Esame di Stato 3° Prova

Microscopia

Uno dei più importanti strumenti usati per studiare le strutture della cellula. Le cellule furono descritte per la prima volta intorno al 1600. Pochi anni dopo, un naturalista olandese riuscì a costruire un sistema di lenti che potevano ingrandire le immagini più di 200 volte. Così riuscì a visualizzare batteri, protisti, cellule ematiche. A seconda della radiazione utilizzata per illuminare il campione si distinguono due tipi principali di microscopio: ottico ed elettronico. Nel primo si impiega radiazione visibile (luce), nel secondo un fascio di elettroni accelerati.

Caratteristiche del microscopio

Ci sono due caratteristiche tipiche che differenziano ciascun microscopio:

• Ingrandimento: è il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e le dimensioni effettive dell’oggetto.
• Potere Risolutivo o Risolutezza: è la capacità del microscopio di distinguere anche i più piccoli dettagli dell’immagine (tale capacità dipende dalla qualità delle lenti e dalla lunghezza d’onda della sorgente luminosa, questo perché quando la Lunghezza d’Onda diminuisce, aumenta la Risoluzione).

Microscopio ottico

Il passo successivo fu l’invenzione di questo strumento costituito da un tubo con lenti di vetro a ciascuna delle estremità. Siccome contiene diverse lenti, il moderno microscopio è detto “Microscopio Ottico Composto”. I modelli più sofisticati sono in grado di ingrandire l'immagine del campione fino a circa 1000 volte (1000x). La luce visibile passa sia attraverso il campione che deve essere osservato, sia attraverso le lenti.

L'attrezzatura accessoria di un microscopio comprende inoltre: piano portacampioni e alcuni dispositivi di regolazione della distanza dell'obiettivo dall'oggetto, per la messa a fuoco. In genere il campione da osservare viene posto fra due vetrini sottili e fissato al portacampioni.

All’inizio del 20^o secolo, i biologi, grazie a versioni più moderne del Microscopio Ottico e allo sviluppo di composti chimici in grado di colorare le strutture cellulari in maniera diversa, scoprirono che le cellule contengono diverse strutture interne, dette organuli. Lo sviluppo di coloranti biologici è stato essenziale per questo tipo di scoperte, in quanto l’interno della maggior parte delle cellule appare trasparente al Microscopio Ottico. Tuttavia, quasi tutti i metodi usati per preparare e colorare le cellule da osservare ne provocano la morte. Oggi le cellule vive possono essere studiate utilizzando Microscopi Ottici dotati di speciali sistemi.

• Microscopia in Campo Chiaro: il campione è visualizzato grazie alla luce che passa direttamente dal condensatore al vetrino. Quindi attraversa completamente il campione.
• Microscopia in Campo Oscuro: viene usato un “condensatore” che impedisce alla luce trasmessa di illuminare direttamente il campione, comparendo così piccole particelle luminose del campione che è riflesso su uno sfondo nero, sfruttando le differenze di densità all’interno della cellula.
• Microscopia a Contrasto di Fase: tali differenze fanno sì che le varie regioni del citoplasma emettano la luce in maniera diversa.
• Microscopio a Fluorescenza: serve per osservare preparati naturalmente fluorescenti o legati con molecole fluorescenti. La sorgente luminosa trasmette radiazioni ultraviolette o comunque di bassa lunghezza d'onda nel visibile, eccitando il preparato generalmente dall'alto. Nell'osservazione è fondamentale l'utilizzo corretto dei filtri ottici per selezionare la giusta lunghezza d'onda.
• Microscopio Confocale: si basa su una tecnologia ottica volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione. Le immagini ottenute permettono di apprezzarne la tridimensionalità.

Microscopio elettronico

Anche se si utilizzano buoni microscopi ed opportune tecniche di marcatura, il normale Microscopio Ottico può solamente distinguere i dettagli più grossolani della cellula. In molti casi si vede solo il contorno di una cellula o la sua capacità di colorarsi con alcuni coloranti.

È intorno agli anni ’50 che venne introdotto il Microscopio Elettronico. Lo schema del funzionamento di un Microscopio Elettronico è analogo a quello di un Microscopio Ottico: una sorgente produce la radiazione che incide sul campione e, passando attraverso specifici sistemi che fungono da lenti, va a comporre l'immagine ingrandita.

Il potere di risoluzione del Microscopio Elettronico è pertanto notevolmente maggiore di quello dei microscopi ottici perché non sfrutta la luce come sorgente di radiazioni, ma un fascio di elettroni.

• Microscopio Elettronico a Trasmissione: fornisce un’immagine ad altissima risoluzione e fortemente ingrandita. Gli elettroni che costituiscono il fascio attraversano completamente il campione. Il potere d'ingrandimento arriva fino a 1 milione di volte.
• Microscopio Elettronico a Scansione: un fascio di elettroni colpisce il campione che si vuole osservare. Dal campione vengono emesse numerose particelle tra le quali gli elettroni secondari. Questi elettroni vengono rilevati da uno speciale Rivelatore e convertiti in impulsi elettrici. Tale microscopio consente di dare informazioni sulla forma e caratteristiche della superficie della cellula (queste non possono essere fornite con il Microscopio Elettronico a Trasmissione). Ogni punto del campione analizzato corrisponde a 1 pixel dello schermo televisivo, cosicché, man mano che il fascio elettronico scorre sul campione, sullo schermo si costruisce un'immagine completa. Un Microscopio Elettronico a Scansione ha potere di ingrandimento pari a circa 100.000 e fornisce un'immagine tridimensionale molto dettagliata.

Colture di microrganismi

Il primo passo per lo studio dei microrganismi (batteri e virus) è la preparazione di una coltura che contenga organismi vivi. In questo modo, anche essendo al di fuori del loro ambiente naturale, questi riescono a sopravvivere e moltiplicarsi. Il substrato impiegato in laboratorio per la crescita di batteri, muffe, lieviti, protozoi è un insieme di sostanze nutritive complesse.

I terreni di coltura, in base allo stato fisico, si distinguono in:

• Terreni Solidi o Agarizzati: contengono 5-10% di “Agar” (gel derivato dalle alghe e che non è degradato da enzimi di molti microrganismi); questi terreni si presentano sotto forma di gel a T. ambiente.
• Terreni Semisolidi: contengono meno agar.
• Brodi: l'agar è assente, sono liquidi a T. ambiente.

I terreni possono essere classificati anche in:

• Terreni Nutritivi: consentono la crescita di tutte le specie microbiche.
• Terreni Selettivi: hanno sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni microrganismi invece di altri.
• Terreni Differenziali: consentono la distinzione in base ad alcune peculiari caratteristiche metaboliche (es. Fermentazione di zuccheri).
• Terreni di Arricchimento: forniscono i nutrienti e quelle condizioni ambientali che favoriscono la crescita di particolari organismi.

Nel caso dei virus, il substrato di crescita è rappresentato dalle Colture Cellulari. I virus, essendo parassiti intracellulari obbligati, hanno bisogno di cellule ospiti da infettare e replicarsi. Questo avviene perché nei virus mancano quelle strutture per la sintesi proteica e quindi vanno a sfruttare i sistemi di sintesi delle cellule ospiti infettate. Per la crescita dei virus si possono usare colture di cellule animali. Si distinguono in:

• Colture Primarie: ottenute direttamente da organi di animali (es. rene di scimmia).
• Colture Diploidi: ottenute dal tessuto umano.
• Colture di Linea Cellulare Continua: ottenute da rare mutazioni.

Le Colture Virali vengono utilizzate per la diagnosi di infezioni umane. In questo caso le Colture Cellulari sono scelte in base alle caratteristiche del virus. Ad esempio, per isolare il virus del morbillo si usano cellule di rene umano. La possibilità di riprodurre in laboratorio le condizioni di crescita dei microrganismi ha permesso di studiarne le caratteristiche morfologiche, metaboliche, di virulenza. Si può così comprendere meglio le modalità d’infezione e le relazioni uomo-microrganismo.

Tecniche di analisi di microrganismi

Una volta ottenuta una coltura di microrganismi, è necessario isolare la colonia di interesse per procedere all’identificazione. Quindi si preleva una singola colonia e la si trasferisce su un terreno nutritivo in modo da farla crescere lontano da ogni tipo di organismo. Per ottenere colonie pure si usano due tecniche:

• Metodo della Semina in Piastra: consiste nello strisciare la superficie di un terreno agarizzato con una “Ansa da inoculo caricata del materiale” allo scopo di ottenere colonie separate. L’Ansa viene strisciata avanti e indietro. La maggior parte del materiale si deposita con la prima strisciata. Con questa tecnica le cellule microbiche si possono dilatare ottenendo colonie isolate.
• Metodo della Diluizione: prevede l’inoculo di diluizioni del campione di coltura mista direttamente nel terreno agarizzato fusoche viene lasciato solidificare all’interno di piastre sterili (circa 45°C). Le colonie così cresceranno.

Il passo successivo all’isolamento è l’identificazione dei microrganismi attraverso:

• Metodi Fenotipici
• Metodi Molecolari

Metodi fenotipici

Si basano sulla valutazione di alcune caratteristiche quali la:

• Risposta alla colorazione di Gram
• Morfologia Cellulare (es. cocco o bastoncello)
• Presenza di Attività Catalasica
• Crescita a diverse Temperature
• Tipo di Metabolismo
• pH
• Concentrazione salina

Con i risultati di queste prove è possibile ottenere delle informazioni preliminari necessarie a determinare l’identificazione della specie di appartenenza. Ci possono essere delle limitazioni come la presenza di “profili biochimici atipici” rispetto ai ceppi di riferimento (cioè per capire, alcuni microrganismi possono sembrare diversi o leggermente diversi dai ceppi di riferimento). Quindi una prima identificazione con i Metodi Fenotipici si basa sulla Reazione alla Colorazione di Gram (per i batteri) e Morfologia Cellulare.

L’osservazione al microscopio prevede l’allestimento di: Preparati a Fresco e/o Coloranti. I Preparati a Fresco si ottengono ponendo una goccia di sospensione microbica su un vetrino portaoggetti, la si copre con un vetrino coprioggetto, evitando la formazione di bolle d’aria. Si osserva il tutto con il “microscopio a contrasto di fase” e con ingrandimento 400x. In questo modo si nota il tipo di movimento delle cellule (in quanto vive) e si comprende di conseguenza di che microrganismo si tratta.

L’osservazione con Preparati a Fresco permette anche di distinguere la dimensione della cellula e l’eventuale presenza nel nucleo. I Coloranti sono usati per l’osservazione dei batteri. Prima di procedere alla colorazione è necessario prelevare una piccola quantità della coltura in esame e diluirla in una goccia d’acqua posta sul vetrino portaoggetti. La diluizione viene fatta essiccare. I Coloranti possono essere distinti in: Basici, Acidi.

I Coloranti Basici o Cationici colorano le strutture cariche negativamente (es. di coloranti: blu di metilene, cristalvioletto, safranina, ecc.). I Coloranti Acidi o Anionici colorano le strutture cariche positivamente. Per quanto riguarda la Reazione alla Colorazione di Gram, è la tecnica maggiormente usata con i batteri. Al campione si applicano due coloranti (cristalvioletto e poi safranina). Una volta che il vetrino è asciutto, è pronto per essere osservato al “Microscopio Ottico con obiettivo ad Immersione”.

I batteri Gram + hanno un colore viola poiché l’alcool non danneggia la spessa parete cellulare ed il colorante resta proprio lì. I batteri Gram - invece perdono parte del colorante “cristalvioletto” in quanto l’alcool ha danneggiato la parete ma non la “safranina”. Infatti, questi batteri hanno un colore rosso.

Per quanto riguarda la “Morfologia Cellulare” vengono presi in considerazione tali parametri:

• Dimensioni
• Bordo (es. uniforme, sfrangiato, ondulato, ecc.)
• Superficie (es. liscia, spugnosa, ecc.)
• Altezza
• Consistenza

Per quanto riguarda la “Crescita a diverse Temperature”, i microrganismi si possono differenziare in:

• Psicrofili (0-20°C)
• Mesofili (20-40 °C)
• Termofili (> 50°C)

Per quanto riguarda il “Tipo di Metabolismo o caratteristiche metaboliche” sui batteri può essere effettuata un’identificazione grazie a test biochimici. Tra i più utilizzati in laboratorio abbiamo:

• Test della Catalasi (= enzima presente nella maggior parte di microrganismi aerobici)
• Test dell’Ossidasi (= enzima presente nei batteri aerobi)
• Test della Coagulasi (= prodotto principalmente da Batterio: Stafilococco)
• Test dell’Indolo (= prodotto da molte specie batteriche che metabolizzano il Triptofano)
• Test di Fermentazione degli Zuccheri

Metodi molecolari

Si basano sullo studio delle proteine cellulari e del DNA, per permettere un’identificazione più attendibile. Questi metodi sono spesso affiancati ai Metodi Fenotipici.

L’identificazione dei Microrganismi su base molecolare prevede una serie di passaggi che prevedono in ordine:

1. L’Estrazione del DNA: dalle cellule microbiche avviene preparando una sospensione di cellule microbiche in Acqua Sterile che viene portata ad una T di 95°C (per alterare la struttura della membrana plasmatica) e successivamente a 0°C così da provocare uno shock termico che lisa le cellule. In questo modo il contenuto cellulare viene riversato all’esterno e il DNA viene separato dalle altre componenti cellulari mediante centrifugazione.
2. L’Amplificazione: consiste nel produrre molte copie della sequenza di DNA che ci interessa attraverso la PCR. Durante tale reazione sono usati Oligonucleotidi sintetici (di circa 20 basi) chiamati Primer che servono da innesco per amplificare il segmento di DNA che ci interessa.
3. L’Ibridazione: la sequenza nucleotidica d’interesse è evidenziata mediante il processo di Ibridazione che si basa sull’associazione di una Sonda Marcata con la “Sequenza Complementare del Genoma”. La tecnica più usata è il Southern Blot. Con questa viene applicato alle molecole un campo elettrico all’interno di un gel. Le molecole migrano in base alla loro dimensione. Dopo la separazione, le sequenze di DNA vengono trasferite su una membrana così da evidenziare la sequenza d’interesse.
4. Le tecniche di biologia molecolare: in generale, possono essere utilizzate anche per confrontare segmenti di DNA di provenienza differente. Si riesce a determinare se appartengono allo stesso individuo (come in indagini giudiziarie) o se l’uno deriva dall’altro (come accade nei test di paternità).
5. Identificare la specie del microrganismo: molte tecniche di biologia molecolare, compreso e soprattutto la Southern Blot, possono essere utili usando delle “Sonde Specie-Specifiche”. Le tecniche di biologia molecolare nell’ambito clinico hanno permesso di ottimizzare la diagnostica di laboratorio riducendo i tempi di risposta e permettendo una migliore terapia delle patologie ed anche un’evoluzione in altri campi della scienza.

Antibiogramma

È un esame di laboratorio (in vitro) che permette di valutare la sensibilità di un microrganismo ai Chemioantibiotici. L’analisi in contemporanea di più antibiotici permette di selezionare quelli che hanno un effetto inibente sul microrganismo rispetto a quelli che non hanno alcun effetto. La sensibilità agli Antibiotici può essere misurata attraverso due metodi:

• Metodi per Diluizione in terreno Liquido
• Metodo per Diffusione in Terreno Solido

Il Metodo per Diluizione in Terreno Liquido prevede una serie di diluizioni. Ognuna di queste viene esaminata con la stessa quantità di una coltura del microrganismo in esame ed incubata per 18-24 ore. Al termine del periodo d’incubazione, alcune provette saranno torbide (= opache, scure) per la crescita microbica mentre altre saranno limpide per l’azione inibente del farmaco. La Minima Concentrazione Inibente (MCI) è la concentrazione minima o più bassa che causa un’assenza di crescita microbica. La MCI rappresenta però la minima concentrazione batteriostatica e non quella battericida (ricorda!).

Una volta calcolata la MCI, è possibile anche definire la Minima Concentrazione Battericida (MCB), cioè la concentrazione più bassa del farmaco in grado di determinare la morte del microrganismo in questione. Per determinare la MCB si opera allestendo delle subculture in “terreno agarizzato specifico” partendo dalle provette che presentano terreno limpido (e quindi assenza di crescita) utilizzato in precedenza per valutare la MCI.

Dopo 24 ore di inoculazione, si osserva nelle subcolture la formazione di colonie in numero sempre più decrescente in relazione all’aumento della concentrazione antibiotica. La prima concentrazione che mostra assenza di colonie determina la MCB. La MCB può essere uguale o maggiore di MCI.

Il Metodo per Diffusione in Terreno Solido (o di Kirby) consiste nel seminare in modo omogeneo una sospensione del microrganismo da saggiare in piastre contenenti appunto terreno agarizzato. Successivamente si dispongono sulle superficie del terreno dei dischetti contenenti differenti antibiotici.