Esame di Stato 3° Prova

Metodologie di biologia molecolare

DNA è una metodologia usata in biologia molecolare per rilevare la presenza di specifiche sequenze di interesse in una miscela complessa.

NORTHERN BLOT è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'mRNA purificato da un campione, in particolare per studiare l'espressione genica. Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, che è la tecnica analoga per il DNA da cui il Northern blot prende il nome, con la differenza sostanziale che l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione. L'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte temperature).

ELISA o Enzyme Linked Immunosorbant Assay è una tecnica alternativa che ha avuto una maggior applicazione nella diagnostica di Laboratorio. Essa consiste in un immunodosaggio eterogeneo, in cui un anticorpo o un antigene sono immobilizzati ad una fase solida (micropiastra). Attualmente è utilizzato soprattutto in sierologia infettiva ed.

autoimmunità. Presenta una sensibilità notevole per il fatto che una sola molecola di enzima può reagire con un elevato numero di molecole di substrato, determinando, anche in presenza di titoli anticorpali modesti, una reazione colorimetrica amplificata.

PURIFICAZIONE ed ESTRAZIONE delle PROTEINE

Le Proteine sono tra le molecole biologiche maggiormente studiate. Per studiare la struttura e la funzione di una determinata proteina è necessario isolarla da una miscela estremamente complessa. Si deve ricavare una quantità sufficiente da permettere la sua analisi, allo stesso tempo durante i vari processi di purificazione non deve perdere la sua struttura e quindi la sua funzione.

Sono previste diverse fasi per l'estrazione: Omogeneizzazione, Centrifuga Differenziale.

L'OMOGENEIZZAZIONE è la e comporta la rottura delle cellule. La strategia più semplice per iniziare ad operare con le proteine è quello di frantumare il tessuto in

un“tampone appropriato”. Così le cellule rotte rilasciano le proteine solubili. Però rilasciano anche Organelli Cellulari (es. mitocondri, reticolo endoplasmatico, ecc.). Una metodica più delicata consiste nell’uso dell’Omogeneizzatore Potter-Elvejhem (= una specie di provetta con pareti spesse e al suo interno uno stantuffo che va a comprimere l’insieme di cellule lasciando intatti molti Organelli). l’Omogeneizzazione. La CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE è la ed avviene dopo II Successivamente si centrifuga il Supernatante a 100.000 g e consente la precipitazione della frazione microsomiale. Se la proteina d’interessa è solubile, si raccoglie il Supernatante di quest’ultima centrifugazione. La procedura definita SALTING OUT avviene dopo la Centrifugazione Differenziale. Le proteine ora sono sottoposte ad una Purificazione grossolana utilizzando i reagenti: Solfato di Ammonio. La Purificazione avviene in base alla

attraverso cui si fa passare la Fase Mobile o Liquida. Durante questo processo la Fase Mobile (= soluzione contenente le molecole da separare) viene fatta passare sulla Fase Stazionaria (= la Matrice). I componenti del campione interagiscono con la Fase Stazionaria in modo diverso. Alcuni in modo abbastanza forte e sono quindi trasportati dalla Fase Mobile più lentamente. Altri invece meno forte con la Fase Stazionaria e quindi trasportati più velocemente. Sono distinti in diversi tipi di Cromatografia:

• Cromatografia su Colonna
• Cromatografia per Esclusione Molecolare
• Cromatografia di Affinità
• Cromatografia a Scambio Ionico
• Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione

CROMATOGRAFIA su COLONNA è molto usata per la Purificazione e Caratterizzazione delle proteine. Il materiale che costituisce la Fase Stazionaria è "impaccato" in un tubo di vetro o plastica (appunto colonna). Il campione da separare viene stratificato sulla sommità della

colonna e la Fase Mobile detta: Eluente ecosì i singoli componenti migrano attraverso la colonna ma in base alla loro capacità di interagire con la Fase Stazionaria. Alla fine l'intero campione fuoriesce dalla colonna. CROMATOGRAFIA per ESCLUSIONE MOLECOLARE è detta anche Filtrazione su gel. È una Cromatografia su Colonna. Questa va a separare le molecole e proteine in base alle dimensioni ed al diverso peso molecolare. La Fase Stazionaria è appunto formata da Polimeri che hanno le proprietà di veri e propri gel (per questa tecnica è detta anche Filtrazione su Gel). Ci sono 2 polimeri che possono essere utilizzati: - Agarosio - Poliacrilammide La struttura di tali polimeri prevede numerosi legami crociati che generano pori. Le molecole più piccole riescono ad attraversare tali pori. Ogni tipo di gel usato ha un limite di esclusione ovvero la grandezza massima di una proteina per entrare nei pori. Tutte quelle più grandi.non sono in grado di passare.
Cromatografia per Esclusione Molecolare è quindi utile a separare le molecole in base alla dimensione.
È molto utile per le molecole / proteine che sono stabili. Solo ad un determinato pH o ad una determinata concentrazioni di Sali.
CROMATOGRAFIA di AFFINITÀ è una Cromatografia su Colonna.
Questa sfrutta la specificità del legame tipica delle proteine.
Il polimero si lega in maniera covalente al Ligando.
In una miscela di proteine, solo una si legherà al Ligando, questa è chiamata Substrato.
Le altre proteine quindi non si legano al polimero e quindi sono facilmente eluite (= portate in soluzione).
Ora la proteina d'interesse è eluita aggiungendo una soluzione salina a concentrazione elevata o aggiungendo una soluzione contenente Ligando libero.
La Cromatografia di Affinità è un metodo di separazione molto conveniente perché consente di ottenere proteine pure.
È chiaro che il

legame tra la proteina ed il Ligando non deve essere troppo forte, altrimenti non è possibile recuperare la proteina al termine di tutto il processo. Per indebolire o eliminare del tutto l'affinità la proteina-Ligando, può essere utilizzata una molecola /IIproteina con affinità maggiore per tale Ligando. Le tipiche interazioni biologiche usate nella Cromatografia di Affinità sono quelle tra: Enzimi-Substrati, Anticorpi-Antigeni, ecc.

CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO è simile alla Cromatografia di Affinità perché entrambe usano delle sostanze per legare le proteine di interesse. La Cromatografia a Scambio Ionico si basa sul principio di attrazione tra ioni di carica opposta, cioè tra le cariche delle molecole presenti nel campione e quelle immobilizzate sulla matrice. In questa Cromatografia l'interazione è meno specifica e si basa sulla carica netta. Come nella normale cromatografia si ha una colonna cromatografica.

impaccata o avvolta con un speciale tipo di resina in grado di scambiare ioni. Nella Cromatografia a Scambio Cationico, gli ioni carichi positivamente si legano a una Resina carica negativamente. Nella Cromatografia a Scambio Anionico avviene l'inverso. Una Resina può essere: - Scambiatrice di Cationi con carica negativa - Scambiatrice di Anioni con carica positiva La miscela di proteine viene caricata sulla colonna. Sulla Resina a Scambio Ionico si legano i Controioni. + + -> Una Resina Scambiatrice di Cationi Na o K - -> Una Resina Scambiatrice di Anioni Cl Le proteine che non hanno "carica netta" o hanno la stessa carica dello scambiatore non si legano alla Resina e vengono subito eluite passando attraverso la colonna. + + - Le restanti invece si legano alla Resina spostando gli Ioni (Na o K, Cl) CROMATOGRAFIA LIQUIDA ad ALTA PRESTAZIONE è un tipo di Cromatografia Liquida che rappresenta l'evoluzione strumentale dellaCromatografia in fase liquida su Colonna classica. Si tratta di una tecnica cromatografica che permette di separare due o più composti presenti in un solvente sfruttando l'equilibrio di affinità tra una "Fase Stazionaria" posta all'interno della colonna cromatografica e una "Fase Mobile" che fluisce attraverso essa. Una sostanza più affine alla Fase Stazionaria rispetto alla Fase Mobile impiega un tempo maggiore a percorrere la colonna cromatografica rispetto ad una sostanza con bassa affinità per la fase stazionaria ed alta per la fase mobile. Il campione da analizzare è iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove è "spinto" attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile. Per ottenere un'elevata efficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte. Alla fine della colonna è applicato un rilevatore ed un calcolatore chepermettono un'analisi in continuo dell'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostanze iniettate.

Vantaggi:

• dimensione ridotta della colonna
• velocità di eluizione (passaggio della fase mobile attraverso la colonna) costante e regolabile
• velocità di esecuzione ridotta

Svantaggio:

• costo più elevato rispetto a Cromatografia su Colonna tradizionale

ELETTROFORESI

Tecnica molto utilizzata in biologia molecolare e chimica biologica.

Viene utilizzata per analizzare e separare: Proteine e Acidi Nucleici.

Permette di dare un'idea di quante siano le specie molecolari presenti nel campione che si sta analizzando.

L'apparato elettroforetico si compone di: Generatore, Cella elettroforetica.

Il Generatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi che sono colle