Il punto sperimentale estrapolato dalla curva sarà derivante

dalla media dei valori dei cinque animali che hanno assunto lo stesso trattamento. Curva ottenuta

sarà regolata da singoli punti sperimentali quali sono caratterizzati ad una sua variabilità.

76

Nell'insieme si otterrà la curva ideale che meglio interpola i dati sperimentali ma che sarà soggetta a

una variabilità (curva ideale con il suo errore). L'entità di questo errore, indica l'entità della

variabilità che ci si aspetta nell'usare il farmaco in clinica sull'uomo. Più ristretta è la variabilità

nella curva, minore sarà la variabilità che ci si aspetta quando il farmaco verrà somministrato ad una

popolazione elevatissima. La variabilità individuale a un trattamento farmacologico standard può

essere dovuto a reazione a patologie epatiche, metabolismo del farmaco, dimorfismi genetici che

alterano il bersaglio. Quanto più la determinazione della curve dose-effetto rispecchia queste

condizioni di variabilità uguali nell'uomo, tanto più questo sarà prevedibile dalla curva.

-Ultimo parametro associato al farmaco e importante per l'

applicazione clinica è l'indice terapeutico. La curva

dose-effetto serve anche per calcolarlo. L'indice

terapeutico è un parametro che non riguarda solo l'aspetto

terapeutico, determinato nello studio in sviluppo del

farmaco, che permette di prevedere se sarà efficace, e in

che modo sarà rispetto all'efficacia tossico. La Prima idea

predittiva che si può avere a livello pre-clinico è se il

farmaco può dare effetti blandi di tossicità oppure se

molto tossico. Si può avere farmaco che da origine a

effetto tossico, oppure causa di interazioni con altre

molecole e non da effetto. Riguardo alla tossicità di

farmaci che interagiscono con il bersaglio: ci sono farmaci

che danno tossicità interagendo con lo stesso recettore e

con gli effettori a valle che conseguono all'interazione del

farmaco con il recettore. Quindi l'effetto tossico e

terapeutico derivano dalla stesso meccanismo. Questo è un

problema serio! Un inibitore enzimatico: se l'enzima è

inibito tot non si raggiunge l'effetto terapeutico e si

necessita di una dose eccessiva, non si può dissociare i due

effetti che si ottengono dall'interazione con lo stesso

bersaglio, ma si può avere un farmaco sicuro perchè per

indurre l'effetto terapeutico molto più basso per inibire

l'enzima, invece che dal punto di vista dell'effetto tossico. E'

più semplice poter gestire la tossicità dei farmaco quando

l'effetto tossico non deriva dallo stesso meccanismo d'azione

con cui il farmaco da origine all'effetto terapeutico. Si

possono avere farmaci che danno origine all'effetto

terapeutico interagendo con il recettore, e farmaci che danno

effetto tossici interagendo con un altro recettore. Questo

deriva dalla non selettività legata al bersaglio. La

determinazione dell'affinità non solo determina il legame dei

farmaci, ma in confronto delle affinità si può comprendere

per quanti e quali bersagli molecolari o macromolecole il

77

farmaco presenta affinità stretta: si avranno effetti terapeutici derivanti dall'interazione con il suo

recettore, e l'effetto tossici dato dall'interazione con un altra macromolecola. I due effetti sono

distinguibili dal punto di vista meccanicistico (maggiore affinità per il recettore, minore per

macromolecole). Nel caso in cui avvengono i due meccanismi, si può cercare di creare un divario e

mantenere affinità significativa per il recettore che porta l'effetto terapeutico e cercare di diminuire

l'affinità verso il recettore con cui si ottiene l'effetto tossico.

L'indice terapeutico dice quanto un farmaco è potenzialmente sicuro nell'utilizzare le dosi che

servono per avere l'effetto terapeutico. Come si calcola? Servono le curve dose-effetto viste in

precedenza. Essendo l'indice terapeutico un parametro associato al farmaco che indica la differenza

tra le dosi in grado di dare gli effetti terapeutici e le dosi in grado di dare gli effetti tossici, viene

calcolato allestendo due tipi di curve dose-effetto:

-una per valutare l'efficacia del farmaco: all'aumentare della dose si valuta l'effetto terapeutico che è

messo in relazione. Un esempio classico è dato dal barbiturico ipnotico sedativo, il cui effetto è

appunto la sedazione, e si ottiene la curva presente nella slide con EC50, effetto massimo ecc.

- Per calcolare l'indice terapeutico si allestisce una seconda curva dose-effetto, analoga alla prima

(quindi in vivo) che mette in relazione le dosi prescelte di farmaco, ma in questo caso non viene

messo in relazione l'effetto terapeutico, ma è l'effetto tossico. L'effetto tossico più grave è la morte.

Quindi la curva dose-effetto che si allestisce mette in relazione l'aumento della dose con la mortalità

dell'animale da sperimentazione. Tale curva è detta curva della letalità.

La curva dose-effetto, in cui l'effetto efficace prevale sarà sempre a sx rispetto alla curva di letalità

(altrimenti si avrebbe prima la morte e poi l'effetto positivo del farmaco, situazione paradossale!!!).

L'indice terapeutico quindi sarà idealmente la distanza tra queste due curve: quanto più queste due

curve sono distanti tra loro, tanto minore sarà la probabilità di avere una dose che

contemporaneamente darà effetto terapeutico e tossico. Se le due curve invece sono vicine, si avrà

una dose che da effetto terapeutico e tossico. Tutto ciò si vede nella slide seguente.

Inizialmente e ancora oggi, l'indice terapeutico viene calcolato come rapporto tra la LD50 e EC50.

LD50: valore ricavato dalla

curva di letalità, ovvero la dose

necessaria a indurre la morte in

50% dei soggetti trattati con

quella dose. EC50: ricavata

dalla curva dose effetto, è la

dose in grado di evocare il 50%

dell'effetto massimo possibile.

Questo rapporto è chiaramente

indicativo della distanza tra le

due curve ed è l'indice

terapeutico. es: LD50 calcolata è 400mg, EC50 100mg, l'indice terapeutico del farmaco sarà 4.

Questo numero calcolato, si è dimostrato poco predittivo della reale distanza tra dose terapeutica e

78

tossica, perchè essendo calcolato tenendo conto solo del punto medio della sigmoide, non viene

presa in condiderazione tutta la pendenza della curva. Quindi è molto pericoloso stabilire la

sicurezza di un farmaco calcolando esclusivamente l'indice terapeutico.

Esempio: per due farmaci diversi, si ha la curva dose-effetto e di letalità. In blu un farmaco, in

giallo un altro. Si calcola l'indice terapeutico (quindi la sicurezza) per ogni farmaco. EC50 è la

stessa per entrambi. In un secondo esempio anche l'ED50 è la stessa. Ne deriva che per due farmaci

si otterrebbero lo stesso indice terapeutico, ma le curve sono molto diverse! Se nel primo casi si ha

il massimo effetto senza contemplare la curva di letalità, l'altro farmaco darà effetto, ma indurrà

anche il 30% di mortalità. Questo è il motivo per cui la sicurezza di un farmaco non è legata solo

all'indice terapeutico, ma si calcola quello che viene chiamato il margine di sicurezza. Se si prende

il punto medio della sicurezza, e si determina il valore di EC50 e LD50 questo risulta errato perchè

non tiene conto della sicurezza. Il margine di sicurezza identifica la distanza tra le due curve

prendendo come punto di riferimento punti inversi delle curve: è il rapporto tra le LD1: dose in

grado di evocare la letalità in 1% dei soggetti trattati, rapportato all'DE99: la dose che provoca il

99% dell'effetto massimo. Il margine di sicurezza dice la più piccola distanza in grado di evocare

effetto importante come la letalità e la massima dosa che si può utilizzare per avere l'effetto

terapeutico. Diventa un parametro realmente predittivo, ovvero rappresenta la vera distanza. Nel

grafico si evidenzia che solo in questa finestra può essere utilizzato il farmaco con sicurezza.

I due parametri che si ricavano dalle curve sono quindi indice terapeutico e margine di sicurezza.

Tanto più l'indice terapeutico è grande, tanto più sarà difficile che circostanze come sovradosaggio,

posologie ravvicinate, polimorfismi (determinano aumento della curva di concentrazione

plasmatica) possano portare alla mortalità. Quanto più l'indice terapeutico è piccolo, tanto più

aumentano le probabilità che sovradosaggi determinano tossicità! Farmaci sintetizzati in passato e

tutt'ora in uso non erano soggetti a determinazione a priori di questi indici, e quindi alcuni di essi

presentano un margine di sicurezza ristretto. Farmaci come la tachipirina non prevedono

trascrizione medica anche perchè sono sicuri e hanno un margine di sicurezza ampio, i dosaggi

consentiti sono 500 mg e 1000 mg. Altri farmaci invece presentano molte più tipologie di dosaggi:

0,1mg , 1mg, 2mg e quindi tali valori si discostano molti l'uno dall'altro e quindi un margine di

sicurezza molto ristretto. 79

Farmacologia speciale

Aspetto molecolare correlato all'effetto terapeutico. Si studieranno i farmaci suddividendoli per

studiare le interazione con organismi differenti. Per ognuna delle macromolecole si andrà a studiare

un meccanismo. Farmaci analgesici possono avere 3/4 meccanismi diversi e bersagli differenti.

Diverse tipologie che si valuteranno sono acidi nucleici, proteine strutturali, pompe trasportatori,

enzimi, canali ionici, recettori. In realtà le prime che verranno trattate sono le proteine bersaglio,

acidi nucleici perchè sia la proteina strutturale che l'acido nucleico rappresentano due esempi

abbastanza limitati di bersaglio molecolare. Sono pochi infatti i farmaci che hanno come bersaglio il

DNA o le proteine strutturali. L'unica classe di farmaci che presenti due bersagli sono due classi

diversi di antintumorali.

Per quanto riguarda proteine trasportatrici, canali ionici e recettori guardare lo schema sottostante:

Per quanto riguarda le proteine enzimatiche ci sono molti di essi che fungono da bersaglio

molecolare. Normalmente i farmaci utilizzati a scopo terapeutico sono classici inibitori enzimatici,

anche se l'interazione farmaco-enzima sono importanti per l'attivazione di pro-farmaci. Tra gli

esempi che si propongono si tratteranno 3 enzimi, ognuno ha caratteristiche differenti (aspetti

farmacocinetici, dinamici) in relazione alla malattia farmacologica.

Enzimi

Come bersaglio enzimatico si vedrà la vitamina

K reduttasi, bersaglio selettivo per una classe di

farmaci a funzione anticoagulante, COX è un

enzima trattato con FANS (farmaci

antinfiammatori non steroidei) usati 80

frequentemente, monoamminossidasi (MAO) trattati con due diverse tipologie farmacologiche

come antidepressivi, farmaci per il morbo di Parkinson, aceticolina esterasi bersaglio di farmaci per

il trattamento Anti-alzheimer.

Proteine trasportatrici

Come esempio di bersaglio molecolare ci sarà la

+ +

pompa H /K specifico per l'ulcera,

altro trasportatore bersaglio curato mediante

serotonina (antidepressivo) stesso risultato lo si ha

usando come bersaglio gli enzimi, ma non il

meccanismo.

Canali ionici

Come farmaci si studieranno gli anestetici

locali che hanno come bersaglio il canale del

sodio.

Recettori

Come recettore si farà un esempio per ogni

farmiglia di recettori nota. Per quanto riguarda il

recettore come farmaco si otterrà un effetto

diretto, quando il recettore bersaglio appartiene

alla famiglia di canali ionici regolati da ligando.

Oppure preveda meccanismo di trasduzione che possano prevedere la produzione di diversi effettori

direttamente , indiretto nelle altre tre famiglie. Esempio di recettore canale attivato da ligando,

recettore canale metabotropico, recettore tirosinchinasici e nucleari. A questo proposito, recettori

con il bersaglio recettore canale sono le benzodiazepine (ansiolitici), bersaglio recettore g protein è

il ventolin. Esempio di farmaco agente su recettore tirosin chinasici è l'insulina, e infine farmaci

che hanno come bersaglio recettori nucleari sono antiinfiammatori steroideri (ormoni steroidei

come cortisone, cortisolo, glucocorticoidi). 81

Risposta a un recettore canale è rapida: apertura del canale. Questi si traduce dal punto di vista

terapeutico è un effetto rapido. Recettori che utilizzano meccanismo di trasduzione del segnale che

può essere diverso in base al farmaco (es: Gprotein, recettori tirosinchinasici ecc) determinano una

risposta cellulare breve (secondi o ore) e questo si traduce in un effetto nel paziente di diversa

natura: quelli di velocità intermedia sono accoppiati a G protein, quelli più lenti nell'evocare

l'effetto cellulare e poi l'effetto terapeutico sono legati a recettori nucleari (l'effetto dipende da un

aumento della traduzione e trascrizione.

Proteine strutturali e acidi nucleari: bersagli selettivi di

farmaci antitumorali

Per capire in che modo l'interazione molecolare con il bersaglio specifico che spiega l'effetto

terapeutico sia condizionata dall'uso clinico dei farmaci, e come migliorare nello sviluppo di

farmaci antitumorali. Due classi di farmaci: uno agisce sulle proteine, uno sul DNA. Le

problematiche sono le stesse anche se il meccanismo è differente. La conoscenza del meccanismo

d'azione ci permetterà di individuare nuovi farmaci. Slide: curve rappresentano in

modo intuitivo ciò che si sa

fare dal punto di vista

farmacologico ciò che si sa

fare attualmente nel curare

pazienti oncologici. I tumori

sono una patologia

curabile? Dipende dal tipo

di tumore o dalla terapia

farmacologica il fatto che

sia ancora considerato una

patologia incurabile? Tutti e

due, ma chi ha incidenza

maggiore? Vediamo nel

dettaglio:

Curva mette in relazione il tempo con la massa tumorale. La curva A rappresenta l'evoluzione

temporale della massa tumorale senza aver eseguito una terapia. Questa curva dice che nella parte

iniziale la pendenza della curva è più ripida, poi rallenta e arriva a uno stato un po' più stazionario.

La curva dice che la velocità con cui il tumore cresce è molto rapida all'inizio, per poi diminuire

successivamente: quindi più la massa è piccola, si ha un rave proliferativo più veloce, perchè ha a

disposizione più nutrienti, ossigeno. Più la massa tumorale cresce, più diminuisce la probabilità di

trovare in poco tempo i nutrienti e ossigeno da rifornire in tutta la massa. Motivo per cui Il tumore

induce l'angiogenesi tumorale, ovvero formazione di nuovi vasi per crescere e proliferare

nuovamente. Questa linea rappresenta la dimensione di tumore nel momento in cui con metodi

diagnostici può essere rilevabile: numero minimo di cellule di cui una massa deve essere composto

per essere rilevabile. Quando si interviene con il trattamento farmacologico? Dopo che la diagnosi

82

ha evidenziato la presenza di tumore. Tutti gli interventi e i trattamenti che si fanno, si trovano nella

dimensione e fase della curva a crescita lenta. Ciò è uno svantaggio perchè il meccanismo d'azione

con cui agiscono i farmaci antitumorali prevede un'effetto su cellule tumorali proliferanti!

Teoricamente l'efficacia sarà maggiore quando più la cellula sta proliferando velocemente, rispetto a

uno stesso tumore in stadio più avanzato e stadio proliferativo più lento. Quando c'è la diagnosi di

un tumore c'è già switch angiogenico! Se si pensa all'effetto dei chemioterapici, bisogna pensare a

fare una diagnosi precoce. Un tumore piccolo non vuol dire che sia più curabile o meno pericoloso,

però diminuiscono le probabilità che sia avvenuto lo switch angiogenico (nuovi vasi) e metastasi

(torrente linfatico attraverso cui si diffonde per dare origine a tumori secondari), il rave proliferativo

più elevato e quini il tumore risulta più responsivo ad azione citotossica proliferativa dei farmaci.

Si stanno studiando trategie per diminuire i tempi di diagnosi, per usare i farmaci già presenti nelle

condizioni ottimali. L'aumento della massa porta alla morte del paziente: quali sono le opzioni

terapeutiche alternative?

-Resezione chirurgica del tumore: unica che comporta guarigione completa del paziente (Si vede

nella curva B) . Purtroppo non è sempre possibile la rimozione chirurgica per diversi motivi di

natura clinica, quindi si procede con:

-Radioterapia e chemioterapia. Non è il tipo di tumore che comporta l'impossibilità di resezione

chirurgica, ma l'organo in cui si trova, lo stadio avanzato con switch- angiogenico, metastasi,

metastasi quescenti (ovvero cellule derivanti dal tumore primario resezionato che hanno attecchito

altri organi, ma non rilevabili a livello diagnostico). In quest ultimo caso la rimozione chirurgica

comporta risveglio delle metastasi in altri organi e a distanza di pochi mesi si formano tumori

secondari in altri organi. Per questo la scelta dell'intervento chirurgico a volte risulta deleteria! E'

più facile tenere sottocontrollo la massa tumorale primaria piuttosito che le metastasi successive che

si vengono a formare. La chemioterapia come funziona?

I chemioterapici non sono come gli altri farmaci, si parla unicamente di cicli (non si fanno cicli di

antiinfiammatori). Perchè?

Slide andamento tipico della massa neoplastica curva C indica andamento tipico di una

chemioterapia neoplastica che funziona. Anche la modalità con cui un farmaco antineoplastico ha il

suo effetto (uccide le cellule tumorali), è una modalità particolare. Tutti i farmaci antitumorali

uccidono a parità di dose, non un numero costante di cellule tumorali, ma una frazione costante di

cellule tumorali. Esempio: massa con 100 cellule tumorali, si da una dose di farmaco e un altra

massa tumorale con 200 cellule e stessa dose di farmaco, ci si aspetta un maggiore effetto nel

tumore più piccolo. In realità, la dose non uccide 50 cellule in entrambi i tumori, ma il meccanismi

di killing di tutte le cellule tumorali è l'uccisione di una frazione costante, quindi indipendentemente

dal numero totale di cellule, il farmaco uccide ad esempio una frazione del 20% (Log kill cell=

meccanismo cinetico logaritmico di uccisione di cellule). Questo avviene nel cliclo di

chemioterapia: si somministra il farmaco che uccide una frazione di cellule, poi si sospende il

trattamento tra un ciclo e l'altro, nell'intervallo le cellule ricrescono; al secondo ciclo quindi si parte

sempre con una situazione peggiore rispetto al primo ciclo, frazione di cellule costante (non si

rimpicciolisce il tumore!!!), riduzione, si interrompe il trattamento; riscesce, un altro ciclo. L'entità

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è indipendente dalla massa tumorale di partenza. Se però va tutto bene, i cicli ripetuti possono

portare alla eradicazione della massa tumorale. Rispetto all'intervento chirurgico un pazioente che

ha fatto terapia non è guarito perchè comunque il metodo diagnostico non permette di capire se

qualche cellula è rimasta (così anche nell'intervento in realtà). Quindi si fa il follow up, per vedere

la ricrescita ogni 3 mesi. Putroppo la situazione nella cuva C non avviene spesso: e questo spiega

perchè il cancro non è ancora ben curabile. I farmaci neoplastici usati oggi sono potentissimi, non

ce bisogno di altri farmaci citotossicvi proliferativi, ma bisogna adottare delle strategie

farmacologiche che permettono il loro uso a una potenza, perchè il problema per cui non avviene

mai la curva non è legata all'efficacia del farmaco, ma perchè non lo si può utilizzare al massimo

potenziale per la tossicità e resistenza. La tossicità dei farmaci antineoplastici e la resistenza della

cellula tumorale in atto, come risposta alla terapia farmacologica, fa si che la curva C non sia l'esito

della terapia, ma si va incontro a una curva D. La curva D: usare cicli di chemioterapia, ma

comunque la massa tumorale si ripresenta sempre. La tossicità dei farmaci rende conto del fatto che

il paziente può tollerare certe dosi in alcuni periodi. Infatti l'effetto oncosoppressore ematopoietico è

l'effetto più grave. La tossicità dei farmaci regola l'intervallo tra i cicli, ovvero intervallo in cui la

massa ricresce. Perchè vada bene il trattamento bisogna interrompere il trattamento perchè il

paziente possa tornare ad essere tollerante al farmaco, e recupera leucociti, piastrine in quanto

l'effetto oncosoppressore è diminuito. Bisogna avere un tempo sufficientemente breve perchè il

tessuto ematopoietico possa ricostituire la popolazione di cellule, ma sufficientemente breve in

modo che la crescita di massa tumorale non vanifichi il trattamento precedente. Tempi più lunghi

per la ripresa del paziente tra un ciclo e l'altro vanifica il ciclo precedente, e quindi non è efficace

per quel paziente e quindi non vuol dire che il farmaco non funziona!

Cellule tumorali che inizialmente rispondono al farmaco di chemioterapia diventano resistenti, e

quindi non risponde più al trattamento farmacologico. Il meccanismo di resistenza è specifico per

una classe di farmaci, si muta il bersaglio cambiando farmaco. Se il meccanismo causa resistenza su

tutti i bersagli, allora si fanno cure palliative perchè la cura non è utilizzabile per vari aspetti, non

perchè il farmaco non funziona. Bisogna adottare una strategia per ridurre tossicità, meccanismo

selettivo ciò che fa la nanomedicina. 19/04/2017

Nel caso dei farmaci antineoplastici, la tossicità elevata che presentano, non ci permette di

utilizzarli alle massime dosi efficaci, ma alla massima dose tollerabili, che in una curva dose-effetto

corrisponde a meno del 70-80%. Nei farmaci chemioterapici le curve dose effetto e dose efficacia

sono molto vicine. Ecco perché si devono usare dosaggi bassi. Oltre alla tossicità, l’altro problema

di questi farmaci, è la comparsa di meccanismi di resistenza che le cellule tumorali sviluppano. I

farmaci che potrebbero essere in grado di aumentare l’aspettativa di vita a seguito di tumore ci

sono, solo che sono tossici e risultano essere poco efficaci in questi pazienti.

Tossicità

Quando si parla di tossicità ci si riferisce a tutti i farmaci neoplastici, che sono farmaci che cercano

di inibire la proliferazione cellulare. Il grosso limite della farmacologia antineoplastica è che non è

in grado di riconoscere tra le cellule sane e le cellule tumorali dell’organismo. Non si riesce a

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trovare un bersaglio selettivo nelle cellule tumorali. Tutti i farmaci che si usano contro i tumori

riescono solo a riconoscere l’elevata capacità riproduttiva delle cellule tumorali. Infatti, questi

farmaci bloccano la proliferazione cellulare e innescano l’apoptosi. Le curve di efficacia tossicità

sono molto vicine e i chemioterapici possono anche colpire le cellule sane del nostro organismo. Gli

effetti tossici si hanno sulle cellule sane e quiescenti dell’organismo. Gli effetti tossici, pertanto, si

manifestano a livello dei follicoli piliferi (anopecia), dell’epitelio intestinale (diarrea, nausea),

cellule germinali (sterilità) e nelle cellule del tessuto ematopoietico. La mielosoppressione (calo di

globuli bianchi, piastrine, globuli rossi) è l’effetto tossico più grave causato dai chemioterapici.

Ecco perché si procede con più cicli di chemioterapici affinché il paziente riesca a tornare ad avere

livelli di globuli bianchi, globuli rossi e piastrine sufficienti a sopportare la massima dose

tollerabile. Se il paziente non riesce a riportare il livello di globuli rossi, bianchi e piastrini

sufficientemente alto il ciclo di chemioterapico viene interrotto.

Se fossimo in grado di eliminare l’effetto tossico si riuscirebbe ad ottenere un effetto molto più

significativo. L’effetto tossico mielosoppressiivo è quello dose-limitante.

Vi sono degli effetti tossici legati ai meccanismi d’azione dei chemioterapici.

Resistenza

Meccanismi che si sviluppano a livello della cellula tumorale, che inizialmente era sensibile al

chemioterapico. In funzione del tipo di resistenza, possiamo più o meno gestire la resistenza dal

punto di vista clinico. Vi sono due tipi di resistenza:

1. intrinseca o primaria: quando quel particolare tumore umano non risponde a quella classe

di farmaci da subito, ha delle caratteristiche tali per cui il farmaco non fa effetto. Questa

resistenza è gestibile dal punto di vista clinico mediante. Si procede mendiante biopsia, e, a

seguito dell’analisi, si potrà sottoporre il paziente ad una terapia più specifica che non

sviluppa resistenza.

2. Acquisita: compare in corso di trattamento farmacologico. A seguito di biopsia si testa il

farmaco più efficace, il tumore risponde al trattamento, ma nonostante il trattamento

farmacologico il tumore continua la sua proliferazione. È lo stesso farmaco che seleziona i

cloni che hanno mettono in atto un meccanismo di resistenza al farmaco.

Specifica: il tumore diventa non responsivo ad una classe specifica di farmaci. In questo

◦ caso si può cambiare classe di chemioterapico.

generale (multi drug resistance): le cellule tumorali non sono più sensibile a nessun

◦ farmaco chemioterapico, anche se contraddistinti da meccanismi d’azione diversi.

85

Gli antimitotici

La prima classe di farmaci antineoplastici sono gli antimitotici. Vanno a bersagliare la beta-tubulina,

alterando la formazione del fuso mitotico. Ciò porta ad una divisione cellulare scorretta e innesca la

morte cellulare programmata.

La beta tubulina, assieme all’alfa-

tubulina, va a costituire gli eterodimeiri,

che si assemblano in protofilamenti e

costituiscono i microtubuli. Legando la

beta tubulina, gli antimitotici, alterano la

formazione della formazione del fuso

mitotico. La beta tubulina è il bersaglio

specifico di questi farmaci. Sia beta

tubulina che alfa tubulina presenza un

sito di legame per il GTP interscambiale.

Alfa e beta si assemblano a formare i protofilamenti ma sempre in orientamento positivo. Il polo

positivo è fondamentale per il processo di polimerizzazione o depolimerizzazione. In funzione della

quantità di GTP e dell’idrolisi di GTP si regola l’allungamento e l’accorciamento dei microtubuli.

Questi farmaci che hanno come bersaglio la beta-tubulina, non solo innescano un effetto

antiproliferativo, ma altereranno anche altri effetti legati alle funzioni dei microtubuli, ad esempio

effetto neurotossico, in quanto i microtubuli sono implicati nel traffico assonale. È l’unica classe di

farmaci chemioterapici che induce neurotossicità. A livello neuronale la reversione di questo effetto

neurotossico non è così scontata. 86

Questa classe di farmaci è molto efficace contro i sarcomi, che però si sviluppano maggiormente in

ragazzi adolescenti e bambini. Quando un paziente assume un farmaco con effetti tossici collaterali

molto gravi, il paziente è a conoscenza dei pro e dei contro. Si dice che un paziente non è più

aderente alla terapia farmacologica quando esso sostiene che l’effetto tossico sia troppo

incompatibile con una qualità di vita accettabile.

Meccanismo molecolare specifico

Entrambe le globuline hanno il sito di legame per GTP, ma solo la

beta tubulina è in grado di idrolizzare GTP. I siti di legame

specifici localizzati a livello della beta tubulina sono:

alcaloidi della vinca: è un sito di legame vicino al sito di

• legame per il GTP interscambiabile

Tassani: sito localizzano nell’interfaccia tra alfa e beta

• tubulina.

Questi siti di legame diversi, rendono conto di effetti finali diverso nel modificare il microtubolo.

Il sito di legame agli alcaloidi della vinca sarà

accessibile solo all’estremità positiva, cioè il

cappuccio di allungamento del microtubulo, ne

consegue che viene bloccata la capacità della beta-

globulina di promuovere l’aggiunta di ulteriore

eterodimeri e il microtubulo viene indotto alla

depolimerizzazione.

Il sito di legame dei tassani è accessibile lungo tutto il microtubulo. Questi farmaci si legano in più

punti e la presenza dei farmaci lungo tutto il microtubulo, fa perder la dinamicità del microtubulo.

Per questo vengono definiti come agenti stabilizzanti dei microtubuli.

Vi è anche una terza molecola che ha una buona affinità per la beta globulina che si localizza anche

essa a livello dell’interfaccia tra beta e alfa tubulina, la corticina. La corticina è stata ampiamente

sostituita dagli alcaloidi della vinca e dai tassani, ma viene comunque usata per studiare i

microtubuli . In clinica non viene utilizzata come antineoplastico ma come farmaco antigotta.

Il farmaco chemioterapico uccide una frazione costante di cellule. Agirà solamente quando le

cellule si troveranno in una determinata fase del ciclo cellulare, nella fase M, e vengono definiti

come farmaci ciclo e fase specifici. Al contrario, vi sono invece altri farmaci che sono non-ciclo e

non-fase specifici.

Alcaloidi della vinca

questi farmaci sono di origine naturale e non derivano da una sintesi pensata, ma derivano dalla

vinca rosea (pianta). I primi sono stati estratti da questa pianta e sono stati testati e studiati i

meccanismi d’azione. Oggi, alcuni di questi farmaci sono prodotti per via semi-sintetica. Questi

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farmaci presentano dei profili differenti. Il contesto con cui questi farmaci vengono usati sono

leucemie, linfomi e sarcomi, che sono i tumori che hanno maggiore incidenza a livello pediatrico-

adolescenziale. La vinorelbina è diventata specifica per il tumore ai polmoni.

Tassani

derivano dalla corteccia del taxus brevifoglia e vi sono solo due

rappresentanti (paclitaxel e il docetaxel). Il paclitaxel è stato il farmaco che

ha cambiato radicalmente il trattamento dell tumore al seno delle donne.

L’aspettativa di vita delle donne affette da carcinoma mammario è passata dal

20% all’80% grazie ai tassani, che agiscono anche in caso di metastasi. Sono

state estese le proprietà terapeutiche anche per il tumore ovarico.

Tossicità

limitante: mielosoppressione

• neurotossico

Una delle modalità per cercare di ridurre la tossicità è quella di cercare di bersagliare il tumore, in

modo che al tumore si somministri una dose molto più alta. Si aumenta l’efficacia, diminuendo la

tossicità.

Una delle prime modalità che è stata sfruttata a questo scopo è l’effetto EPR (Enhanced

Permeability and Retention effect). È un effetto dovuto al fatto che i vasi, che vanno ad irrorare la

massa tumorale, presentano delle caratteristiche morfologiche e funzionali diverse rispetto a quelli

sistemici.

Presentano ampie

• fenestrature

mancano giunzioni serrate

• sono tortuosi

• flusso rallentato

• le cellule endoteliali

• presentano dei marcatori

di superficie che sono

distinguibili dall’endotelio

sano.

La massa tumorale cresce, viene

irrorata, ma non in modo omogeneo in quanto i vasi hanno un flusso rallentato. Ciò comporta che la

massa tumorale presenta dei capillari che sono più permissivi. Durante il processo di distribuzione

si ha una situazione nella norma a livello dei capillari e quindi il paclitaxel verrà distribuito secondo

le normali modalità; a livello del tumore, il farmaco dovrebbe essere distribuito maggiormente. La

tortuosità dei vasi, fa si che il farmaco non si trovi omogeneamente distribuito e la distribuzione

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risulta essere anomala. Se si coniuga il farmaco (paclitaxel) con una molecola molto più grande, si

ottiene una formulazione poco permeabile ai normali capillari, ma questo aumento dell’ingombro

sterico ne permette il passaggio attraverso le fenestrature dei capillari tumorali. Il processo di

distribuzione è limitato solo alla massa tumorale. Una volta che il farmaco arriva all’interstizio delle

cellule tumorali, viene rapidamente internalizzato, mediante un meccanismo di endocitosi. Durante

il processo di acidificazione, l’abbassamento del pH determina un taglio e la liberazione del

farmaco rispetto alla struttura che era legato. Il farmaco viene rilasciato solo quando è dentro alla

cellula tumorale. In questo modo si diminuisce la tossicità.

Lo xyotax è il paclitaxel legato all’acido poli-glutammico, in modo da incrementare l’ingombro

sterico. L’uso dell’acido poli-glutammico è utile anche per l’eliminazione perché la sua

degradazione porta a prodotti utilizzabili per la cellula. Ciò che verrà eliminato è il paclitaxel libero.

Differenze di farmacocinetica tra somministrazione di paclitaxel libero e paclitaxel coniugato.

Emivita: paclitaxel coniugato ha un’emivita molto più lunga perché rimane per molto più

• tempo nel torrente circolatorio.

CMAX (picco di concentrazione plasmatica massima, è il punto di equilibrio di tutti i

• processi della farmacocinetica): quando somministro la dose convenzionale di farmaco si

raggiunge una CMAX di 879. Con la stessa dose di paclitaxel, coniugato, la CMAX diventa

11mila. La CMAX aumenta perché il processo di distribuzione è più lento

AUC (area sottesa alla curva di concentrazione plasmatica)

In questo caso, valori così elevati di emivita, cmax e AUC, permettono di confinare il farmaco solo

a livello del tumore.

Il paclitaxel può essere coniugato anche a

molecole di albumina, andando a formare

l’Abraxane. In questo caso si sfrutta un

processo di transcitosi peculiare, dovuto

alla presenza dell’albumina. Questo

farmaco arriva in maniera privilegiata alla

massa tumorale grazie all’albumina che

interagisce con il recettore gp60, che è

presente a livello delle cellule delle

caveole. Le caveole permettono la

transicitosi delle molecole che vengono

poi rilasciate a livello dell’interstizio

tumorale. Questa distribuzione potrebbe

avvenire ovunque, ma in realtà

l’espressione di questo recettore è aumentata a livello dell’endotelio dei vasi che irrora i tumori. Si

favorisce così una maggiore distribuzione a livello del tumore, anche se il farmaco può essere

rilasciato anche in altri distretti, ma non risulta essere molto pericoloso. Il farmaco, giunto

all’interstizio tumorale, si lega a proteine SPARC, che sono delle proteine tipiche del

89

microambiente tumorale, e fanno da veicolo tra paclitaxel e le cellule tumorali. Il paclitaxel entra

all’interno della cellula ed è in grado di innescare il

suo processo antimitotico. Il ruolo della proteina

SPARC fa in modo che il paclitaxel si accumuli a

livello delle cellule tumorali.

Curve dose-effetto (mortalità): LD50 di paclitaxel

libero è di 30mg/kg, si ha solo il 40% dell’effetto

massimo. l’aver legato il paclitaxel, ha spostato la

curva verso destra e LD50 è di 47mg/kg, si può quindi

somministrare una dose nettamente superiore. 26/04/17

La resistenza e tossicità sono le due problematiche che vanificano la terapia farmacologica. Una

modalità per superare la tossicità è fare dei nuovi farmaci, formulazioni con effetto EPR, altri che

sfruttano la trancitosi endoteliale e interazione con proteine iperespresse presenti nelle cellule

tumorali. In questo capitolo si tratteranno i farmaci atimitotici che sono correlati alla resistenza. Ci

sono diversi tipi di resistenza: intrinseca e acquisita.

Resistenza intrinseca: meccanismi molecolari che la cellula tumorale presenta già prima

• dell'esposizione al farmaco e che rende i tumori già insensibili ai farmaci anti-neoplastici.

Resistenza acquisita: in cui il tumore è sensibile all'effetto farmacologico, ma nel corso

• della terapia mette in atto meccanismi molecolari che lo rendono resistente all'effetto

farmacologico. Questo è uno dei problemi!!!

Oltre a questi troviamo la resistenza specifica e generalizzata.

Resistenza specifica: si riferisce a cellule tumorali che mettono in atto meccanismi

• molecolari che conferisce loro un fenotipo resistente a una classe specifica di farmaci

antineoplastici. Questo tipo di resistenza può essere risolto dal punto di vista clinico

cambiando la classe farmacologica.

Problema più grave è la resistenza generalizzata in cui la cellula tumorale mette in atto

• meccanismi che danno origine a un fenotipo resistente a tutti i farmaci antitumorali a

disposizione. Un tumore din questo tipo diventa incurabile dal punto di vista farmacologico

e quindi strategie che permettono di revertire questo fenotipo con resistenza multidrug

generalizzata a un fenotipo sensibile rende nuovamente curabili tumori umani che non lo

sono.

Sono 3 i meccanismi di resistenza delle cellule tumorali che mettono in atto sotto trattamento con

antimitotici:

1.meccanismo di resistenza specifico: dovuto alla mutazione del bersaglio farmacologico. Le

cellule tumorali mutano la beta tubulina. Questa mutata nelle cellule mantiene la capacità di

formare eterodimeri, che si legano all'alfa-tubulina, mantiene attività ATPasica, continuano a

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formare i protofilamenti, microtubuli del fuso mitotico, ma la mutazione a livello del sito di legame

farmacologico determina un drastico decremento dell'affinità del farmaco per il bersaglio. Queste

decremento conferisce a queste cellule resistenza specifica agli alcaloidi della betatubulina. Le

mutazioni della betatubulina sono molto frequenti durante il trattamento farmacologico, ma dal

punto di vista clinico tale resistenza specifica è superabile trattando i tumori con una nuova classe di

farmaci.

Per gli alcaloidi taxanici invece si avrà la formazione di un fenotipo a resistenza multidrug con due

meccanismi:

1. over espressione della glicoproteina P. Questa è una pompa di flusso aspecifica, che lega con i

substrati molecole distinte dal punto di vista strutturale e di mediarne l'estrusione dalla cellula.

Essendo aspecifica, le cellule tumorali che overesprimono glicoproteina P, estrudono attivamente

non solo gli alcaloidi della betataxani, ma anche tutti i farmaci neoplastici che entrano per

diffusione passiva. Una volta rilasciato nella cellula tumorale, questo sarà substrato della

glicoproteina P che lo estruderà in maniera efficiente verso l'esterno. La concentrazione

intracellulare del farmaco antineoplastico sarà sarà al di sotto di quella minima per interagire con il

bersaglio farmacologico e non da origine all'effetto farmacologico. Questa è una comune forma di

resistenza. Il taxano entra nella cellula tumorale e deve raggiungere i microtubuli (la betatubulina

come bersaglio), per avere un effetto farmacologico deve esserci una concentrazione intracellulare

sufficiente, però avviene la rapida estrusione sulla membrana delle cellule tumorali.

Cellula tumorale che non esprime glicoproteina P, fa raggiungere la concentrazione ideale, favorisce

l'interazione con microtubulina, blocco del fuso e inibizione dei microtubuli per cui si avrà un

effetto farmacologico.

Cellula tumorale over esprimente la glicoproteina P, non darà origine a una concentrazione

intracellulare sufficiente per evocare l'effetto.

Si può aumentare la dose per ottenere l'effetto? Non si possono aumentare le dosi perchè i farmaci

non sono scelti in base alla curva dose-effetto, ma sono scelti sfruttando la curva di tolleranza,

ovvero in base alla massima dose tollerabile. La massima dose tollerabile è valutata su cellule sane,

quindi non si può implementare la concentrazione intracellulare di farmaco perchè le cellule sane ne

risentono, mentre le cellule tumorali risultano resistenti alla dose.

2.L'altro meccanismo con cui le cellule tumorali acquisiscono un fenotipo di resistenza

generalizzata è dovuta all'over espressione della proteina survivina. La survivina è una proteina

ad azione anti-apoptotica. Perchè i farmaci che la over esprimono hanno resistenza generalizzata

verso tutti i farmaci antitumorali (indipendentemente dalla struttura e dal bersaglio)? Qualsiasi sia

il meccanismo d'azione dei farmaci anti-neoplastici, l'effetto citotossico finale è dovuto al fatto che

questo meccanismo d'azione induce al pathway apoptotico. I farmaci bloccando la betatubulina,

alterando il fuso mitotico, causa un danno nella cellula tumorale che deve rispondere innescando il

meccanismo di morte cellulare programmata. Questo è mediata dalla corretta attivazione del

pathway. L'aumento della survivina come proteina antiapoptotica conferisce alle cellule tumorali un

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fenotipo con resistenza generalizzata, perchè qualsiasi sia il danno indotto dall'antitumorale, up

regolazione della survivina comporta aumento della vitalità della cellula.

Questi meccanismi sono diversi ma conferiscono ai tumori con up regolation la resistenza più

grave!

Andando a parlare nel dettaglio di questi due meccanismi, la glicoproteina P è presente

fisiologicamente in alcuni organi e tessuti. E in particolare nell'epitelio intestinale, la sua presenza

rappresenta uno dei parametri che regola l'assorbimento dei farmaci somministrati per via orale,

perchè una volta che si ha il processo di assorbimento vengono ributtati nel lume intestinale. La

glicoproteina P e il gene che la codifica sono stati trovati nelle cellule tumorali, il gene che la

codifica è detto MDR1 (multidrug resistance) proprio perchè è stato identificato per la prima volta

in queste cellule che manifestavano un fenotipo di resistenza generalizzata. Successivamente i

livelli di espressione della glicoproteina sono stati individuati in tessuti sani.

Cosa succede: all'interno della massa tumorale ci saranno cloni che non esprimono la glicoproteina

P e altre che la esprimono. All'inizio del trattamento quindi il tumore è responsivo al farmaco perchè

la maggior parte delle cellule non esprime la glicoproteina P e quindi si da avvio al processo di

apoptosi, poi il trattamento farmacologico comporta la selezione clonale e quindi le poche cellule

over esprimenti la glicoproteina P diventano preponderanti, saranno resistenti, mentre le cellule che

non la presentano verranno uccise. Il tumore cresce perchè sarà costituito da cellule tutte esprimenti

la glicoproteina P. Da qui, il paziente che inizialmente era responsivo, ad un certo punto non

risponde più ai cicli e il tumore è cresciuto rispetto alla partenza: acquisizione della resistenza. In

genere quindi si va ad individuare il tipo di resistenza che da la non risposta clinica: Biopsia

-->determinazione delle caratteristiche molecolari che rendono le cellule resistenti. Se il fenotipo

resistente è dovuto alla betatubulina, il paziente è divenuto resistente, ma siccome il meccanismo di

resistenza è specifico si cambierà la classe di farmaci, e il paziente torna ad essere responsivo alla

chemioterapia. Se però nella biopsia emerge up regolazione della glicoproteina P, si diagnosticherà

nel paziente una resistenza acquisita generalizzata e non avendo strategie farmacologiche che

revertiscono il fenotipo, il tumore è potenzialmente intrattabile. Non si vanno perciò a individuare

nuovi composti citotossici, ma strategie con i farmaci già in nostro possesso. Quindi sono in

sviluppo strategie che portano alla reversione farmacologico. Uno degli aspetti da non sottovalutare

è il fatto che questa pompa esiste in organi e tessuti sani con un ruolo fisiologico importante. Oltre

nell'intestino dove regola l'assorbimento di sostanze introdotte per via orale, si trova anche a livello

dei reni, nel fegato e nelle barriere anatomiche come la barriera ematoencefalica. La localizzazione

fisiologica della pompa aspecifica evidenzia un ruolo di protezione e regolazione nella distribuzione

di sostanze xenobiotiche nell'organismo.

Nell'intestino regola l'assorbimento (cerca di estrudere nel lume le sostanze che sono substrato),

nella barriera ematoencefalica regola la distribuzione (rema contro l'ingresso delle sostanze

xenobiotiche nel SNC), nei reni regola l'escrezione (favorisce l'estrusione delle molecole verso i

dotti/lume), nel fegato regola il metabolismo (estrude dagli epatociti le sostanze substrato, e questo

è un effetto epatoprotettivo perchè serve a evitare il sovraccarico epatico a sostanze xenobiotiche).

Qualsiasi strategia farmacologica adottata avrà un effetto sulla glicoproteina P fisiologica.

92

Le strategie adottate nei trial clinici per poter dare il chemioterapico insieme a sostanze in grado di

revertire il fenotipo la cellula rendendola nuovamente sensibile alla terapia. Sono state molte le

strategie pensate come si vede nello schema.

1. Sviluppo di inibitori chimici della pompa: farmaci che hanno come bersaglio la

glicoproteina P e quindi la inibiscono. Queste molecole sono di prima, seconda, terza

generazione.

2. anticorpi monoconali antiglicoproteina P: con l'idea di inibirne la funzione.

Oltre a farmaci o anticorpi che bersagliassero la glicoproteina P, si è pensato a un'altra strategia che

principalmente non inibisce la pompa direttamente downregolandone l'espressione, ma:

3. strategia che permette di bypassare il funzionamento: la logica prevede che un farmaco

classico che passa per diffusione passiva, oppure mediante endocitosi nella membrana della cellula

tumorale, venga catturato dalla glicoproteina P. Come viene inibita in modo indiretto la pompa? Si è

cercato attraverso un liposoma o un nanocomplesso di farvorire il rilascio del farmaco lontano dalla

membrana e quindi dalla glicoproteina P: Il farmaco contenuto nel liposoma viene internalizzato

attraverso un meccanismo di endocitosi nella membrana, e tale fusione avviene con la maturazione

dell'endosoma. Successivamente avviene il rilascio fisico del farmaco all'interno della cellula

tumorale ben lontano dalla glicoproteina P. Questo può essere una modalità per aumentare la

quantità del farmaco antineoplastico intracellularmente in presenza della glicoproteina P attiva.

I primi trial infatti furono svolti utilizzando liposomi, in realtà questi risultavano meno efficienti

rispetto le nanoformulazioni perchè il liposoma non viene internalizzato come tale, ma si fonde con

la membrana. Però questo ha dato la possibilità di pensare a un rilascio fisicamente lontano dalla

pompa. La nanoformulazione, siccome viene internalizzata come tale, risulta più efficiente in

quanto avviene un semplice meccanismo di endocitosi (e non fusione con la membrana che

potrebbe comportare dei cambiamenti strutturali). Alcuni farmaci come l'alcaloidi della ... che

presentano una forma di resistenza, sono stati trattati sfruttando questo meccanismo. Questo quindi

permette una reversibilità del fenotipo, ma la sensibilità non è ottimale.

4. strategia di downregolare la glicoproteina P: contrastare un over espressione e resistenza della

cellula tumorale, attraverso modalità di silenziamento dell'mRNA per la glicoproteina P, in modo da

downregolarne l'espressione. L'espressione della glicoproteina P risulta essere ridotta, rendendo la

cellula responsiva al farmaco.

STRATEGIE DIVERSE, MA LA LOGICA FINALE NON E' FAR INIBIRE COMPLETAMENTE

L'ATTIVITA' DELLA GLICOPROTEINA P, MA UNA STRATEGIA CHE PERMETTA DI

AVERE IN FUNZIONE DELLA DOSE SOMMINISTRATA UN RECETTORE

INTRACELLULARE DI FARMACO PER L'INTERAZIONE CON IL BERSAGLIO E QUINDI

DELL'EFFETTO FARMACOLOGICO.

Inibitori chimici

I primi inibitori chimici della glicoproteina P utilizzati nei pazienti oncologici che presentavano una

resistenza di questo tipo, sono inibitori che non hanno eseguito un normale processo di sviluppo

93

(trial development). Ci sono moltissimi farmaci di nostra conoscenza che sono substrati della

glicoproteina P, non solo neoplastici. Nei trial clinici sono stati utilizzati farmaci già in commercio

per altri effetti, (come ad esempio il derapamil che viene utilizzato per alcune patologie

cardiovascolari) e quindi non è necessariamente antitumorali, che però sono substrato della

glicoproteina P.

Ne viene usato qualcuno come inibitore competitivo insieme a farmaci antineoplastici per cercare di

revertire il fenotipo da resistente a sensibile. Quindi non si sviluppano da ex novo inibitori della

pompa, ma si utilizzano substrati già conosciuti, approvati sull'uso clinico. Gli inibitori chimici di

prima generazione agiscono da inibitori competitivi sulla glicoproteina P.

CONCETTO: dose convezionale di chemioterapico ( che però è stato buttato fuori dalla cellula

tumorale per azione della glicoproteina P), viene co-somministrato un substrato della pompa, in

funzione dei rispettivi dosaggi e delle rispettive attività verso la glicoproteina P, si potrà avere un

aumento della concentrazione intracellulare di farmaco antineoplastico. Se si riesce ad aumentare la

concentrazione fino alla minima concentrazione attiva, si avrà l'effetto farmacologico.

Il derapamil fu uno dei primi farmaci usati a tale scopo. Per permettere un fenomeno di

competizione, che potesse portare a un incremento significativo della concentrazione intracellulare

dell'antitumorale, i dosaggi del competitore dovevano essere estremamente elevati. Questo è legato

alla tossicità esacerbata dai farmaci utilizzati come competitori. Esempio il derapamil preso in

considerazione, che veniva dato per il suo effetto terapeutico sulle patologie cardiovarscolari alla

consueta dose ottimale e non dava tossicità elevata, se esso invece veniva usato come competitore il

dosaggio risultava maggiore rispetto a quello usato a scopo terapeutico, e quindi la tossicità dovuta

al competitore era molto elevata! Questo ha limitato l'uso di inibitori di prima generazione, ma a

permesso di capire che questo schema poteva funzionare.

Sulla base di questo sono stati sintetizzati inibitori chimici di seconda generazione che sono

analoghi ai primi dal punto di vista del meccanismo d'azione, però sono sintetizzati ad oc perchè

presentano un'affinità migliore, con una tossicità blanda e sulla base della struttura chimica dei

precedenti (quasi tutti analogi agli inibitori di prima generazione). Sulla base della struttura chimica

del derapamil, il desderapamil è un inibitore di seconda generazione. Si sfrutta quindi la struttura

chimica che garantisce di essere substrato della glicoproteina P, ma sono chimicamente più affini ad

essa, e quindi risultano meno tossici rispetto ai farmaci che non sono stati sviluppati con questo

scopo. Gli inibitori competitivi secondari però mantengono un aspetto negativo: ovvero sono ancora

poco selettivi per la glicoproteina P espressa dalla cellula tumorale. Fungono da inibitori

competitivi non solo per la cellula tumorale, ma anche per tutte le sostanze xenobiotiche che sono

substrato della glicoproteina P fisiologica. L'uso di farmaci di seconda generazione altera la

funzione della pompa anche nell'intestino, fegato, reni, barriera ematoencefalica, provocando effetti

tossici, in quanto l'effetto protettivo della pompa nei confronti delle sostanze xenobiotiche viene

meno!!!! Questo problema è serio perchè questi inibitori per mantenere un effetto responsivo delle

cellule tumorali al farmaco devono essere somminitrati sempre.

Da qui lo sviluppo di inibitori di terza generazione: attraverso questo tipo di inibitori, si è cercato

di regolare la selettività nei confronti della glicoproteina P nelle cellule tumorali, rispetto a quella

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yetapia

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DETTAGLI
Esame: Farmacologia
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Farmacologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Costa Barbara.

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