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(trasduzione del segnale), in quanto solo questo segnale esterno è in grado di far cambiare conformazione alla

proteina.

- Riconoscimento tra cellule La proteina presente su una cellula riconosce attraverso determinati meccanismi la

proteina che sta sulla cellula adiacente. Il riconoscimento cellula-cellula è estremamente importante per vari

processi.

- Adesione intracellulare L’adesione e l’ancoraggio tra cellule, che implicano che prima ci sia stato un

riconoscimento, sono molto importanti soprattutto nella costruzione di tessuti.

- Adesione al citoscheletro e alla matrice extracellulare Una proteina può avere l’esigenza di riconoscere molecole

che stanno nell’ambiente esterno, cioè nella matrice extracellulare, quindi presenta una porzione che riconosce una

proteina che sta nella matrice extracellulare e serve a mediare l’interazione fra una cellula e l’ambiente esterno.

Questa proteina che sta nella matrice ha anche corte interazioni con delle proteine più semplici, che sono legate a

corte catene oligosaccaridiche, quindi a zuccheri, e il tutto media l’interazione tra ambiente cellulare e ambiente

extracellulare grazie alla proteina transmembrana.

Il glicocalice

Il glicocalice è, per definizione, la componente oligosaccaridica che si lega alle proteine (principalmente), ai glicolipidi o

ai fosfolipidi, e costituisce quello che viene definito il rivestimento extracellulare per eccellenza. Queste componenti

oligosaccaridiche possono caratterizzare sia le proteine transmembrana che le proteine periferiche di membrana. Le

glicoproteine assorbite vanno sempre a costituire la membrana plasmatica, non hanno nessun contatto con le

componenti fosfolipidiche della membrana plasmatica, ma hanno 2 proteine transmembrana che creano dei punti di

ancoraggio. Tutte le componenti (glicoproteine transmembrana, glicoproteine assorbite, proteoglicani transmembrana…)

che costituiscono una membrana plasmatica o una membrana cellulare sono quindi molto diverse tra di loro, non solo

nella loro funzione per riconoscere specifici domini, ma anche nella loro localizzazione. La sintesi di tutte queste proteine

avviene nel reticolo endoplasmatico ruvido, dal quale si stacca una vescicola che va al Golgi, passa attraverso le cisterne

e si forma la vescicola risultante che porta le proteine. La vescicola che porta questa proteina ha nel suo lume la

proteina che dev’essere esportata, ha quindi già inserito nel suo doppio strato fosfolipidico la proteina, perché nel

momento in cui la vescicola si trova in prossimità della membrana plasmatica e si fonde con la membrana stessa, la

membrana della vescicola entra a far parte della membrana plasmatica.

Gli oligosaccaridi

Si possono trovare sempre e solo sulla superficie del monostrato volto verso l’esterno. Il corredo oligosaccaridico è

diverso a seconda del tipo cellulare, in quanto gli oligosaccaridi sono dei veri e propri marker di identificazione, perché la

cellula nella sua componente glicoproteica andrà a scegliere a livello del Golgi delle componenti oligosaccaridiche

specifiche da legare a livello di una determinata proteina. L’insieme di questi oligosaccaridi va a costituire il glicocalice ed

esso sembra estremamente importante perché interviene nelle risposte infiammatorie, sembra mediare le risposte

infiammatorie in modo tale che l’organismo possa difendersi in caso di organismi indesiderati che invadono i tessuti.

Le proteine associate a una membrana plasmatica possono quindi essere associate anche a delle corte catene

oligosaccaridiche, che permettono di formare delle glicoproteine, e andare a costituire il glicocalice. Quindi la membrana

plasmatica è principalmente costituita da fosfolipidi in cui sono inserite altre molecole, e come i fosfolipidi devono essere

regolati per costituire la componente lipidica della membrana plasmatica, così lo devono essere anche le proteine, che

non sono per nulla immobili, ma hanno un grado di libertà perché le membrane cellulari non sono delle strutture rigide,

ma devono garantirsi un certo grado di mobilità per poter funzionare in modo corretto e per poter rispondere a tutte le

esigenze fisiologiche che l’organismo richiede.

La mobilità delle proteine di membrana

Tutte le informazioni riguardo alle proteine di membrana, delle quali oggi siamo a conoscenza, derivano da esperimenti

che sono stati condotti inerenti ad esse.

Un primo esperimento, a partire da cellule in coltura, è stato condotto su 2 cellule molto diverse tra loro (esempio cellule

di topo e cellula umana). Si sono marcate tutte le proteine transmembrana della cellula di topo con un monocromo, che

emetteva un segnale rosso ogni volta che l’operatore andava ad osservare quella cellula al microscopio e fluorescenza;

mentre le proteine di membrana della cellula umana sono state marcate con un fluorocromo che emetteva nel verde.

Quindi si avevano 2 segnali completamente diversi, e affinché si potesse effettuare questa marcatura, le 2 sonde

fluorescenti dovevano essere legate a degli anticorpi. Le cellule sono quindi state tenute in coltura in ambienti separati,

poi marcate e immesse nel medesimo ambiente di coltura, con opportune molecole di nutrimento per mantenerle vitali e

trattate in modo tale che fosse favorita la loro fusione. Dopo un certo intervallo di tempo le cellule si sono unite tra di

loro e dopo la fusione, dovuta alla fusione delle membrane plasmatiche delle due cellule, si è osservato che una parte

della cellula risultante presentava le proteine del topo, mentre l’altra parte presentava delle proteine provenienti dalla

cellula umana. Dopo circa 40 minuti non era più possibile demarcare una zona contenente proteine provenienti solo dalla

cellula del topo né una regione caratterizzata solo da proteine provenienti dalla cellula umana. Risultato di questo

esperimento è che in un determinato intervallo di tempo le proteine si sono mescolate tra di loro; questo ha fatto capire

che le proteine non sono per nulla immobili all’interno del doppio strato fosfolipidico (altrimenti con il passare del tempo

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ci si sarebbe trovati in una situazione con 2 regioni “separate”, una caratterizzata dalle proteine del topo, l’altra dalle

proteine umane).

Un altro esperimento ha permesso di confermare che le proteine non sono immobili nella membrana cellulare. Nel primo

esperimento si era fatto un lavoro di marcatura, e questo criterio viene sfruttato anche in questo caso, ma con una

tecnica molto particolare: Recovery Fluorescence After Photobleaching (FRAP, recupero di una fluorescenza dopo uno

sbiadimento). In una cellula di partenza sono state marcate le proteine adese alla membrana plasmatica, la marcatura è

uniforme, quindi le proteine a livello della membrana cellulare sono abbondanti. Successivamente al microscopio ottico,

guardando l’immagine della cellula che emetteva fluorescenza, è stato acceso un “laser”, orientato in modo ben preciso,

che permetteva di sbiadire solo una piccola area che in precedenza era fluorescente, e dopo poco tempo quest’area è

risultata completamente sbiancata. La cellula in questa situazione è stata quindi messa in coltura nelle condizioni

richieste per mantenerla vitale, riprendendola dopo un certo intervallo di tempo, e riosservandola al microscopio, si è

visto che nell’area che precedentemente era stata sbiancata era tornato un segnale fluorescente: non erano le proteine

che erano state sbiancate ad aver recuperato il segnale, ma erano delle nuove proteine che sono arrivate in questa

regione. Quindi in un breve intervallo di tempo alcune proteine che erano confinate nella regione circostante sono

arrivate nell’area che era stata sbiancata, questa è un’ulteriore riprova della mobilità delle proteine.

Quindi le proteine integrali si muovono a livello della membrana fosfolipidica, che sia la membrana plasmatica o una

qualsiasi membrana cellulare, ma si muovono lentamente, in quanto le proteine sono ingombranti e attraversano tutto il

doppio strato fosfolipidico, e per rimanere nel doppio strato attuano delle interazioni con le code idrofobiche; inoltre

questo movimento è controllato sia dall’ambiente esterno che, soprattutto, dall’ambiente interno. Perciò le proteine

integrali non sono totalmente libere di muoversi, in quanto non sono loro a decidere dove andare; inoltre possono

muoversi dal 30 al 70% delle proteine integrali, mentre la restante parte deve rimanere confinata nel punto ben preciso

a cui è destinata (alla regola generale ci possono essere comunque delle eccezioni). Le proteine integrali che non

possono muoversi sono quelle che devono garantire un dominio di membrana: se, per esempio, in un determinato punto

la membrana plasmatica deve mediare un’adesione con una cellula adiacente, le proteine coinvolte non possono

muoversi a caso, ma devono essere mantenute in sito per poter mediare l’adesione cellulare, altrimenti verrebbe a

mancare questa importante specializzazione della membrana plasmatica.

Chi regola la loro posizione o il loro movimento? Il citoscheletro gioca un ruolo veramente importante non solo nel

definire la struttura di una cellula e nel regolare la posizione delle proteine nel doppio strato fosfolipidico, ma serve

anche a permettere una comunicazione cellula-cellula (per esempio a livello delle giunzioni GAP) o un’adesione cellula-

cellula. Quindi il citoscheletro è una componente estremamente importante perché le proteine integrali di membrana

presentano sempre un dominio extracellulare e un dominio citoplasmatico ed è solo il dominio citoplasmatico che sa

interagire, mediare i legami, con la componente citoscheletrica, quindi è importante che la cellula sappia orientare nella

propria membrana la proteina integrale con la corretta disposizione. Il dominio extracellulare, a sua volta, è l’unica

regione della proteina specializzata per interagire con questo ambiente. Se si va ad alterare geneticamente queste

proteine, oppure se si va ad alterare geneticamente il citoscheletro che ancora le proteine, si ottiene un’alterazione a

livello della membrana plasmatica. I risultati sperimentali ottenuti hanno quindi suggerito che sul lato citoplasmatico la

barriera nel limitare e controllare i movimenti delle proteine è il citoscheletro, mentre sul lato extracellulare sono le

componenti (generalmente) proteiche della matrice. Questo fa capire che le cellule sono sì delle entità singole, ma

devono essere capaci di interagire con l’ambiente esterno.

Tutte le informazioni che abbiamo sulla membrana plasmatica sono derivate da studi condotti su porzioni di membrane

di globuli rossi perché non è difficile ottenere dei globuli rossi e il sangue è l’unico esempio di tessuto connettivo molto

particolare in quanto ha un’abbondante matrice fluida all’interno della quale c’è una grande quantità di cellule circolanti.

Le preparazioni di frammenti di membrane di globuli rossi sono state chiamate “GHOST” e sono state ottenute

prendendo dei globuli rossi e mettendoli in una soluzione ipotonica (il liquido in cui vengono messi è povero di ioni, ad

esempio l’acqua distillata) in modo che essi andassero incontro a lisi (=rottura). Mettendo i globuli rossi in una soluzione

ipotonica accade che la concentrazione di ioni è maggiore all’interno delle cellule che all’esterno, quindi le cellule

continuano a richiamare acqua nel tentativo di diminuire questa concentrazione di sali, ma nel giro di poco tempo, se

non si ripristina una condizione di isotonia, le cellule scoppiano. Questo approccio permette di ottenere dei frammenti di

membrane o di proteine e di studiarle dal punto di vista biochimico, ma non è in grado di identificare la localizzazione

delle proteine.

Si è utilizzata quindi un’altra tecnica, molto raffinata, per completare lo studio di una membrana plasmatica andando a

verificare le localizzazioni delle varie componenti,

questa tecnica è chiamata Freeze-Fracture. La

membrana plasmatica deve essere congelata e

successivamente, con un opportuno strumento

molto raffinato, si crea una frattura a livello dei 2

monostrati dei fosfolipidi, che porta alla loro

divisione; alcune proteine transmembrana

rimangono legate al monostrato interno, altre

invece al monostrato esterno. Queste porzioni

vengono poi opportunamente contrastate con

materiali elettrondensi e ogni frammento viene osservato al microscopio elettronico a trasmissione. Questi studi hanno

permesso anche di identificare e di discriminare il monostrato esterno da quello interno grazie alla presenza delle catene

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oligosaccaridiche, che si trovano solo sul monostrato esterno. Perciò studi di biochimica e studi di morfologia hanno

permesso di identificare e caratterizzare le proteine di una membrana plasmatica.

Bisogna fare attenzione nell’utilizzare i termini dominio di membrana e polarità cellulare. La polarità potrebbe essere

riferita ad un filamento di actina o a un microtubulo, ovvero a delle strutture, ma la polarità cellulare è diversa.

La maggior parte delle membrane mostra una variabilità in termini di fosfolipidi, nella componente proteica, e nella

mobilità di fosfolipidi e proteine. Occorre quindi associare i concetti di dominio e di polarità a degli esempi specifici.

In una cellula dell’epitelio intestinale (enterocita) è possibile osservare una polarità in termini di porzione apicale

morfologicamente diversa dalla porzione basale e dalla porzione laterale e una polarità in termini di specifiche proteine

localizzate sulla membrana della porzione apicale che non sono per nulla identiche a quelle localizzate sulla porzione

laterale, né a quelle localizzate sulla porzione basale, quindi la regione vaso-laterale ha un corredo proteico diverso da

quello della regione apicale; questo deve rispecchiare una determinata struttura e una determinata funzione: la

membrana plasmatica della regione laterale deve specializzarsi a creare giunzioni con la cellula adiacente e non ha

nessuna funzione in termini di trasporto di sostanze nutritizie presenti nel lume intestinale, il processo di trasporto è

invece svolto dalle proteine localizzate sulla membrana plasmatica apicale. Queste cellule, messe una vicina all’altra,

costituiscono l’epitelio che riveste l’intestino, qualsiasi epitelio è innervato ma non è vascolarizzato, quindi ha bisogno di

un tessuto connettivo che è localizzato al di sotto dell’epitelio stesso.

Perciò ogni regione della membrana plasmatica deve essere precisamente specializzata.

Se le giunzioni mediano l’adesione cellule-cellule e negli epiteli le cellule sono a mutuo contatto, escludendo la maggior

parte di una matrice cellulare, ci devono essere delle strutture che impediscano alle particelle di intraprendere delle vie

sbagliate, definite vie paracellulari. Nella parte più apicale di ogni epitelio ci sono delle giunzioni definite giunzioni strette

o tight junction, che creano una barriera tale per cui il glucosio non può intraprendere una via paracellulare, ma deve

sfruttare delle proteine transmembrana specifiche per il suo trasporto e quindi arrivare nel centro sottostante.

Recentemente si stanno sviluppano una serie di attività di ricerca nell’ambito della nanotossicologia, in quanto le

nanoparticelle sono molto più reattive nei confronti dei batteri, ma si sta anche scoprendo che esse hanno un’attività

biologica molto marcata verso le cellule umane, quindi se da un lato uccidono i batteri, dall’altro lato possono interferire

con la funzionalità cellulare, e uno dei sospetti è che introducendole con l’alimentazione possano interferire con la

corretta funzionalità delle giunzioni, andando quindi ad interrompere le corrette adesioni cellula-cellula.

L’esempio dell’enterocita, come potrebbe esserlo quello di un neurone è un esempio molto specifico. Lo spermatozoo di

un mammifero è una cellula che viene definita polare, la sua porzione apicale morfologicamente è completamente

diversa dalla sua porzione caudale: nella porzione apicale presenta un nucleo, in quella caudale non presenta nessun

nucleo, ma un lungo flagello che si diparte dalla base del nucleo presente in posizione apicale. È quindi una cellula

altamente specializzata e la sua funzione deriva dai domini di membrana di cui si è dotata durante la fase di

differenziamento. All’inizio del flagello c’è una zona molto ricca di mitocondri, che andranno poi a produrre l’ATP

necessaria per permettere il movimento.

Le proteine hanno un loro ruolo nel definire specifici domini di membrana che corrispondono alla funzionalità della

membrana plasmatica. Anche a livello della componente fosfolipidica è possibile identificare un lato citosolico (a contatto

con il citoplasma della cellula) e un lato esoplasmatico (al di fuori del citoplasma, è il lato a contatto con l’esterno). I 2

strati lipidici possono differire tra di loro per: composizione in fosfolipidi, orientamento spaziale di ciascuna proteina

(dominio extracellulare e dominio citoplasmatico oltre al dominio centrale che prende contatto con le code idrofobiche),

carboidrati che sono localizzati solo sulla regione esterna della proteina transmembrana.

Da dove derivano le membrane plasmatiche e le membrane cellulari in generale? Le “nuove” membrane derivano da

membrane pre-esistenti. Una specifica membrana plasmatica accoglie fosfolipidi e proteine secondo un disegno ben

preciso, perciò ci sono membrane pre-esistenti e il loro accrescimento è dovuto all’inserimento di nuovi fosfolipidi e di

nuove proteine che vengono sintetizzati e localizzati nella matrice fluida del doppio strato.

Riassumendo…

Una membrana plasmatica è dotata di una componente fosfolipidica e di una proteica. Per definizione è un involucro

semi-permeabile e quindi lascia passare del materiale per semplice diffusione (pochissime molecole), mentre tutto il

resto ha bisogno di proteine trasportatrici localizzate a livello di questa struttura (es. Proteine transmembrana). La cellula

controlla quindi ciò che deve entrare e ciò che deve uscire: gli ioni non passano liberamente, ma hanno bisogno delle

proteine canale. Altre proteine sono localizzate a livello della membrana plasmatica e recepiscono segnali esterni. È

quindi presente un sistema endomembranoso che compartimentalizza tutta la membrana.

Le funzioni della membrana plasmatica

La membrana plasmatica può essere vista come una barriera nei confronti delle molecole indesiderate e come un filtro

selettivo per le molecole di cui la cellula ha bisogno, ma che possono passare solo dopo un attento controllo.

Il trasporto, attraverso la membrana plasmatica, è una caratteristica che tutte le cellule devono avere. Ogni tipologia

cellulare deve avere una peculiarità nel corredo proteico e fosfolipidico che garantisca questa funzione di trasporto. A

livello delle cellule il trasporto è stato specializzato in modo da garantirsi la capacità di accumulare nel citoplasma

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molecole o sostanze a concentrazione molto diversa rispetto all’ambiente esterno: ciò significa accumulare contro

gradiente, importare all’interno del citoplasma una grande quantità di molecole rispetto all’ambiente esterno spendendo

energia. La cellula ha risolto questo problema localizzando specifiche proteine transmembrana che sanno sfruttare

energia. A questo proposito si può portare come esempio la proteina che trasporta le molecole di glucosio: quando c’è

tanto glucosio all’interno dello spazio intestinale questa proteina comincia a trasportarlo nel lume della cellula, e continua

il trasporto contro gradiente. Le proteine devono quindi essere specializzate nel trasporto di zuccheri o di amminoacidi e

+

nel regolare la concentrazione ionica intracellulare, garantire un’adeguata concentrazione di ioni H per mantenere

+ + 2+

costante il pH intracellulare, oppure regolare la concentrazione di ioni Na , K o Ca tra ambiente interno ed esterno.

2+

Facendo l’esempio del Ca (che per quanto riguarda l’ambiente intracellulare è forse l’unico significativo): non rimane

libero nel citosol, ma viene accumulato in un sistema endomembranoso, nel reticolo endoplasmatico liscio (una delle sue

funzioni è accumulare calcio), e viene accumulato contro gradiente rispetto all’ambiente citosolico, perciò ci saranno

specifici meccanismi che permettono questo accumulo. Poi, al momento opportuno, le proteine canale che permettono

l’accumulo del calcio si aprono e permettono i rilascio; questo è un modo che permette alla cellula di accumulare delle

sostanze di cui ha bisogno e di rilasciarle al momento opportuno.

Ogni categoria di proteine svolge un ruolo estremamente importante; ognuno di questi processi è finemente regolato e

se nella sequenza di eventi che regolano un processo qualcosa non funziona la determinata funzionalità di un particolare

meccanismo viene persa, quindi la cellula potrebbe risentirne.

La membrana, plasmatica (che è quella più esterna) o di una struttura interna, deve garantire il trasporto. Se tutte le

membrane fossero costituite solo da fosfolipidi entrerebbero ben poche molecole e altrettanto ne uscirebbero ben poche,

ma con la presenza delle proteine la cellula può garantire il trasporto. Una membrana fatta solo da fosfolipidi lascia

permeare piccole molecole apolari (ormoni steroidei, che sono delle molecole segnale) e piccole molecole polari

(soprattutto acqua, ma anche O , CO , glicerolo e gas respiratori) grazie a un meccanismo di diffusione semplice, mentre

2 2

impedisce l’ingresso di grosse molecole polari e ioni. Ma la cellula deve poter trasportare ioni e sostanze nutritizie, ecco

perché all’interno di essa sono presenti le proteine, in particolare le proteine transmembrana.

Il concetto di osmosi (Riferimento all’immagine) Nel primo caso l’ambiente è

isotonico, il globulo rosso mantiene la propria morfologia e la

propria funzionalità. All’interno della soluzione in cui è posto il

globulo rosso ci sono delle piccole sfere, che identificano delle

molecole, le stesse molecole presenti all’interno della cellula:

questo fa capire che c’è un equilibrio isotonico tra citoplasma e

liquido esterno. La situazione e la morfologia della cellula

cambia se si varia la concentrazione di sali all’interno della

soluzione. Nel secondo caso l’eritrocita perde la sua morfologia,

si raggrinzisce perché perde liquidi, in quanto la concentrazione

di sali all’esterno è molto più marcata rispetto a quella del

citoplasma, quindi l’ambiente esterno richiama liquidi

dall’ambiente interno; la cellula perde questi fluidi importanti e se la situazione non viene ripristinata in un ambiente

isotonico la cellula raggrinzisce completamente, perde le sue funzionalità e muore: il concetto di disidratazione è un

mezzo che sottrae acqua all’ambiente citoplasmatico della cellula. Se invece la soluzione in cui si immette la cellula è

ipotonica (terzo caso), quindi le particelle sono molto più concentrate nel citoplasma rispetto all’ambiente extracellulare,

la cellula, avendo al suo interno molti più sali, richiama acqua, ma così facendo dopo qualche tempo andrà incontro a

lisi. Queste situazioni fanno capire che l’acqua passa liberamente attraverso la membrana plasmatica e il passaggio, il

flusso netto dell’acqua, varia notevolmente a seconda della concentrazione di sali esterna rispetto a quella interna.

Le acquaporine

Ma il fenomeno dell’osmosi non è l’unico modo per veicolare acqua dentro e fuori la cellula attraverso la membrana

plasmatica. Nel 1990, un gruppo di ricercatori, Agree e i suoi collaboratori, ha scoperto a livello della membrana

plasmatica la presenza di particolare proteine chiamate acquaporine. Esse sono principalmente accumulate in specifici

tessuti, dove il passaggio dell’acqua deve essere molto più efficiente rispetto ad altri tessuti, ma in linea generale esse

sono presenti a livello delle membrane plasmatiche. Sono proteine transmembrana, sono più permeabili all’acqua e

vanno quindi a sostenere un già efficiente trasporto, che è quello che avviene con la diffusione semplice. Il sospetto che

potesse esserci qualcos’altro oltre alla semplice diffusione era derivato dal fatto che tutte le volte in cui si osservava il

passaggio di acqua in determinati tessuti, la quantità che ne riusciva a passare nell’unità di tempo non era spiegabile con

la semplice diffusione. Di conseguenza i ricercatori hanno iniziato una serie di esperimenti per cercare di scoprire

cos’altro potesse influenzare questi passaggi, e, per caso, hanno scoperto qualcosa che non rappresentava l’obiettivo

iniziale. Essi stavano cercando di caratterizzare le proteine responsabili del fattore rH all’interno degli eritrociti, ma

purificando queste proteine si imbatterono nelle acquaporine. Per dimostrare che questa nuova proteina era coinvolta

nel trasporto di molecole d’acqua hanno preso oociti di anfibio (molto utilizzate per esperimenti perché sono

dimensionalmente facili da studiare) e li hanno ingegnerizzati, ovvero hanno inserito nel loro citoplasma degli RNA

messaggeri per la proteina; inserendo gli RNA messaggeri al loro traduzione portava ad esprimere la proteina a livello

della membrana plasmatica. Successivamente hanno messo queste cellule, con queste proteine a livello della membrana,

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in un mezzo ipotonico: nel giro di pochissimo tempo (rispetto ad un normale oocita messo nello stesso mezzo ipotonico)

questi oociti ingegnerizzati andarono incontro a lisi, le cellule si gonfiarono fino a scoppiare, mentre i normali oociti ci

mettevano molto di più. Questo confermò che le proteine scoperte erano preposte al trasporto di acqua. Sono quindi

proteine integrali e lasciano passare miliardi di molecole d’acqua al secondo.

Un sistema di questo tipo è molto efficiente a livello di determinati organi dove è importante recuperare acqua: noi

viviamo in un ambiente aereo, quindi a livello del nostro apparato escretore o del nostro apparato digerente c’è

l’esigenza di recuperare acqua per non andare incontro a disidratazione. Quindi queste proteine sono presenti nella

membrana plasmatica, e concentrate in maggior quantità a livello di specifici epiteli.

I tipi di trasporto

Le proteine possono presentare una diversa conformazione, e la conformazione proteica è sfruttata per il riconoscimento

delle molecole che devono essere portate all’interno della cellula. Si possono descrivere essenzialmente 2 tipi di

trasporto: trasporto passivo, senza consumo di energia, e trasporto attivo, con consumo di energia.

(Riferimento all’immagine) Il lato esterno della

cellula deve comunicare con il lato interno della

cellula, attraverso il doppio strato fosfolipidico. Le

varie molecole hanno morfologie e funzioni diverse e

quindi modalità diverse per essere trasportate.

Una molecola piccola e priva di carica diffonde

attraverso la membrana plasmatica (es. CO , O ),

2 2

con un processo di diffusione semplice. Molecole

con un certo ingombro o una certa carica, invece,

non possono essere trasportate mediante diffusione

semplice, ma devono essere incluse in un trasporto

mediato da proteine transmembrana.

Nell’esempio di trasporto passivo possono esserci 2 modalità. 1) Proteina canale specializzata nel trasporto di molecole

con carica (esempio ioni). Le proteine canale sono delle proteine transmembrana che all’interno creano una sorta di

“manicotto” attraverso il quale passano gli ioni. Il passaggio però, anche in questo caso, è selettivo: se un canale è per il

sodio non vale per il potassio o per il cloro e viceversa. 2) Proteina che media il trasporto di una molecola un po’ più

grossa, ha una conformazione che può essere aperta versa l’esterno e quindi alloggiare 2 molecole in 2 siti ben precisi.

Nel momento in cui i 2 siti sono stati saturati la proteina si chiude verso l’esterno e si apre verso l’interno rilasciando le 2

molecole legate.

Nell’esempio di trasporto attivo si tratta sempre di una proteina transmembrana, ma che deve veicolare non una

molecola localizzata all’esterno, ma lega e trasporta una molecola dall’interno verso l’esterno. La proteina trasportatrice

avrà 2 siti specifici che riconoscono e legano questa particolare molecola, però occorre consumo di energia: la molecola

si lega alla proteina trasportatrice e nel momento in cui i 2 siti sono stati saturati e l’energia viene consumata, la proteina

si chiude e si apre verso l’esterno liberando le molecole che si era caricata.

Nell’esempio di trasporto attivo c’è bisogno di energia per attuare il trasporto, mentre negli esempi di trasporto passivo

no perché bisogna prendere in considerazione la concentrazione di ioni e molecole dell’ambiente interno e di quello

esterno e tenere presente il gradiente di concentrazione. Il gradiente funge da energia per veicolare le molecole che

devono essere trasportate.

Il gradiente chimico però non basta, una sostanza più concentrata all’interno piuttosto che all’esterno non è sufficiente

per regolare questo flusso controllato. Infatti, tutte le membrane hanno un potenziale, che viene definito potenziale di

membrana, ad eccezione delle cellule che sono eccitabili, per esempio le cellule nervose, per le quali si parla di

potenziale di riposo. Questo diverso potenziale di membrana è garantito da una diversa concentrazione di ioni, tale

per cui l’esterno della membrana plasmatica ha un eccesso di ioni positivi e il versante interno è dotato di un eccesso di

ioni negati, e questa situazione viene mantenuta costante. Si può poi instaurare un voltaggio, o differenza di potenziale

di membrana, per le cellule eccitabili (neuroni, cellule nervose, cellule muscolari): in questo caso, nel momento in cui

viene invertito il potenziale di membrana (situazione ovviamente transitoria), c’è la trasmissione dell’impulso nervoso,

appena l’impulso è passato viene ripristinato il potenziale di riposo, che tornerà ad essere eccitato nel momento in cui ci

sarà un altro impulso. Per le cellule di tutti gli altri epiteli, che non sono in grado di trasmettere un impulso nervoso, si

parla quindi semplicemente di potenziale di membrana, riferendosi agli ioni esterni e interni.

Si aggiunge quindi un gradiente chimico ad un potenziale elettrico, tale per cui si arriva a definire il gradiente

elettrochimico: il concetto di gradiente elettrochimico serve per spiegare il trasporto non solo delle molecole in

funzione della concentrazione ambiente interno-esterno o viceversa, ma in funzione anche della loro carica; quindi per le

molecole elettricamente cariche e per gli ioni, il trasporto dipende dai 2 concetti di concentrazione e di carica.

(Riferimento all’immagine) Lo spessore della freccia indica quante molecole possono passare. La parte in grigio indica la

membrana plasmatica. Lo schema si riferisce alla facilità con cui una molecola può passare in funzione del gradiente

elettrochimico.

Nell’esempio più semplice si trova un gradiente elettrochimico in assenza di un potenziale di membrana, quindi senza né

cariche positive né cariche negative, che sono state annullate. Queste molecole con carica positiva riescono a passare

attraverso la membrana tramite la loro proteina trasportatrice.

Nell’ultimo esempio si trova la proteina trasportatrice, ma la freccia è molto sottile perché c’è una carica negativa

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all’esterno e una carica positiva all’interno. Le molecole che

devono entrare sono cariche positivamente, perciò il loro

passaggio non è molto facilitato, ma c’è una sorta di repulsione,

un rallentamento nel passaggio delle molecole.

L’esempio centrale, come indica lo spessore della freccia,

identifica un tipo di passaggio molto favorito. All’esterno si trova

una carica positiva e all’interno una carica negativa: aggiungendo

alla concentrazione favorevole del gradiente chimico anche la

carica favorevole, le molecole cariche positivamente vengono

attratte dall’ambiente interno in cui è presente una carica

negativa. Di conseguenza, tra i 3 esempi, questo è il passaggio

maggiormente favorito (in queste specifiche condizioni).

Quindi se al concetto di gradiente chimico si aggiunge anche la

carica delle molecole, l’ambiente esterno e quello interno,

sfruttando la carica della molecola che dev’essere trasportata, può facilitare o meno questo processo.

Il trasporto passivo può avvenire grazie a proteine canale o a proteine vettrici.

I canali ionici sono proteine canali transmembrana altamente selettive, generalmente ognuna è specifica per ogni tipo

di membrana, ogni proteina transmembrana deve saper riconoscere le varie componenti. La maggior parte dei canali

ionici può avere una conformazione aperta o chiusa, vengono definiti canali a sbarramento e possono essere suddivisi in

3 diverse tipologie:

- Canali a controllo di voltaggio (voltaggio dipendenti)

- Canali a controllo di ligando (ligando dipendenti)

- Canali a controllo meccanico (dipendono da forze meccaniche esercitate sulle proteine)

Un esempio di canale a controllo di voltaggio è il canale ionico batterico per il K+, chiamato KcsA. Esso è costituito da

quattro subunità, ognuna delle quali contiene due eliche transmembrana e una regione del poro, costituita da una corta

elica del poro che da un’ansa non elicoidale che forma il rivestimento interno di un filtro di selettività. Esso contiene un

pentapeptide altamente conservato, in cui gruppi carbonilici costituenti lo scheletro creano cinque anelli successivi di

atomi di O. ognuno di essi contiene quattro atomi di O, i quali possono sostituirsi alle molecole di acqua dell’alone

idratato che sono allontanate nel momento in cui ogni ione K+ entra nel poro. Ci sono quindi quattro poteziali siti di

legame per il K+, il quale però ne occupa solo due in ogni dato momento. Nelle cellule vegetali e animali è invece

presente il canale per il K+ detto Kv (nelle prime giocano un ruolo fondamentale nel bilancio idrico e salino e sono

coinvolti nella regolazione del volume cellulare, nelle seconde hanno una funzione importante in muscoli e nervi). Le

quattro subunità del Kv contengono sei eliche ciascuna, divise in due distinti domini funzionali: dominio del poro

(contiene il filtro di selettività), e il dominio del sensore di voltaggio, o dominio voltaggio-sensibile, formato dalle eliche

S1 e S4, che avverte il voltaggio attraverso la membrana plasmatica. Lo sbarramento è formato dalle estremità interne

delle eliche S6. Il dominio di voltaggio e il dominio del poro sono legati tramite una breve elica di connessione

denominata S4-S5. Il potenziale di riposo negativo mantiene l’elica S4 in una conformazione tale per cui il poro

rimane chiuso, ma un cambiamento di potenziale causa lo spostamento dei residui carichi positivamente dalla porzione

interna a quella esterna della cellula. In questo modo il canale viene aperto e possono passare più di dieci milioni di ioni

potassio al secondo. In realtà dopo pochi millisecondi il canale si arresta automaticamente, a causa di un processo detto

“inattivazione” che consiste nello spostamento di un piccolo peptide di attivazione sull’ imboccatura del poro. Quando in

un secondo momento verrà rilasciato, il poro sarà chiuso. Il motivo per cui attraverso il canale per il K+ non può ad

esempio passare Na+, benché sia più piccolo, è che il K+ idratato interagisce con gli aminoacidi in modo da

liberarsi della molecola di H2O e da poter passare attraverso il canale, mentre l’Na+ non ne è in grado, rimane troppo

grande e non riesce a passare.

Le proteine vettrici sono invece proteine transmembrana che presentano conformazioni alternative, per le quali

rimangono chiuse verso l’ambiente esterno, per poi aprirsi o chiudersi in determinati momenti a livello della membrana

plasmatica per particolari motivi. Hanno un sito specifico, possono legare un certo numero di molecole, e la velocità di

trasporto è determinata dal numero di proteine presenti. Esse sfruttano la

diffusione facilitata, vanno incontro a saturazione quando tutte le proteine

sono impegnate a traslocare molecole, e possono effettuare il passaggio di

molecole organiche idrofile e ioni secondo 2 modalità:

- Trasporto di una sola molecola Viene detto uniporto. Le cellule

ricevono dall’ambiente esterno le molecole e le portano all’interno una

alla volta.

- Trasporto accoppiato Prevede il trasporto di 2 molecole

simultaneamente, per questo viene definito trasporto accoppiato. In

particolare si deve distinguere tra simporto, in cui le 2 molecole

vengono entrambe trasportate all’interno, e antiporto, in cui una

molecola viene trasportata all’interno e una all’esterno.

Le proteine vettrici presentano alcune proprietà: possono legare in modo

esponenziale molecole da trasportare fino ad arrivare ad un plateaux, ovvero una sorta di soglia, che si raggiunge

quando tutte le proteine sono impegnate in un trasporto, ogni proteina vettrice è altamente selettiva e spesso trasporta

20

un solo tipo di molecola che lega in modo specifico, e le proteine vettrici possono essere saturate (quando sono tutte

impegnate nel trasporto).

Il trasporto accoppiato è un esempio di trasporto attivo, in quanto richiede consumo di ATP. Questo tipo di trasporto

deve mantenere la composizione ionica intracellulare e permettere alla cellula di accumulare nutrienti al suo interno,

contro il gradiente di concentrazione. Il trasporto attivo può avvenire con trasporti accoppiati oppure attraverso proteine

pompa, che accoppiano il trasporto contro gradiente all’idrolisi dell’ATP, un esempio delle quali è fornito dalla pompa

+ ± +

sodio-potassio, anche detta ATP-asi Na /K dipendente, la quale è responsabile del largo eccesso di ioni Na

+

all’esterno della cellula e dell’ampio eccesso di ioni K al suo

interno. Le cariche positive portate da questi due cationi sono

bilanciate dalle cariche negative portate da diversi anioni. Gli

ioni Cl- sono presenti a concentrazione maggiore all’esterno

+ +

delle cellule per bilanciare Na , mentre K è bilanciato da

cariche negative portate dalle proteine e dagli acidi nucleici. Il

+ +

rapporto Na :K è di 3:2, quindi per ogni molecola di ATP

idrolizzata, tre ioni sodio sono pompati all’esterno, mentre

due ioni potassio sono pompati all’interno. È una pompa

elettrogenica, ossia contribuisce in modo diretto alla

separazione delle cariche ai due lati della membrana. È

una pompa ionica di tipo P, che sta per fosforilazione, in

quanto l’idrolisi dell’ATP porta al trasferimento del gruppo

fosfato rilasciato ad un residuo di acido aspartico della proteina

di trasporto, provocando un suo cambio conformazionale.

Quando la proteina lega tre ioni Na+ sul versante interno va +

incontro a fosforilazione e cambia forma, questo le fa perdere affinità per l’Na , quindi rilascia i suoi ioni all’esterno,

dove raccoglie due ioni potassio, va incontro a defosforilazione e torna alla forma originaria. La pompa sodio-potassio è

presente solo nelle cellule animali, in quelle vegetali è presente invece una pompa della membrana plasmatica, sempre

+ ±

di tipo P, detta H /K ATP-asi, presente anche nelle cellule dello stomaco, che trasporta ioni H+. le pompe di tipo V,

invece, trasportano attivamente ioni idrogeno attraverso le membrane degli organelli e dei vacuoli citoplasmatici, hanno

il ruolo di mantenere basso il pH di questi compartimenti. Un esempio di simporto è quello del movimento di glucosio

attraverso la membrana plasmatica apicale delle cellule epiteliali, che avviene per co-trasporto di ioni sodio, la cui

+ ±

concentrazione è mantenuta molto bassa grazie ad un sistema di trasporto attivo primario (la Na /K ATP-asi). Il

glucosio sfrutta la tendenza degli ioni sodio a rientrare nella cellula e dunque vi entra contro un gradiente di

concentrazione. Si parla dunque di trasporto attivo secondario e in questo caso la proteina trasportatrice è detta

+

cotrasportatore Na /glucosio e trasporta due ioni sodio ed una molecola di glucosio. Un esempio di antiporto è quello

+ +

dello scambio Na /H attuato dalle cellule per mantenere il pH citoplasmatico e che consiste nel consentire

+ +

l’entrata di ioni Na e l’uscita di H . Le proteine che effettuano l’antiporto vengono dette scambiatori.

Per quanto riguarda si ala funzione di recettore che quella di sostegno della cellula, è importante prendere in

considerazione il glicocalice, ovvero lo strato più esterno della membrana plasmatica. Esso è costituito da carboidrati

legati covalentemente alle proteine o ai lipidi di membrana, protegge la cellula e fornisce punti di ancoraggio ai recettori

per il riconoscimento delle molecole segnale, quindi è fondamentale per la comunicazione e il riconoscimento cellulare.

Inoltre, le proteine fanno aderire le cellule fra loro, per la comunicazione reciproca, e fanno aderire la cellula al

substrato.

Le zattere lipidiche

Sono delle regioni della membrana cellulare rappresentate da accumuli di proteine e lipidi. Hanno uno spessore maggiore

rispetto alle restanti parti della membrana, in quanto i lipidi presentano code di acidi grassi più lunghe. Nelle zattere

lipidiche si concentrano in particolare colesterolo, sfingolipidi e particolari proteine di membrana. Sono dei centri di

assemblaggio di recettori per molecole segnale. 21

SISTEMI DI MEMBRANE INTRACELLULARI

Tutte le cellule presentano un sistema endomembranoso costituito da una serie di strutture interconnesse

strutturalmente e funzionalmente. Il citoplasma di ogni cellula è suddiviso in vari compartimenti delimitati da membrane

e i compartimenti sono specializzati per compiere specifiche funzioni. Inoltre, il corredo proteico imprime ad ogni

organulo la sua prerogativa. Questo sistema endomembranoso è costituito principalmente da reticolo endoplasmatico,

complesso del Golgi, lisosomi, endosomi, e vacuoli.

Questo insieme di endomembrane che vanno a costituire una rete interconnessa, direttamente o indirettamente,

rappresenta la maggior parte degli organuli che occupano il citoplasma di una cellula (“la maggior parte” perché ci sono

anche degli organuli che non fanno parte del sistema endomembranoso, ad esempio i mitocondri).

A partire dal nucleo, fino alla porzione più periferica

della cellula, si presenta un susseguirsi di regioni

citoplasmatiche delimitate da membrana.

Il nucleo rappresenta la regione della cellula in cui si

trova materiale genetico e una sorta di matrice, definita

nucleoplasma, in cui il materiale genetico è alloggiato.

Nelle cellule eucariotiche il nucleo è delimitato da

strutture membranose, non si parla di membrana

nucleare, ma di cisterna perinucleare; il termine cisterna

sottintende una struttura con una cavità, un vuoto,

all’interno, quindi la cisterna perinucleare è formata da

una membrana interna e da una membrana esterna:

all’estremità questi 2 tratti si fondono andando a

costituire questa struttura, e tra le 2 membrane c’è uno

spazio cisternale. Solo sulla membrana perinucleare

esterna, e non su quella interna, sono adesi dei ribosomi (anche per questo motivo è sbagliato definirla come membrana

nucleare). Procedendo oltre l’involucro nucleare, segue una sorta di struttura, sempre con uno spazio interno, che in

alcuni tratti si trova in continuità con dei punti della membrana perinucleare: è la prima struttura endomembranosa che

costituisce il reticolo endoplasmatico (si può quindi dire che alcune cisterne del reticolo endoplasmatico sono in

continuità con la cisterna perinucleare, ciò significa che il lume della cisterna comunica con lo spazio dell’altra cisterna). I

ribosomi localizzati sulla cisterna perinucleare possono leggere degli RNA messaggeri e il prodotto cade all’interno di

questo lume per poi venire trasportato, visto che sono in continuità, nella cisterna del reticolo endoplasmatico ruvido.

Andando oltre le cisterne del reticolo endoplasmatico ruvido si incontra la zona di transizione, tra il reticolo

endoplasmatico ruvido e ciò che sta dopo, cioè l’apparato del Golgi. Un esempio di collegamento diretto è quello tra

cisterna perinucleare e lume del reticolo endoplasmatico ruvido, perché ci sono delle zone di continuità, mentre un

esempio di collegamento indiretto è quello tra il lume del reticolo endoplasmatico ruvido e l’apparato del Golgi, in quanto

tra essi non c’è continuità. Quindi, se il reticolo endoplasmatico ruvido deve comunicare con l’apparato del Golgi può

farlo solo attraverso delle vescicole, per cui dalla regione di transizione gemmano delle vescicole che lasciano il reticolo

endoplasmatico e vanno verso il Golgi; queste vescicole sono vescicole di carico, cioè contengono quelle proteine che

sono state sintetizzate a livello del reticolo endoplasmatico ruvido, che non sono ancora mature come proteine e devono

necessariamente seguire una via obbligata, cioè transitare attraverso le cisterne del Golgi, per poter completare il loro

processo di maturazione. I ribosomi si trovano sul reticolo per svolgere la funzione di traduzione, perciò la regione di

transizione è una porzione di cisterna priva di ribosomi. Le vescicole staccate, gemmate, seguono dei “binari”, che sono i

microtubuli, che li direzionano verso l’apparato del Golgi, al quale sono destinate. L’apparato del Golgi è un sistema di

cisterne, definite come tante cisterne impilate, ognuna delle quali non è in comunicazione con la cisterna adiacente. Ogni

cisterna dell’apparato del Golgi comunica quindi con quella adiacente tramite vescicole, che gemmano all’estremità di

ogni cisterna per passare alla cisterna adiacente, dove si formerà tramite un processo di endocitosi. La parte centrale

dell’apparato del Golgi è costituita da cisterne omogenee nella loro morfologia, mentre la parte rivolta verso il reticolo

endoplasmatico e quella rivolta verso la membrana plasmatica presentano una sorta di deformazione nella struttura delle

cisterne, infatti, la porzione orientata verso il reticolo endoplasmatico viene definita faccia del cis-Golgi, mentre quella

orientata verso la membrana plasmatica viene chiamata faccia del trans-Golgi. La proprietà della regione cis è quella di

accogliere le vescicole che provengono dal reticolo endoplasmatico, per cui questa prima porzione in realtà è il risultato

di fusioni delle vescicole che si staccano dal reticolo endoplasmatico ed è una porzione estremamente dinamica ed in

formazione; la regione opposta, invece, è una regione in disfacimento e in disorganizzazione in quanto l’ultima cisterna

raccoglie i prodotti proteici finiti, che hanno subito glicosilazione e modificazioni e che sono pronti per essere portati

all’esterno della cellula o per essere inseriti nel doppio strato fosfolipidico della membrana, quindi l’ultima cisterna si

dissocia, acquisisce una struttura tubulare, e da questa struttura risulta una serie di vescicole, che verranno veicolate,

sempre tramite microtubuli, verso la membrana plasmatica o verso quegli organuli citoplasmatici che necessitano di

quelle proteine. A livello del Golgi abbiamo quindi 3 zone importanti: la regione di formazione, la regione intermedia fatta

da cisterne morfologicamente stabili, e l’ultima porzione che si dissolve in una sorta di rete dalla quale poi si

staccheranno le vescicole vere e proprie. Alla regione di formazione, di transizione tra il reticolo e il Golgi, è stato dato il

nome di ERGIC, Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment. Le vescicole che si staccano per raggiungere

il Golgi vengono chiamate VGT, Vescicole di Trasporto verso il Golgi. In una cellula non esiste un unico apparato del

Golgi, il numero di pile di cisterne varia a seconda della funzionalità della cellula. 22

Si è visto che tutti gli elementi delle membrane presenti all’interno di una cellula, che siano del reticolo, del Golgi, delle

vescicole, o di altro, sono in continuo turnover: il reticolo endoplasmatico ruvido non è statico perché continuamente

perde porzioni della sua membrana sotto forma di vescicole, quindi esse lasciano il reticolo e vanno verso il Golgi, questo

fa capire che c’è un turnover delle membrane. Bisogna inoltre tenere presente che i fosfolipidi presenti a livello del

reticolo endoplasmatico ruvido potrebbero essere diversi da quelli che poi costituiscono le membrane dell’apparato del

Golgi, questo significa che intervengono degli enzimi che modificano la porzione idrofilica della testa del fosfolipide,

ovvero i gruppi idrofilici (serina, fosfatidilserina…).

Pur essendoci questo continuo turnover fra gli elementi delle membrane, rimangono fisse alcune funzioni: le proteine

sono continuamente sintetizzate dal reticolo endoplasmatico ruvido, i lipidi (fosolipidi) sono sintetizzati a livello del

reticolo endoplasmatico (intero reticolo endoplasmatico, liscio e ruvido), gli zuccheri vengono sintetizzati nel reticolo

endoplasmatico ruvido. La sintesi delle catene polipeptidiche, ovviamente, non avviene solo nel reticolo endoplasmatico,

ma avviene anche nel citosol, per proteine il cui destino è fuori dalla cellula, nella membrana della cellula, o verso gli

organuli della cellula stessa; nel citosol avviene la sintesi delle proteine, definite solubili, che vengono utilizzate dalla

cellula nel proprio citoplasma, proteine che andranno a costituire parti dei filamenti di actina, tubuline, filamenti

intermedi, o proteine che sono utilizzate a livello del nucleo.

I mitocondri

I mitocondri sono organelli dinamici con forma

bastoncellare, di lunghezza fino a 10 micrometri e di

diametro di 0,5 – 1 micrometri. Sono in grado di

fondersi e di scindersi, quando la fusione diventa

più frequente tendono a diventare più allungati ed

interconnessi, quando è predominante invece la

scissone diventano più numerosi e distinti. Formano

grandi reti interconnesse dette Network Mitocondriale.

In alcune cellule sono immobili nel sito dove devono

fornire ATP, dal momento che questa è la loro

principale funzione: per esempio nelle cellule

muscolari

sono disposti vicino all’apparato contrattile, che

necessita di ATP, mentre negli spermatozoi sono

localizzati nella

coda, avvolti nella regione prossima al flagello (tratto

intermedio). La loro struttura interna è caratterizzata

dalla presenza di due membrane che costituiscono il

margine esterno.

- La membrana mitocondriale esterna racchiude completamente il mitocondrio e ne rappresenta il confine,

dunque ha funzione protettiva. È formata per il 50% da lipidi e contiene enzimi molto diversi, è liscia e si pensa che

possa essere derivata dalla membrana esterna della parete cellulare in alcune cellule batteriche per la presenza di

porine, strutture dinamiche che la rendono permeabile e molecole come l’ATP, il NAD e il coenzima A. Inoltre,

presenta proteine di trasporto per il piruvato.

- La membrana interna invece è suddivisa in 2 domini interconnessi tramite le giunzioni delle creste: la matrice

delimitante interna, che forma un rivestimento esterno a doppia membrana, e un secondo dominio della membrana

che si estende verso l’interno dell’organello in una serie di invaginazioni membranose dette creste, che aumentano

la superficie di assorbimento della membrana. A differenza di quella esterna, la membrana interna ha un rapporto

proteine : lipidi di 3 : 1, è ricca di colesterolo e di cardiopilina (caratteristica della membrana plasmatica dei batteri).

Il suo dominio lineare seleziona le molecole e contiene complessi proteici per il trasporto di proteine mitocondriali,

proteine di trasporto per il piruvato, ATP e ADP e fosfato inorganico. Il suo dominio organizzato in creste contiene

complessi proteici per il trasporto e il trasferimento di elettroni oltre al complesso ATP sintasi.

Le due membrane dividono l’organello in due compartimenti ripieni di fluido: lo spazio intermembrana e la matrice. Essa

ha una consistenza di gel e un’alta concentrazione di proteine idrosolubili, presenta vari enzimi e parecchie molecole

di DNA a doppio filamento, solitamente circolari. Dunque i mitocondri possiedono un loro materiale genetico e i

macchinari per sintetizzare i loro RNA e proteine. Tale DNA è importante perché codifica per un piccolo numero di

polipeptidi mitocondriali (13 nell’uomo) che vengono integrati nella membrana mitocondriale interna insieme a polipeptidi

codificati da geni che risiedono nel nucleo.

Secondo la teoria endosimbionte i mitocondri si sarebbero sviluppati a partire dalla fagocitosi di un batterio

aerobio da parte di una cellula ancestrale che, incapace di vivere in condizioni di aerobiosi, ha conservato e sfruttato

l’organello. Si pensa che tale cellula dovesse essere dotata di una membrana sufficientemente fluida per

fagocitare un batterio. 23

I perossisomi

I perossisomi, anche detti microcorpi, sono semplici vescicole

tondeggianti, circondate da una membrana del diametro di 0,1 – 1,0

micrometri. Spesso contengono un nucleo denso, cristallino, formato

da enzimi ossidativi. Sono organelli multifunzionali che contengono

più di 50 enzimi differenti che partecipano ad attività diverse, come

l’ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga o la sintesi dei

plasmalogeni (classe di fosfolipidi del tessuto nervoso in cui ogni

acido grasso è legato al glicerolo con legame etero e non esterico).

Sono simili ai lisosomi per dimensioni e sono anche simili ai

mitocondri in quanto: si formano per scissione da organelli

preesistenti, importano proteine già formate dal citosol, sono

impegnati nel metabolismo ossidativo, e attuano la formazione e la

degradazione del perossido di idrogeno (H O ), un agente ossidante tossico e altamente reattivo che viene prodotto da

2 2

vari enzimi perossisomiali come l’uratossidasi, la glicolatossidasi e le amminoacidossiasi e viene tempestivamente scisso

dall’enzima catalasi.

Come si presenta il citoplasma ad un’analisi microscopica

Analizzando un epatocita di ratto al TEN, microscopio elettronico a trasmissione, si notano dei puntini neri, i quali

rappresentano le molecole di glucosio che si accumulano sotto forma di granuli di glicogeno. Lo spessore della sezione è

dell’ordine degli Armstrong, la visione tridimensionale riproduce parzialmente la cellula, e il corredo proteico imprime ad

ogni organulo la sua prerogativa. Il citoplasma appare suddiviso in vari compartimenti delimitati da membrane,

specializzati per compiere determinate funzioni:

- Reticolo endoplasmatico, complesso del Golgi, lisosomi e vacuoli hanno strutture proprie e costituiscono il sistema

endomembranoso, il quale è interconnesso, direttamente o indirettamente, strutturalmente e funzionalmente.

- Il nucleoplasma è la regione della cellula in cui si trova il materiale genetico.

- La cisterna perinucleare è formata da una membrana interna ed una esterna che si fondono alle estremità. Sulla

membrana esterna sono adesi i ribosomi.

- La struttura visibile in cui c’è uno spazio interno è la prima struttura endomembranosa che costituisce il reticolo

endoplasmatico da cui gemmano delle vescicole che devono transitare entro le cisterne per completare il loro

processo di maturazione.

- L’apparato del Golgi è un sistema di cisterne, ognuna delle quali non è in comunicazione con quella adiacente, ma

sono in comunicazione attraverso le vescicole. Nella parte centrale si trovano delle cisterne omogenee nella loro

morfologia, mentre la regione del trans-Golgi (orientata verso la membrana plasmatica) è estremamente dinamica.

L’ultima cisterna raccoglie i prodotti finiti, pronti per essere veicolati, poi si svolge per permettere la veicolazione. La

regione di formazione/transizione prende il nome di ERGIC. Le vescicole di trasporto verso il Golgii vengono dette

VGT.

Il reticolo endoplasmatico

C’è una continuità tra reticolo endoplasmatico ruvido e liscio, ciò significa che il lume di una cisterna del reticolo

endoplasmatico ruvido e il lume di una porzione del reticolo endoplasmatico liscio sono in continuità. La porzione del

reticolo endoplasmatico liscio ha una struttura tubuliforme, ma il

suo lume è in continuità con il lume della cisterna del reticolo

endoplasmatico ruvido.

La prima differenza tra reticolo endoplasmatico liscio e ruvido è il

fatto che nel liscio c’è assenza di ribosomi, mentre nel ruvido c’è

la presenza di ribosomi sul monostrato fosfolipidico

citoplasmatico della membrana che delimita il reticolo (tenere

presente che il ribosoma è appoggiato sulla membrana del

reticolo, non attraversa il doppio strato fosfolipidico). I ribosomi

sono adesi al reticolo endoplasmatico ruvido nel momento in cui

stanno traducendo, ma completato questo processo si staccano e

tornano come subunità libere nel citoplasma della cellula. Anche

la morfologia dei 2 tipi di reticolo è molto diversa: tubulare per il

liscio, cisternale per il ruvido.

La scoperta del fatto che i lumi dei 2 tipi di reticolo sono in continuità tra di loro deriva da esperimenti. Dei ricercatori

hanno marcato con fluorocromi delle proteine localizzate a livello del lume del reticolo endoplasmatico liscio e delle

proteine localizzate nel nucleo del reticolo endoplasmatico rugoso; risultato di questo esperimento è che dopo un certo

intervallo di tempo le proteine marcate nel lume del liscio si ritrovavano a livello del nucleo del ruvido e viceversa, quindi

erano libere di spostarsi, ciò dimostra la continuità tra i 2 comparti, confermata anche da esperimenti successivi.

Entrambi i tipi di reticolo sono delimitati da membrane, che racchiudono un lume, il quale è separato dal citosol; altra

caratteristica è che il lume che è racchiuso da queste membrane è nettamente diverso dal citosol che è presente

24

all’esterno delle strutture. Altri dati sperimentali hanno permesso di vedere che la qualità del lume cisternale, per

esempio del reticolo endoplasmatico o dell’apparato del Golgi, è più simile all’ambiente extracellulare che all’ambiente

citosolico, perché il lume delle vescicole che gemmano dal reticolo endoplasmatico, dopo essere passato nel Golgi, viene

esportato nell’ambiente extracellulare, quindi è per questo motivo che il lume di questi comparti mantiene un’elevata

similitudine con il lume cisternale. Lo spazio cisternale quindi viene mantenuto diverso, ad esempio in termini di

concentrazioni ioniche, rispetto a quello citoplasmatico, e anche il pH è leggermente diverso.

Il fatto che ci sia continuità tra i 2 reticoli significa che il materiale può liberamente circolare, ma c’è un meccanismo di

controllo atto ad indirizzare le proteine appena sintetizzate nel RER in vescicole che gemmando saranno dirette verso

l’apparato del Golgi; quindi c’è sì una continuità dei materiali, ma il loro destino è strettamente controllato.

Essendoci continuità, ma essendo i 2 reticoli morfologicamente diversi, implica che ci siano similitudini e differenze

funzionali, entrambi possono concorrere in determinati processi, ma per altri processi lavorano singolarmente.

I due comparti presentano molte proteine in comune, condivise però solo per le funzioni che svolgono insieme: proteine,

o enzimi, indispensabili per la sintesi di lipidi e specifiche proteine funzionali.

I ricercatori non si sono limitati a marcare con dei fluorocromi le proteine del lume del REL e quelle del nucleo del RER,

ma hanno anche marcato dei lipidi localizzati sulle membrane delle 2 regioni e hanno visto che possono spostarsi da un

comparto ad un altro, questo presuppone che ci siano degli organismi di controllo che sottintendano alla produzione di

determinate molecole. Si è anche visto che entrambi, RER e REL, non solo collaborano per la sintesi di specifici

fosfolipidi, ma insieme collaborano anche alla produzione del colesterolo, estremamente importante per essere inserito in

punti strategici di una membrana, cellulare o plasmatica, per regolarne la fluidità. Quindi la sintesi di specifici fosfolipidi e

di colesterolo sono a carico del reticolo endoplasmatico (senza distinzione tra ruvido e liscio). Si è anche visto però che

specifiche proteine ed enzimi lavorano solo a livello del RER e altre solo a livello del REL.

Come detto, tra i 2 tipi di reticolo ci sono differenze morfologiche: anche se ci sono porzioni che si distaccano da

entrambi, il liscio continua a mantenere la sua struttura tubulare, mentre il ruvido continua a mantenere la sua struttura

a cisterne; e queste differenza morfologica riflette una diversa funzionalità: il ruvido presiede principalmente la sintesi

proteica, mentre il liscio svolge tante altre funzioni (per esempio, in cellule specifiche, diventa serbatoio contro gradiente

degli ioni calcio). Il RER è costituito da cisterne appiattite, sulla superficie citoplasmatica sono presenti i ribosomi e

alcune cisterne sono in continuità (solo) con la membrana nucleare esterna. Il REL è privo di ribosomi ed è formato da

tubuli che generano un sistema di canali interconnessi. Nel nostro organismo ci sono diverse tipologie cellulari, tipi

diversi di cellule hanno quantità diverse di RER o di REL, a seconda anche delle funzioni che devono svolgere.

I ribosomi che sono legati al RER e i ribosomi che traducono una proteina nel citosol sono uguali o sono diversi? (se

sono diversi vuol dire che un ribosoma sa dove deve avvenire la sintesi di una proteina a livello del ruvido, se sono

uguali vuol dire che deve esserci qualche altro meccanismo che dirigerà il ribosoma verso il ruvido o lo obbligherà a

rimanere all’interno del citosol). Sono uguali, non c’è differenza, quindi dovrà esserci qualche altro meccanismo che

deciderà se quel ribosoma (subunità maggiore e subunità minore) dovrà legarsi al reticolo ruvido o rimanere nel citosol

per fare traduzione e sintetizzare una proteina.

Il reticolo endoplasmatico liscio

- Ci sono esempi che si possono prendere in considerazione, che contengono grandi quantità di REL, associate al suo

maggior grado di sviluppo: cellule della muscolatura scheletrica, tubuli renali, cardiociti, ghiandole endocrine

(preposte alla produzione di ormoni steroidei, che vengono sintetizzati a livello del REL). La sintesi degli ormoni

steroidei avviene a livello delle gonadi (sia maschili che femminili) o a livello della corteccia surrenale, gli ormoni poi

viaggiano nel sangue e tramite la circolazione possono raggiungere distretti cellulari anche molto distanti da quelli in

cui sono stati sintetizzati.

- A livello del lume del REL c’è una famiglia di enzimi chiamata citocromo P-450, il loro obiettivo è quello di

detossificare il nostro organismo da tutto ciò che è indesiderato e/o tossico (tutte le molecole xenobiotiche,

barbiturici, farmaci, etanolo, benzovirene, inquinanti…) e che introduciamo per inalazione, per contatto o per

digestione. La scoperta di questi enzimi è stata fatta attraverso esperimenti; alcuni ricercatori hanno codificato

questa famiglia enzimatica partendo da cellule basiche, facendo una preparazione cellulare e omogeneizzando un

frammento contenente cellule di fegato: le cellule si spaccano, ma il REL si risolve in tanti piccoli microsomi, che

sono ricchi di citocromo P-450. (Ricordare che con il processo di biotrasformazione delle sostanze pre-cancerogene

possono essere messe in circolo sostanze cancerogene o più pericolose e innescare dei processi di cancerogenesi,

ma l’organismo non potrebbe fare altrimenti perché deve eliminare determinate sostanze e può farlo solo attraverso

questo processo). Il citocromo P-450 è una famiglia di enzimi che non hanno una specificità per il substrato, di un

farmaco, di un idrocarburo, o di altro: questo può essere un aspetto positivo perché se si ha un sistema enzimatico

con una bassa specificità per il substrato significa che quel sistema enzimatico riesce a riconoscere e a trasformare

molecole anche molto diverse tra di loro.

- Il REL per alcune cellule rappresenta un sistema molto efficiente per l’immagazzinamento del calcio a livello del

citoplasma della cellula, ne sono degli esempi le cellule muscolari scheletriche e i cardiociti.

- Il REL è preposto al metabolismo del glicogeno (glicogeno-genesi), soprattutto in una fase molto specifica, la

glicogeno-lisi. Anche questo evento è da ricercare nel fegato, in quanto è lì che il glicogeno viene accumulato, gli

epatociti hanno un abbondante REL anche perché sono coinvolti nella glicogenolisi, ossia nel processo per cui

singole molecole di glucosio vengono staccate dal polimero tutte le volte che nel sangue i livelli di glucosio sono

molto bassi. Glicogeno-sintesi e glicogeno-lisi non avvengono quando capita, ma sono sotto controllo ormonale. Il

glicogeno è presente a livello della cellula sotto forma di granuli, che rilasciano molecole di glucosio quando arriva

25

un segnale, ovvero l’ormone glucagone. All’arrivo di questo ormone il fegato risponde, gli epatociti rispondono

attraverso questo processo, che da polimeri di glicogeno permette il rilascio di singole molecole di glucosio nel

sangue. Ci si trova a livello del citoplasma della cellula, dove c’è una porzione di REL, la molecola di glicogeno

presenta delle molecole di glucosio legate tra di loro; arriva l’enzima glicogeno-fosforilasi, che porta un gruppo

fosfato all’ultimo glucosio inserito nella catena polimerica e fosforilando il glucosio determina il distacco di

quest’ultima molecola di glucosio dalla catena polimerica (questo glucosio viene chiamato glucosio-1P, glucosio-1-

fosfato), ma essa non è in grado di uscire autonomamente dalla cellula e raggiungere il connettivo circostante dove

è presente una fitta rete di capillari, quindi deve intervenire un altro enzima, detto fosfo-gluco-mutasi, che media il

passaggio da glucosio-1-fosfato a glucosio-6-fosfato. Questo enzima è in grado di mutare la posizione del gruppo

fosfato dal carbonio-1 al carbonio-6, facendolo quindi diventare glucosio-6-fosfato, la molecola quindi non cambia,

ma cambia solo il livello di fosforilazione del carbonio: a questo punto c’è un monomero fosforilato al carbonio-6 che

viene riconosciuto da un enzima, il glucoso-6-fosfatasi che sta a livello della membrana cellulare del REL, che media

il distacco. Di conseguenza il glucosio-6-fosfato viene portato in prossimità della membrana cellulare del REL, dove

c’è questo enzima che è in grado di staccare il gruppo fosfato, e così facendo si ottiene una semplice molecola di

glucosio libera nella cellula, che se ne ha bisogno lo utilizza tramite una proteina di membrana che lavora secondo

gradiente detta permeasi. Lo stimolo ormonale antagonista, l’insulina, è ciò che fa accumulare glucosio all’interno

dell’epatocita e permette di polimerizzarlo in granuli di glicogeno.

Il reticolo endoplasmatico rugoso

Come il REL, anche il RER ha molte funzioni e caratteristiche che sono peculiari per questa associazione di cisterne. Visto

che sulla superficie citoplasmatica della sua membrana ci sono dei ribosomi, la prima definizione in relazione alla sua

funzione è che il RER è il punto di partenza di una via biosintetica. Il concetto di biosintesi a livello di una cellula riguarda

diverse molecole, in questo caso si tratta della sintesi di catene polipeptidiche e proteine. Nel RER avvengono la sintesi e

la maturazione delle proteine (appena una catena polipeptidica è stata sintetizzata può andare incontro a vari processi,

infatti l’inizio di una glicosilazione delle proteine può avvenire a livello del RER a carico di proteine di membrana), la

sintesi dei carboidrati (perché vengono anche utilizzati per glicosilare le proteine), e la sintesi dei fosfolipidi (alcuni

fosfolipidi sono sintetizzati in compartecipazione con il REL, altri sono invece specifici del RER). Se la proteina non si

ripiega nel modo corretto viene riconformata, se dopo un certo numero di tentativi è ancora malconformata viene

portata al di fuori del RER e viene digerita a livello di specifiche regioni citoplasmatiche chiamate proteosomi, che sono

dei particolari organelli. A volte questi processi di eliminazione delle proteine malconformate non vanno a buon fine ed

esse potrebbero essere portate comunque alla loro destinazione finale, quindi biosintesi e maturazione sottintendono

meccanismi di controllo molto raffinati.

Come detto, il RER è molto abbondante a livello di cellule che hanno un’elevata sintesi proteica. Le cellule che secernono

muco sono cellule o ghiandole unicellulari caliciformi mucipare e i granuli di mucinogeno che producono sono poi

rilasciati nel lume della cellula. Il mucinogeno è una forma inattiva della mucina, quindi del muco che riveste le cellule

epiteliali del nostro intestino, proteggendolo e facilitando il passaggio del bolo alimentare. La porzione apicale di una

cellula di questo tipo ha una morfologia diversa rispetto alla sua porzione basale. Il nucleo viene confinato nella parte

basale della cellula e subisce una sorta di modificazione della sua forma perché tutto il resto del citoplasma deve essere

principalmente occupato dai granuli di secreto, che sono contenuti in tante vescicole che sono gemmate dall’apparato

del Golgi e il Golgi ha ricevuto questi granuli dopo una sintesi avvenuta a livello del REL. Il RER è steso per sopperire alla

marcata sintesi richiesta da questa tipologia cellulare nella parte intorno al nucleo e l’apparato del Golgi consiste di tante

pile disposte in zone strategiche a ricevere le vescicole dal RER e a rilasciarle sotto forma di granuli di mucina. Quindi in

cellule dove la sintesi proteica è molto marcata, il RER, il Golgi, e le vescicole che ne derivano occupano una regione

molto particolare. Quando necessario arriva uno stimolo e le vescicole si fondono con la membrana plasmatica e viene

rilasciato mucinogeno nell’ambiente esterno che poi si trasforma in muco vero e proprio. Questi granuli sono molto

elettrondensi per il loro contenuto e sono quindi ben visibili al microscopio.

Una cellula che possiede una grande quantità di RER attorno al nucleo è una cellula che attua una sintesi proteica molto

marcata. La sintesi proteica può essere anche di granuli di zimogeno, ovvero una forma inattiva di enzimi che finché non

verranno attivati rimangono silenti. Queste molecole si attivano quando vanno incontro ad un ambiente acido, come per

esempio quello dei lisosomi; quindi a livello di questi enzimi viene scisso quello che viene chiamato segmento di

attivazione e dalla piccola porzione peptidica l’enzima diventa attivo, potendo quindi funzionare.

A livello del nostro stomaco inizia un processo di digestione, che però si completa a livello dell’intestino. Questo processo

digestivo a livello dello stomaco viene innescato dalla pepsina, che è la forma attiva del pepsinogeno, quando è

necessario il pepsinogeno rilasciato diventa pepsina perché perde il segmento di attivazione che lo rende funzionante.

L’obiettivo del RER è la sintesi proteica. Affinché ci sia sintesi, i ribosomi devono aderire al versante citosolico della

membrana della cisterna perché a livello di una membrana plasmatica c’è un doppio strato fosfolipidico, a livello di una

membrana del RER c’è uno strato fosfolipidico, ma una proteina che deve essere sintetizzata deve finire nel lume della

cisterna, quindi il ribosoma si appoggia sulla membrana cellulare, ma essa è una barriera nei confronti di molecole

voluminose (e una proteina lo è), perciò affinché la proteina venga a trovarsi nel lume della cisterna occorre che a livello

della membrana del reticolo ci sia una proteina trasportatrice, e in questo caso specifico si parla di traslocone (quindi ci

sono delle proteine che sono destinate a mediare la sintesi proteica). Negli organuli del sistema endomembranoso

26

occorrono specifiche proteine che devono essere incorporate al di fuori del reticolo, ossia proteine sintetizzate a livello

del RER che però devono essere proteine a funzione enzimatica per il Golgi o che vanno a costituire i lisosomi o gli

endosomi, o proteine che servono per una cisterna perinucleare. Il sistema delle endomembrane richiede un corredo

proteico molto preciso, e queste proteine vengono sintetizzate a carico del RER, sono proteine con una destinazione

specifica, perciò anche in questo caso ci saranno dei meccanismi atti ad orientarle in modo opportuno.

La cellula ha quindi bisogno di proteine che vengano esportate sotto forma di prodotti di secrezione e di proteiche che

vadano a far parte di una membrana plasmatica. Le principali tipologie di proteine sono 3, intrinseche (transmembrana),

periferiche interne e periferiche esterne, le proteine che vengono sintetizzate a livello del RER, oltre a quelle

transmembrana, sono solo quelle dello spazio extracellulare perché dal reticolo si staccano delle vescicole e queste

proteine sono nel lume delle vescicole; quando vengono portate alla membrana plasmatica, la vescicola si fonde con la

membrana plasmatica, la membrana della vescicola entra a far parte della membrana plasmatica e ciò che viene portato

all’esterno è solo la proteina che prima era nel lume della vescicola di trasporto, questa proteina avrà un segnale che la

blocca a livello della superficie della membrana plasmatica e lì si lega con dei legami che la mantengono ancorata alla

membrana stessa. Una proteina, sempre periferica, ma citosolica, non può essere trasportata da una vescicola, ma deve

essere sintetizzata sui ribosomi liberi nel citosol e poi indirizzata verso il lato citoplasmatico della membrana plasmatica.

Sintesi delle proteine e loro smistamento

La sintesi proteica all’interno di una cellula non è correlata solo al

RER. A livello di una cellula avviene sintesi proteica, dopo che è

avvenuta la sintesi ogni tipologia di proteina deve essere smistata

in modo corretto: alcune devono essere portate alla membrana

plasmatica, alcune devono rimanere nel citosol, alcune devono

andare nel nucleo, alcune devono essere portate al di fuori della

cellula; la cellula non è un’unità caotica, ma funziona bene

perché ogni processo è altamente controllato. Per lo smistamento

ci sono delle porzioni definite “indirizzo”, ogni proteina contiene

delle informazioni che identificano il suo indirizzo e tramite

microtubuli verrà veicolata a destinazione.

Ogni organulo cellulare deve ricevere un pacchetto, una

determinata proteina idonea per quell’organulo (per esempio il

nucleo deve ricevere gli istoni, proteine sintetizzate nel citosol,

che hanno una sequenza segnale che li indirizza verso la cisterna

perinucleare). Ogni prodotto deve avere un suo indirizzo di

destinazione e in questo punto deve esserci una struttura capace

di leggere le informazioni in esso contenute, altrimenti il processo

non può avvenire.

Tutte le proteine che vengono sintetizzate nel RER sono:

- Proteine che devono essere secrete dalla cellula Via biosintetica più semplice possibile.

- Proteine che devono essere inserite nella membrana plasamatica Proteine transmembrana, proteine canale,

proteine trasportatrici, proteine che inserite nella membrana plasmatica servono come segnale per la cellula.

- Proteine solubili, che rimangono nel sistema endomembranoso Proteine che rimangono a livello del RER. Proteine

chaperon (nel momento in cui una proteina sta per essere sintetizzata e comincia il suo ripiegamento, controllano

che questo ripiegamento sia corretto. Sono proteine che si trovano a livello del reticolo endoplasmatico).

Le proteine che vengono sintetizzate sui ribosomi liberi, ovvero sui ribosomi che, nel momento in cui arriva l’RNA

messaggero, unendo subunità maggiore e minore, cominciano a leggere la catena polipeptidica. La sintesi avviene nel

citoplasma della cellula e il ribosoma non prende adesione con la membrana del reticolo. Sono:

- Proteine strutturate, o a funzione enzimatica, destinate a rimanere nel citosol Enzimi preposti alla glicolisi

(processo che avviene nel citosol con l’obiettivo di demolire le molecole di glucosio in molecole di acido piruvico),

proteine citoscheletriche (actina, proteine intermedie…).

- Proteine periferiche adese al lato citosolico.

- Proteine che vengono trasferite al nucleo Istoni, enzimi preposti alla duplicazione o alla trascrizione del DNA

(DNA-polimerasi, DNA-girasi, RNA-polimerasi…).

Chi decide dove deve avvenire la sintesi di una proteina?

Bisogna considerare i vari meccanismi che permettono a tutte le cellule di sintetizzare le proteine all’interno del

citoplasma, su ribosomi legati o su ribosomi liberi, e poi di attuare uno smistamento in modo adeguato a seconda dei

diversi comparti cellulari o al di fuori della cellula. Per una sintesi proteica tutto parte da un RNA messaggero, che è

stato precedentemente trascritto a partire da un gene, viene trasferito attraverso poli nucleari nel citoplasma della

cellula, viene riconosciuto da una subunità minore del ribosoma e successivamente da una subunità maggiore e si forma

quindi il ribosoma associato all’RNA messaggero. Dove va a finire questo complesso per poter dare inizio alla traduzione?

Il ribosoma rimane nel citosol per tradurre l’RNA messaggero o viene traslocato sul RER? 27

Gli studi che hanno portato alle conoscenze che oggi abbiamo in merito a questi processi sono stati condotti a partire

degli anni ’70: un gruppo di ricercatori, capeggiati da Blobel, un biologo tedesco, in collaborazione con altri 2 ricercatori,

Sabatini e Doberstein, avanzarono quella che per la prima volta venne definita come la “teoria dell’ipotesi del segnale”.

Essi proposero che prima che termini la traduzione di una proteina e che questa acquisisca una sua reale trasformazione,

questa proteina sa già dove andare e in che regione andare incontro alla traduzione (o nel citoplasma o a livello del

reticolo). Questa ipotesi del segnale presupponeva che proprio all’inizio della traduzione della catena polipeptidica,

quando la catena è costituita da poche decine di amminoacidi, c’è una sequenza segnale, che è quella responsabile della

decisione del punto preciso in cui si completerà la sintesi della catena polipeptidica. Infatti, gli studi condotti da Blobel

dimostrarono che tutte le catene polipeptidiche che vengono tradotte a livello del reticolo endoplasmatico ruvido

presentano una sorta di sequenza segnale che è fatta da pochi amminoacidi localizzati generalmente all’estremità N-

terminale di questa catena polipeptidica nascente. Con queste informazioni si può dedurre che tutte le catene

polipeptidiche iniziano nella loro traduzione a partire dall’estremità N-terminale, è la prima parte che compare, quindi

l’estremità C-terminale è l’ultima che compare; le prime proteine che i ricercatori presero in considerazione presentavano

la sequenza segnale all’estremità N-terminale, questa ipotesi è stata saggiata anche su altre proteine, e si è visto che

questa sequenza segnale può essere non necessariamente all’estremità N-terminale, ma anche in una porzione più

interna della catena polipeptidica. Comunque tutte quelle proteine che dovranno essere sintetizzate a livello del reticolo

devono presentare una sequenza segnale, o all’estremità N-terminale o un po’ più all’interno. Questa sequenza segnale

deve essere riconosciuta da un fattore citosolico che lega la catena polipeptidica nascente nella sequenza segnale e

trasloca il tutto sulla membrana del RER, dove è presente il traslocone sul quale si adagia il ribosoma che attraverso il

canale del traslocone entrerà nel lume della cisterna del RER. Si tratta di una sintesi cotraduzionale, ovvero della

sintesi di una catena polipeptidica che avviene a livello del traslocone sulla membrana del RER man mano che la proteina

sta per essere sintetizzata.

Se la catena polipeptidica nascente non presenta sequenza segnale, il destino del complesso RNA messaggero, ribosoma

e tratto della catena polipeptidica è quello di rimanere nel citosol, l’RNA messaggero completa la traduzione a livello dei

ribosomi del citoplasma. Quindi questo secondo gruppo di proteine ha una sintesi a livello citoplasmatico.

La teoria dell’ipotesi del segnale è stata poi utilizzata anche su altre proteine, e l’unica differenza che si è aggiunta

all’ipotesi iniziale è che la sequenza segnale non è sempre all’estremità N-terminale, ma potrebbe essere anche in una

porzione un po’ più interna. Questi studi hanno portato a Blobel il premio Nobel per la medicina nel 1999, questi

esperimenti sono un esempio di ricerca di base, sapere che le proteine vengono sintetizzate e tradotte a livello del RER o

a livello del citoplasma, in termini di medicina, acquista grande significato per le patologie che dipendono da proteine

sintetizzate e tradotte in modo sbagliato.

La sintesi di ogni proteina inizia SEMPRE, non ci sono eccezioni, sui ribosomi del citosol, poi nel momento in cui il primo

tratto, con o senza sequenza segnale, viene sintetizzato, si decide dove si completerà la traduzione dell’RNA

messaggero.

Non tutte le proteine sintetizzate a livello del RER sono solubili, quindi non tutte cadono nel lume del suo nucleo, ma ci

sono anche quelle che diventeranno proteine transmembrana, il cui tratto idrofobico viene bloccato a livello della

membrana del RER e, entrando a far parte di una vescicola, verrà poi traslocato a livello della membrana plasmatica.

Completata la sintesi, la proteina neosintetizzata comincia ad essere elaborata a livello del RER (con processi di

glicosilazione o altri processi), nel RER ci sono enzimi che modificano la proteina (ad esempio glicosilasi) e ci sono altri

enzimi nell’apparato del Golgi, in diverse cisterne, che rimuovono determinati saccaridi e ne aggiungono altri modificando

la glicosilazione della proteina. L’ultima tappa a cui la proteina va incontro è quella di essere indirizzata all’organulo

giusto o alla membrana plasmatica o all’ambiente extracellulare, anche in questo caso non ci devono essere errori e tutto

deve essere controllato. Per correggere eventuali errori che possono sorgere lungo questa via biosintetica, le cellule

possono anche mettere in atto specifici meccanismi.

Il ruolo del RER nello smistamento delle proteine

Nel citosol c’è un pool di subunità ribosomiali, nel momento in cui dei ribosomi non sono impegnati nella sintesi non

esistono come complesso, ma come subunità staccate all’interno del citoplasma (subunità maggiore e minore), e

l’insieme di tutte queste subunità viene definito pool delle subunità; queste subunità ribosomiali si assemblano per

costituire il ribosoma nel momento in cui arriva l’RNA messaggero, che aggregandosi alla subunità minore permette il

richiamo della subunità maggiore e l’inizio della lettura della catena polipeptidica. Un solo RNA messaggero viene letto da

più ribosomi, questo è un meccanismo efficiente per la cellula per sfruttare un solo messaggio ed ottenere tante catene

polipeptidiche nell’unità di tempo, man mano che il ribosoma legge il messaggio la catena polipeptidica diventa sempre

più lunga e si attacca ad altri ribosomi.

Se non c’è nessuna sequenza segnale, si parla quindi di poli-ribosomi liberi nel citoplasma, l’RNA messaggero rimane nel

citosol e più ribosomi si attaccano.

L’altra situazione è quella per cui in una cisterna del RER si trova l’RNA messaggero che sta per essere tradotto dando

origine a una piccola porzione polipeptidica a partire da una sequenza segnale. Nel momento in cui compare il primo

tratto della catena polipeptidica con la sequenza segnale, tutto il complesso viene traslocato sul reticolo stesso grazie alla

presenza del traslocone, ciò significa che questo RNA messaggero viene letto solo da ribosomi che prenderanno contatto

con il traslocone e man mano che la proteina verrà sintetizzata cadrà nel lume del reticolo stesso. La sequenza segnale

poi non ha un significato funzionale nella proteina, ma la sua funzione finisce nel momento in cui dirige il complesso di

traduzione sul RER. Ci sarà poi una proteina ad attività enzimatica a livello del reticolo stesso, detta peptidasi, che taglia

28

la sequenza segnale, il risultato finale è una catena polipeptidica che a questo punto può, terminata la sintesi, acquisire

la sua conformazione, processo strettamente controllato da precisi meccanismi.

Ci sono proteine idrosolubili che quindi si versano direttamente nel lume della cisterna del reticolo e proteine destinate

ad essere transmembrana o ad essere escrete dalla cellula. I modelli da prendere in considerazione sono quindi

principalmente 2, trattasi di modello perché ogni anno ci sono nuovi e diversi studi, per cui i modelli proposti possono

essere confermati o modificati.

Modello per la sintesi di una proteina di secrezione

Una proteina di secrezione è una proteina solubile, una proteina che cadrà completamente nel lume della cisterna. La

sintesi del polipeptide inizia dopo che un RNA messaggero si lega ad un ribosoma libero, quindi non legato a

membrana citoplasmatica. Quelli che devono essere assemblati nel RER contengono una sequenza segnale, circa

6-15 residui amminoacidi idrofobici che indirizzano il peptide nascente in quanto riconosciuti da una particella di

riconoscimento del segnale (SRP) che nei mammiferi consiste in sei distinti polipeptidi e una piccola molecola di

RNA (RNA 7S, coefficiente Svedberg, coefficiente di sedimentazione delle molecole di RNA ribosomiale sottoposte a

forze centrifughe). L’SRP si lega alla sequenza segnale e al ribosoma, arrestando temporaneamente la sintesi.

Questo consente all’intero complesso di legarsi alla membrana del RE attraverso un legame SRP-recettore per l’SRP e

ribosoma-traslocone. Il traslocone è un canale delineato da proteine immerso nella membrana del RE che consente il

movimento del polipeptide. Presenta un poro a forma di clessidra con un anello di sei amminoacidi idrofobici situato

a livello del suo diametro minore. Nel suo stato inattivo, l’anello del poro è tappato da una breve alpha elica, che

viene spinta via nel momento in cui entra in contatto con il polipeptide. Dal momento che il suo diametro è

ridotto, è probabile che si espanda quando la catena nascente attraversa il canale. Una volta terminata la traduzione, il

ribosoma legato alla membrana è rilasciato e il tappo viene reinserito. Numerose tappe della sintesi sono regolate dal

legame o dall’idrolisi di GTP, dunque le proteine che legano il GTP, o proteine G, giocano un ruolo regolativo chiave in

molti processi cellulari e possono assumere almeno due conformazioni, una attiva legata al GTP e una inattiva.

Modello per la sintesi di una proteina integrale di membrana

Per quanto riguarda le prime tappe, la sintesi di proteine integrali è uguale a quella di proteine secretorie o lisosomali,

ma le proteine di membrana contengono uno o più segmenti idrofobici transmembrana che sono direttamente deviati dal

canale del traslocone nel doppio strato lipidico. Il traslocone infatti si apre e si chiude di continuo, quando riconosce una

porzione idrofobica, si apre lateralmente e da la possibilità al segmento del polipeptide di spostarsi in base alle sue

proprietà di solubilità. Più il segmento è idrofobico, maggiore è la possibilità che passi attraverso la parete del

traslocone e si integri con un segmento transmembrana del doppio strato lipidico. Le proteine che attraversano

la membrana una sola volta possono avere un orientamento, che dipende dai residui amminoacidici con cariche

positive all’estremità N-terminale. Quelle che la attraversano più volte avranno invece segmenti transmembrana

adiacenti con orientamento opposto.

Il traslocone può essere definito come un complesso macchinario, è un elemento indispensabile in quanto fa parte di un

processo, riconosce le sequenze segnale, riesce ad agganciare il ribosoma e svolge attività meccaniche durante il

processo di traduzione.

Biosintesi delle membrane nel reticolo endoplasmatico (elaborazione e processamento delle proteine neosintetizzate)

Le membrane non si creano ex novo da un pool di proteine e fosfolipidi, ma si ipotizza che derivino da membrane

preesistenti. Le membrane sono asimmetriche e la loro asimmetria è stabilita a partire dal RE, quando lipidi e proteine

vengono incorporati in maniera differente nei due strati. Il RE ha dunque un ruolo fondamentale anche nella sintesi dei

lipidi di membrana. La maggior parte di essi è infatti sintetizzata a livello del RE, fatta eccezione per la sfingomielina e

per i glicolipidi, la cui sintesi, benché inizi nel RE, è completata nel Golgi, e alcuni lipidi dei cloroplasti e dei mitocondri

che vengono sintetizzati da enzimi localizzati nelle loro membrane. I fosfolipidi di nuova sintesi sono inseriti nella

metà del doppio strato rivolta al citosol, alcune di queste molecole vengono poi trasportate nel foglietto opposto grazie

ad enzimi flippasi. Il fatto che le membrane dei vari organelli siano differenti a livello di composizione lipidica, indica che

mentre la membrana passa attraverso la cellula avvengono dei cambiamenti. Per esempio la maggior parte degli

organelli membranosi possiede enzimi che modificano i lipidi già presenti nella membrana, oppure quando le vescicole

gemmano da un compartimento, alcuni tipi di fosfolipidi possono essere inclusi ed altri esclusi, dunque la

membrana accettore sarà diversa da quella donatore, le cellule contengono poi proteine in grado di trasportare

fosfolipidi attraverso il citosol acquoso da un compartimento di membrana ad un altro (ad esempio il dolicolo

fosfato).

Una volta che un polipeptide entra nelle cisterne del RER, si trova ad interagire con una moltitudine di enzimi. Uno di

questi, la peptidasi del segnale (un enzima protolitico), rimuove la porzione N-terminale, mentre l’oligosaccaril-transferasi

aggiunge carboidrati alla proteina nascente. Il lume del RER è dunque la sede principale dell’elaborazione delle

proteine. Esso contiene proteine chaperon che consentono a proteine mal ripiegate di raggiungere la struttura

tridimensionale corretta. La stabilità delle proteine è invece mantenuta dalla proteina disolfuro isomerasi (PDI)

che trasforma residui di cisteina, –SH, in disolfuro ossidati, -SS. La segregazione di proteine neosintetizzate nelle

cisterne del RE le sottrae dal citosol e consente che siano modificate e spedite verso la loro destinazione. 29

La maggior parte delle proteine prodotte sui ribosomi legati alla membrana, si trasforma in glicoproteine. I gruppi

carboidratici assumono un ruolo chiave in quanto siti di legame nella loro interpretazione con altre molecole. Per

glicosilazione si intende una modificazione post-traduzionale di una proteina, che vede l'aggiunta di zuccheri (una

catena o singoli carboidrati) alla catena peptidica. La glicosilazione avviene per più motivi. Innanzitutto perché una

proteina glicosilata raggiunge un ripiegamento corretto e, in questo modo, può esplicare la propria funzione.

Inoltre la glicosilazione protegge dall'attacco di proteasi ed aumenta la solubilità della molecola proteica che viene

dunque stabilizzata in tutti gli aspetti. Infine il meccanismo glicosidico permette lo svolgimento del controllo della

qualità. Il controllo della qualità è un processo operato dalla cellula per scartare le proteine che non sono correttamente

ripiegate. Il principio di riconoscimento avviene sulla base della presenza o meno di un particolare residuo di

glucosio sulla struttura glicosidica. Per iniziare tale processo ogni glicoproteina si lega ad una proteina chaperon

(calnexina o calreticulina) e il glucosio residuo viene rimosso enzimaticamente dalla glucosidasi II e ciò porta al rilascio

della glicoproteina. Se a questo punto essa non ha ancora raggiungo il ripiegamento corretto, viene riconosciuta da

un “enzima di monitoraggio” (GT), che aggiunge nuovamente un singolo residuo di glucosio ad uno dei residui di

mannosio dell’estremità esposta dell’oligosaccaride appena generato. GT riconosce i residui amminoacidici idrofobici e

le proteine chaperon danno un’altra possibilità di ripiegarsi alla proteina. Il residuo viene poi rimosso e il processo

riprende. Se la proteina non è ancora completamente ripiegata il processo si ripete oppure resta piegata male e viene

distrutta, ad opera di un enzima ad azione lenta nel RE che taglia un residuo di mannosio da un’estremità

esposta di un oligosaccaride di una proteina che è rimasta nel RE troppo a lungo, che non potendo più

essere riutilizzata viene degradata. Nel caso in cui le proteine non correttamente ripiegate si generino nel RE ad una

velocità maggiore di quella con cui possono essere esportate nel citoplasma, viene messo in atto un meccanismo di

risposta detto risposta alle proteine non ripiegate (Unfolded Protein Respons, UPR). Il RE contiene sensori proteici

mantenuti inattivi da chaperoni molecolari (in particolare BiP), nel caso in cui si abbia un accumulo eccessivo di proteine

non ripiegate, le molecole BiP del lume vengono reclutate come chaperon. La maggior parte delle proteine che vengono

glicosilate, nelle cellule eucariotiche, è destinata a diventare proteine di membrana: le catene di zuccheri vanno a

formare infatti il glicocalice che circonda il plasmalemma. La N-glicosilazione vede l'aggiunta di una catena glucidica

standard a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di asparagina. La N-glicosilazione ha inizio nel reticolo

endoplasmatico rugoso a carico di una catena peptidica ancora in corso di traduzione. La prima fase consiste

nel trasferimento di una catena di 14 zuccheri (2 di N-acetilglucosammina, 3 di glucosio e 9 di mannosio) ad un residuo

laterale di asparagina. L'oligosaccaride è assemblato all'interno del reticolo endoplasmatico a partire da singoli

carboidrati, ed è trasferito da uno speciale enzima (la glicosil-transferasi) da una molecola di dolicolo fosfato alla

proteina, come singolo elemento. L'attacco della catena glucidica può avvenire in realtà su un'asparagina qualsiasi

presente nella sequenza Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, dove X rappresenta un amminoacido qualunque ad esclusione della

prolina. In un secondo tempo si ha la modificazione della catena di zuccheri appena aggiunta, sempre a livello del

reticolo endoplasmatico. Qui sono rimossi ogni volta dalla catena 3 residui di glucosio ed uno di mannosio (Trimming).

Le proteine che hanno subito sia la glicosilazione che la prima modificazione vengono trasportate, tramite

vescicole, all'apparato del Golgi. I siti di fuoriuscita del RER sono privi di ribosomi, dal momento che quando sono

presenti stanno effettuando una traduzione, dunque sarebbe senza senso per la cellula liberarsene.

L’apparato del Golgi

Nel reticolo endoplasmatico le vescicole gemmano da

tratti di membrane prive di ribosomi, poi, le vescicole

gemmate si fondono con altre andando a formare

vescicole voluminose e tubuli interconnessi nella

regione tra il reticolo endoplasmatico e l’apparato del

Golgi, detta regione ERGIC. La serie di vescicole e

tubuli che si forma è detta VTC: essi si allontanano

dal reticolo endoplasmatico e vanno verso il

complesso di Golgi, su “binari” costituiti da

microtubuli. Si tratta della prima tappa del traffico

vescicolare in quanto le vescicole che gemmano da

un comparto si fondono con il comparto successivo.

Il complesso del Golgi fu per la prima volta osservato

dal ricercatore Camillo Golgi nel 1898 e la sua scoperta fu del tutto casuale. Da

tempo si cercava di descrivere in modo più dettagliato la struttura citoplasmatica

delle cellule, e Golgi in quell’occasione era impegnato nella colorazione di cellule

nervose; utilizzando nitrato d’argento e poi andando a osservare le sezioni che

aveva ottenuto in quei campioni cellulari, scoprì all’interno del citoplasma una

struttura molto ordinata, ripetuta più volte, e costituita da cisterne ordinatamente

impilate, e in prossimità di queste cisterne notò delle vescicole. Nel 1906, questa

scoperta gli permise di ottenere il premio Nobel, ma inizialmente un gruppo di

ricercatori aveva attribuito a questa scoperta un significato completamente diverso,

in quanto affermarono che si doveva trattare di un artefatto della colorazione,

perciò non venne attribuito subito un ruolo biologico a questa struttura, ma solo

dopo altri esperimenti di Golgi effettuati anche cambiando i modelli cellulari in 30

considerazione. La caratteristica fondamentale è il fatto che in prossimità delle cisterne sono presenti delle vescicole,

quindi al Golgi è stato attribuito un ruolo di traffico vescicolare. Potrebbe essere definito come un insieme di cisterne

pseudoappiattite (da 3 a 20 circa. Struttura a piatti impilati, il concetto di appiattite serve a discriminare questa struttura

da una struttura tubulare), tutte impilate una sopra l’altra; più strutture di questo tipo possono essere presenti all’interno

della cellula, tutto dipende dalla bassa o dall’intensa attività di elaborazione di proteine in cui la cellula è impegnata (se il

RER è abbondante, anche l’apparato di Golgi sarà estremamente sviluppato).

Si può identificare questo apparato come un apparato con una polarità, che consiste nel fatto che c’è la presenza di una

rete cis-Golgi (CGN) e di una rete trans-Golgi (TGN): la faccia cis e la faccia trans sono disposte, entrambe con una

struttura vescicolo-tubulare, alle due estremità delle pile, e all’interne ci sono le cisterne.

Verso il lato cis si trova il RER (sopra al quale c’è la cisterna perinucleare nel nucleo), mentre il lato trans è rivolto verso

la membrana plasmatica; all’interno di una cellula questa polarità non può non essere rispettata, perché la faccia cis è

quella di formazione, riceve le vescicole che arrivano da reticolo e si fondono tra di loro, mentre la faccia trans è quella

di dissociazione, dalla quale si staccano vescicole con prodotti ormai maturi e pronti ad essere smistati e a raggiungere la

destinazione finale. Perciò ogni pila presente in una cellula deve rispettare questa conformazione, in quanto il

direzionamento dei vari prodotti può avvenire in modo corretto solo se ogni componente è orientato giustamente

all’interno della cellula.

Si pensa che un gruppo di proteine fibrose intervenga nel definire quella che viene chiamata “matrice di Golgi”, che

viene coinvolta nell’assemblare e disassemblare le cisterne, tutte le volte in cui c’è una mitosi. La mitosi è un processo

estremamente importante per una cellula, che impone ad essa un cambiamento notevole nella sua organizzazione

citoplasmatica, è il momento in cui la cellula deve duplicare se stessa, ma per poterlo fare ogni cellula somatica che va

incontro a mitosi deve prima aver duplicato il patrimonio genetico, deve accrescersi, duplicare gli organeli, e distribuire il

tutto in modo adeguato. Il materiale genetico contenuto all’interno di una cisterna perinucleare non può essere reso

disponibile direttamente alle fibre del fuso mitotico che dovranno garantirne un’adeguata divisione, ma la cisterna

perinuclare deve scomparire, quindi si dissocia e scompare momentaneamente, per poi ritornare ad assemblarsi quando

le due cellule figlie sono orami formate, e questo rimodellamento sembra interessare anche l’apparto del Golgi.

Si pensa inoltre che le cisterne del Golgi, affinché possano mantenere la loro particolare conformazione (non

perfettamente piatta, ma leggermente arcuata) abbiano bisogno di determinate proteine che permettano loro questa

particolarità. Perciò il Golgi è un complesso estremamente duttile.

Nel complesso del Golgi (è definito complesso perché è una struttura per nulla semplice) ogni struttura è a sé stante, ad

ogni cisterna è stata attribuita una particolare capacità dovuto ai diversi enzimi che contiene: ogni cisterna ha un corredo

enzimatico o proteico diverso, ognuno dei quali è funzionale per il processamento della catena polipeptidica appena

sintetizzata.

Nel Golgi continua la glicosilazione che era iniziata nel RER e che dipende da glicosil-transferasi. Le proteine passando da

una cisterna all’altra incontrano enzimi diversi e se necessario vengono modificate, altrimenti, se non ne necessitano,

non subiscono modificazioni; possono anche esserci rimozioni di oligosaccaridi acquisiti a livello del reticolo, di residui di

mannosio, e attacchi di altri zuccheri (a livello del RER le prime catene oligosaccaridiche che vengono attaccate sono

indispensabili affinché la catena polipeptidica possa essere riconosciuta dalle chaperonine, ma completato questo lavoro,

se non sono più necessarie, a livello del Golgi vengono staccate queste catene oligosaccaridiche e vengono attaccate

quelle necessarie per completare i processi).

L’apparato di Golgi è una struttura molto dinamica, le cisterne si formano man mano che le vescicole si aggiungono, ma

nello stesso tempo si dissolvono man mano che le vescicole fuoriescono. Questa dinamicità ha un aspetto positivo

perché risponde molto bene alle esigenze della cellula, ma da un punto di vista sperimentale, per i ricercatori, ha recato

non pochi problemi in quanto si è dovuto capire come avviene il trasferimento delle molecole che arrivano dal RER e

come arrivano alla destinazione finale.

All’interno di ogni cisterna c’è un particolare corredo di enzimi. Nella prima cisterna iniziano ad essere decisi il ruolo e la

destinazione delle proteine, che quindi vengono smistate. All’interno di questa prima cisterna potrebbe avvenire la

fosforilazione di oligosaccaridi con l’obiettivo di destinarle ai lisosomi (vescicole all’interno di una cellula contenenti

enzimi litici), quindi all’interno della prima cisterna c’è un corredo di enzimi capace di riconoscere le proteine a destino

lisosomiale e di fosforilarle. Nella cisterna successiva si possono trovare degli enzimi capaci di riconoscere molecole di

mannosio e di staccarle dalle catene polipeptidiche, in modo da prepararle a legare altre catene oligosaccaridiche. Nella

terza cisterna continua la rimozione del mannosio e potrebbero essere aggiunte altre catene oligosaccaridiche, come per

esempio N-acetilglucosammina, quindi la catena polipeptidica acquisisce una particolare categoria di oligosaccaridi. Nella

cisterna successiva viene aggiunto galattosio, e potrebbe anche essere aggiunta una molecola in cui acronimo è NANA,

Acido N-acetilneuraminico, che è estremamente importante perché conferisce cariche negative alla catena

oligosaccaridica. Man mano che la proteina passa da una cisterna all’altra, incontrando corredi enzimatici diversi, può

perdere o acquisire dei gruppi saccaridici, quindi modificare o arricchire la componente oligosaccaridica. L’ultima

possibilità è quando la proteina si trova nella cisterna volta sul lato trans del Golgi, dove può avvenire una solfatazione,

possono cioè venire legati gruppi zolfo a particolari amminoacidi della catena polipeptidica, le pirosine, o a livello della

componente carboidratica. L’ultima cisterna si dissolve poi in tante vescicole che vengono indirizzate a seconda del

contenuto proteico. Il traffico di una via biosintetica segue in modo preciso un traffico di membrane.

Se molecole di zucchero, di varie tipologie, devono essere legate alle catene polipeptidiche, devono innanzitutto essere

capaci di dare origine a legami covalenti (che richiedono una certa quantità di energia): i precursori delle componenti

31

saccaridiche sono nucleotidi glicosilati, come uracil-di-fosfato-glucosio, UDP-galattosio, UDP-N-acetilglucosammina, GDP-

mannosio, GDP-N-fucosio, CMP-acido-N-acetilneuraminico (NANA). Quindi se all’interno di ogni cisterna uno di questi

zuccheri deve essere legato alla catena polipeptidica che sta per essere modificata nella sua tipologia in termini di

oligosaccaridi, all’interno di ogni cisterna devono esserci dei particolari enzimi che riconoscono la tipologia di catena in

questione e legano la giusta componente (tenere comunque presente che ciò che può essere legato a livello delle

cisterne del Golgi non è necessariamente un componente definitivo, ma potrebbe essere modificato nelle cisterne

successive). Dunque l’oligosaccaride deve essere in grado di instaurare dei legami covalenti con i gruppi R

dell’amminoacido della catena polipeptidica e la glicosilazione del gruppo R dipende anche dalla conformazione

tridimensionale della proteina che deve esporre i gruppi R che devono essere glicosilati.

Il lavoro svolto dalle cisterne del Golgi non è semplicemente confinato alla glicosilazione di una catena polipeptidica, ma

sta anche nel riconoscere quali catene e quali amminoacidi delle catene devono essere glicosilati e nel mettere in atto

tutti i meccanismi se sono a disposizione gli enzimi necessari.

I ricercatori hanno messo in atto una

serie di esperimenti per tentare di capire

come si comporta l’apparato del Golgi

nei confronti dei prodotti che derivano

dal RER e che devono essere veicolati

verso il loro obiettivo finale. Ad oggi

coesistono 2 teorie ed evidenze

sperimentali e morfologiche appoggiate

anche ad un’analisi chimica, sembrano

dare ragione ad entrambi i modelli:

modello di maturazione delle

cisterne e modello del traffico

vescicolare. Entrambi i modelli sono

ancora in discussione.

- Modello del traffico vescicolare

Il concetto che prende in considerazione è quello per cui dal Golgi si staccano delle vescicole, si fondono tra di loro

dando origine alla regione ERGIC, da cui si formano poi le cisterne, da ogni cisterna si stacca una vescicola con carico in

maturazione e alla fine, dalla regione trans, si stacca la vescicola finale che va alla membrana plasmatica.

È l’esempio più semplice e venne avanzato nel periodo che va dalla metà degli anni ’80 alla fine degli anni ’90. A favore

di questo modello ci sono il fatto che le varie cisterne contengono una popolazione distinta di enzimi e il fatto che nelle

foto al microscopio elettronico si può vedere un gran numero di vescicole che gemmano dai margini delle cisterne del

Golgi.

- Modello di maturazione delle cisterne

È stata la prima teoria avanzata all’inizio degli anni ’80. Tutto parte sempre da un insieme di vescicole che originano dal

RER, formano la regione ERGIC, e poi danno origine a una cisterna, nella quale oltre ai materiali in maturazione è

presente una massa molto voluminosa. Secondo questo modello, essendoci una molecola troppo voluminosa per poter

uscire dal lume del Golgi passando per le cisterne, tutta la cisterna stessa, dopo un certo intervallo di tempo, diventa la

cisterna successiva, si sposta per formare le altre cisterne, e si dissolve; quindi non esistono tante cisterne, ma la

cisterna iniziale si muove fisicamente dalla faccia cis verso la faccia trans della pila cambiando composizione durante la

progressione (le critiche al modello basate sul fatto che si prende in considerazione una sola cisterna, mentre al

microscopio se ne vedono più di una, sono state giustificate dicendo che dal RER si staccano in continuazione vescicole

che vanno a costituire nuove cisterne che si spostano nelle posizioni lasciate libere dalle cisterne precedenti in

maturazione). Secondo questo modello sembra quindi che il prodotto di ogni cisterna non esca tramite vescicole, non ci

sono vescicole che si staccano perché è tutta la cisterna che procede nella maturazione del materiale al suo interno.

Delle vescicole sono presenti, ma seguono la direzione opposta, dall’ultimo stadio di maturazione verso il lato trans si

staccano delle vescicole che tornano indietro perché contengono gli enzimi: l’ultima cisterna che contiene i prodotti

pronti per essere esocitati contiene anche un corredo di enzimi che la cellula concentra in vescicole che tornano indietro

e andranno a fondersi con la nuova cisterna, contenente i prodotti derivati dal RER, che verrà a formarsi.

A favore di questo modello ci sono il fatto che l’apparato del Golgi è estremamente dinamico (in accordo con questa

visione, il Golgi esiste perché dipendente dal continuo afflusso di trasportatori dal RE all’ERGIC), il fatto che alcuni

materiali prodotti nel RE che viaggiano attraverso il Golgi rimangono all’interno delle sue cisterne e non compaiono mai

come vescicole di trasporto associate al complesso (per esempio le molecole di precollagene nei fibroblasti, sono

molecole metabolicamente molto attive presenti nel tessuto connettivo, dove sono responsabili della produzione di

matrice extracellulare), il fatto che sono state osservate vescicole con un movimento retrogrado dalla faccia trans alla

faccia cis, e il fatto che la composizione di una cisterna individuale del Golgi può variare nel tempo (per esempio da una

contenente proteine del Golgi precoci a una contenente proteine del Golgi tardive). 32

L’elevata dinamicità del Golgi rende difficile chiarire quale dei 2 modelli è quello più valido, e non ci si può basare su

delle analisi biochimiche perché sottintendono la distruzione della cellula, devono essere quindi effettuate delle analisi

morfologiche al microscopio elettronico, con marcatura di specifiche catene polipeptidiche o del corredo enzimatico

all’interno della cellula che devono dare ragione di come avvengono i processi (ma anche in questo caso è molto difficile,

perché nell’arco di pochissimo tempo avvengono moltissimi cambiamenti).

Riassumendo…

Il sistema di endomembrane è una rete dinamica e integrata in cui i materiali vengono trasportati avanti e indietro da un

distretto all’altro tramite vescicole La vescicola di trasporto si stacca dal RER e viene indirizzata al complesso del Golgi

Dal Golgi gemma una vescicola che va alla membrana di un organulo accettore o alla membrana plasmatica che

riceve il materiale trasportato e la membrana della vescicola Il trasporto è regolato da “binari”, ovvero dai microtubuli.

Una proteina di membrana viene subito inserita nel doppio strato fosfolipidico con l’orientamento definitivo, le catene

oligosaccaridiche vengono aggiunte sempre sul lato cisternale.

A livello del Golgi viene sintetizzata anche un’altra grossa popolazione di molecole, i polisaccaridi complessi, come i

glicosamminoglicani (GAG, componente importante della matrice extracellulare dei tessuti connettivi), le pectine e

l’emicellulosa (che si associa alla cellulosa per andare a costituire la parete delle cellule vegetali, ma dal punto di vista

strutturale l’emicellulosa è diversa in quanto la cellulosa è un omopolimero e nel nostro organismo non può essere

scissa, mentre l’emicellulosa è formata da molecole di zuccheri diversi ed è ramificata e, legando l’acqua, nel transito del

cibo all’interno dell’intestino va a idratare. Si conoscono 3 tipi di emicellulosa: gli xilani, il mannano).

Le vie secretorie

Sono state descritte, all’interno di una cellula, 3 vie secretorie: via secretoria costitutiva, via secretoria regolata, via

endocitica.

- Via secretoria costitutiva La cellula fa questo processo in modo continuo (costitutivo = continuo). Il materiale

prodotto nel RER passa al Golgi e dal Golgi gemmano le vescicole. È un processo continuo, non ci sono momenti di

stop. Man mano che queste vescicole vengono prodotte, e vengono chiamate vescicole che dal sito di sintesi

vengono trasportate al comparto accettore, saranno scaricate continuamente verso l’esterno o indirizzate

all’organulo accettore. Un esempio sono le ghiandole unicellulari mucipare che sono situate a livello dell’epitelio

intestinale, producono mucina che continuamente viene riversata dove è necessario sulla superficie delle cellule

dell’epitelio. Tutti quegli elementi che vanno a costituire una matrice extracellulare vengono periodicamente

rinnovati, perciò quelle cellule (es. fibroblasti) continueranno a produrre elementi da sostituire a ciò che viene

degradato.

- Via secretoria regolata Il meccanismo di produzione e di modificazione dei prodotti segue una via che

fondamentalmente è quella della secrezione costitutiva, però i materiali una volta pronti non vengono

necessariamente portati subito a destinazione, ma vengono accumulati in ghiandole secretorie e scaricati solo in

seguito ad una richiesta portata da uno stimolo. L’esempio è quello dei granuli di zimogeno: la cellula produce e

accumula in un distretto ben preciso del suo citoplasma i granuli e quando dall’esterno arriva un segnale questi

granuli vengono esocitati. È l’esempio anche delle cellule endocrine che rilasciano ormoni o degli acini pancreatici

che producono enzimi digestivi.

- Via endocitica Questa via si discosta completamente dalle prime due per la direzione: la via costitutiva e quella

regolata vanno dalla regione centrale della cellula verso la periferia, mentre la via endocitica permette di trasportare

i materiali dalla superficie della cellula, di endocitarli e di smistarli verso endosomi e lisosomi (che spesso lavorano

insieme). Un prodotto che dalla superficie cellulare viene endocitato, contenuto nella vescicola, dà origine agli

endosomi, che possono essere indirizzati verso i lisosomi, e, fondendosi, gli enzimi dei lisosomi digeriscono il carico

dell’endosoma stesso. È un modo ad esempio per enzimare dall’ambiente extracellulare il materiale che deve essere

degradato. L’endosoma è una vescicola che è capace, grazie alla presenza di un recettore a livello della membrana

plasmatica, di legare un prodotto che sta all’esterno; questo complesso recettore-prodotto viene inserito a livello di

una porzione di membrana plasmatica che porta alla formazione di una vescicola, che prende il nome di endosoma

precoce. L’endosoma precoce contiene un recettore a livello della sua membrana, legato al prodotto di cui si è

caricato; il recettore è importante perché è specifico e riesce a legare non molecole qualsiasi, ma specifiche

molecole che stanno all’esterno. L’endosoma regola lo smistamento della via endocitica diretta verso l’interno: alcuni

recettori escono per gemmazione, altri finiscono nei lisosomi per essere degradati (sembra essere il destino della

maggior parte del contenuto endosomico). La via endocitica è una via estremamente importante per eliminare

molecole che sulla superficie della cellula possono essere indesiderate, o molecole che dal Golgi devono essere

orientate verso un lisosoma. A livello dell’endosoma bisogna aspettarsi un ambiente acido, in quanto ci si aspetta

che un recettore venga staccato dalla sua molecola di carico, e l’ambiente acido induce i recettori a staccarsi dal loro

bagaglio molecolare. Durante questo processo, sulla superficie della cellula via via vengono persi dei recettori, ma

una secrezione costitutiva può riposizionare dei recettori sulla membrana plasmatica. Le proteine possono seguire il

destino del loro recettore, ossia essere veicolate insieme ad esso nei lisosomi dove verranno degradate. Si parla di

endosoma tardivo per indicare un endosoma in una fase molto avanzata, dove il suo contenuto sa già che destino

deve subire. 33

Meccanismi di controllo che agiscono sulla via biosintetica

Le vie sintetiche rispondono ad un’esigenza secretoria o a un’esigenza endocitica, ognuna delle quali deve essere

controllata, in quanto entrambe uniscono le endomembrane, in una direzione o nell’altra. Questa rete interconnessa

garantisce cicli ripetuti di vescicole che si staccano da un comparto e che arrivano ad un altro comparto e che

sottintendono la formazione di vescicole che vengono trasferite da un comparto donatore ad un comparto accettore.

Chi decide quale porzione di membrana che si stacca dal comparto donatore entrerà a far parte della vescicola?

Pensando al RER non sicuramente i tratti con i ribosomi che stanno sintetizzando o a livello delle proteine

transmembrana. Non da tutti i punti della membrana possono formarsi delle vescicole, ma la membrana deve

estroflettersi affinché si formi una vescicola, e non è un evento del tutto spontaneo, inoltre le due estremità della

struttura che si sta formando dovranno poi avvicinarsi per creare la vescicola ben definita (la cellula per fare tutto ciò

consuma energia). Occorre quindi che ci siano un controllo, perché la vescicola giunga a destinazione, e un aiuto, perché

la vescicola si formi.

In termini generali si parla di un comparto donatore e di un comparto accettore: uno dona un tratto di membrana

cellulare per formare una vescicola, l’altro accetta il tratto di membrana cellulare. Ma la vescicola non è vuota, quindi

non si tratta solo di un trasferimento di membrane, ma anche di un trasferimento di prodotti. A livello della membrana

cellulare del comparto donatore c’è anche una proteina transmembrana (quindi le 2 tipologie di molecole sono quelle

transmembrana e quelle solubili, che stanno nel lume della cisterna). A livello della porzione di membrana che sta

formando la vescicola, nella vescicola, al di là della proteina transmembrana, ci sono dei recettori che riconoscono e

agganciano le molecole di interesse, si verrà quindi a formare una vescicola che trasporta una proteina transmembrana e

2 molecole solubili; il legame persiste all’interno della vescicola finché essa non si fonde con il comparto accettore, dove

c’è un enzima capace di scindere il legame tra carico da trasportare e altre molecole.

Destino di una proteina mal sintetizzata:

a livello del RER può esserci un inizio di glicosilazione e c’è un meccanismo di riconoscimento mediato dalle chaperonine,

che se riconoscono che una proteine è mal conformata la “etichettano” in modo che venga bloccata a livello del reticolo

e non possa essere trasferita nel Golgi, e ci sono enzimi che intervengono affinché la proteina riveda il suo ripiegamento.

Se dopo altri tentativi la proteina non raggiunge la conformazione giusta, deve essere eliminata, ma non veicolata verso

il Golgi, ma indirizzata (si parla di dislocazione delle proteine) verso un proteosoma, ovvero un complesso proteico

localizzato nel citoplasma, dove verrà digerita e i suoi amminoacidi costitutivi verranno rilasciati nel citoplasma.

Si è visto che a livello della membrana del reticolo c’è un complesso di proteine, che sono state chiamate proteine

traslocatrici, tra le quali c’è una proteina accessoria di uscita. Questo complesso proteico riconosce la proteina mal

conformata che è stata glicosilata, e staccata dalla molecola chaperon essa trasloca verso l’ambiente citosolico (non deve

però essere confusa con una proteina ad uso citosolico); a questo punto interviene un enzima, l’N-glicanasi, che stacca

la componente oligosaccaridica e nello stesso tempo la proteina viene marcata da molecole di uvipitina (si parla di

uvipitinazione delle proteine). Tutto ciò che viene uvipitinato all’interno di una cellula è destinato ad essere degradato.

Questo è un modo per la cellula di bloccare si dall’inizio, appena avvenuta la traduzione della catena polipeptidica,

qualsiasi polimero che non riesce a ripiegarsi in modo corretto, che coinciderebbe con una mancata funzionalità della

proteina stessa.

Lungo la via biosintetica dunque i materiali sono trasportati in vescicole che gemmano dalle membrane donatrici e si

fondono con membrane accettrici. La maggior parte di queste gemme è rivestita da uno strato proteico elettron-denso

costituito da proteine solubili che si accumulano sul versante citosolico della membrana donatrice nei siti dove

avviene la gemmazione. Ogni gemma rivestita si distacca a formare una vescicola rivestita. I rivestimenti hanno

funzione: meccanica, in quanto inducono la cellula a piegarsi, e di selezione dei componenti da trasportare, cioè il

carico da trasportare e il macchinario richiesto per indirizzarlo alla membrana ricevente. Il rivestimento è costituito da un

doppio strato: uno esterno, che forma un'impalcatura e uno interno di ad attori che servono per legare il carico,

dunque selezionano specifiche molecole. Le vescicole rivestite più studiate sono:

- Vescicole rivestite da COPII, che spostano materiali dal RE all'ERGIC e al complesso del Golgi Mediano la

prima tappa della via biosintetica. Gli anticorpi anti-proteine del rivestimento bloccano la gemmazione delle

vescicole dalla membrana del RE. I rivestimenti concentrano determinati componenti che trasportano. Alcune

proteine di membrana, come enzimi che agiscono in altre fasi della via, proteine della membrana addette

all'aggancio e alla fusione della vescicola, proteine della membrana che possono legare un carico solubile,

contengono "segnali di esportazione dal RE" che interagiscono specificamente con le proteine COPII. Fra la

proteine del COPII c'è una proteina G molto piccola, detta Sar1, che inizia la formazione di vescicole e regola

l'assemblaggio del rivestimento delle vescicole. In una prima fase la Sar1 è indotta a scambiare il GDP per una

molecola di GTP, questo causa la seconda fase, ovvero il cambiamento conformazione della sua N-terminaleche

α-β

si inserisce nel foglietto citosolico del bilayer RE. Questo causa un ripiegamento del bilayer lipidico,

probabilmente agevolato da una variazione nell'impacchettamento dei lipidi che compongono i due foglietti. In

una terza fase il Sar1-GTP ha reclutato due polipeptidi addizionali, Sec23 e Sec24, che si legano come un dimero ed

esercitano una ulteriore pressione che aiuta la superficie della membrana a ripiegarsi. Sec24 funziona anche come

una proteina adattatrice primaria che interagisce specificamente con i segnali di esportazione dal RE

localizzati nella coda citosolico e delle proteine di membrana destinate ad essere indirizzate al complesso di Golgi.

Nella quarta tappa le subunità rimanenti si legano alla membrana a formare l'impalcatura del rivestimento proteico,

di diametro variabile. Sec24ha una grande flessibilità ed esiste in quattro diverse isoforme che probabilmente

34

riconoscono e legano proteine di membrana con diversi segnali di smistamento, ampliando la specificità del

materiale che può essere trasportato dal COPII. Prima che la vescicola si fonda con le vescicole bersaglio, il

rivestimento deve essere disassemblato, grazie all'idrolisi del GTP che produce una subunità Sar1-GDP con

minore affinità per la membrana della vescicola e i relativi componenti liberati nel citosol.

- Vescicole rivestite da COPI, che spostano il materiale in senso retrogrado, dall'ERGIC e dal Golgi verso il RE e

dalle cisterne trans a quelle cis Anche le vescicole rivestite da COPI contengono una proteina che si lega al GTP,

detta ARF1, il cui GTP deve essere idrolizzato prima che il rivestimento si possa disassemblare. Le proteine vengono

mantenute in un determinato organello tramite la ritenzione delle molecole residenti che sono escluse dalle

vescicole di trasporto e che può essere basata principalmente sulle proprietà fisiche della proteina, e il

recupero di molecole “sfuggite”. Le proteine che normalmente risiedono nel RE contengono alla loro estremità C-

terminale corte sequenze di amminoacidi che servono da segnali di recupero. Le proteine solubili del lume del RE

possiedono il segnale di recupero “lys-asp-glu-leu”, anche detto KDEL, e vengono riconosciute dal recettore KDEL,

che dunque le riporta nel RE in una vescicola ricoperta da COPI. Se da una proteina viene eliminata tale sequenza,

non viene restituita al RE, ma trasportata in avanti nel complesso di Golgi con un conseguente impoverimento del

corredo proteico del RER. Al contrario, se una cellula viene modificata geneticamente per esprimere una

proteina lisosomiale o di secrezione contenente un segnale KDEL, essa viene riportata al RE invece di essere

indirizzata nella giusta direzione, causano un aumento di enzimi lisosomiali dei quali la cellula non sa cosa farsene.

Le proteine di membrana del RE invece presentano un segnale di recupero all’estremità C-terminale KKXX,

dove K è la lisina e X qualsiasi amminoacido, che si lega al rivestimento COPI, facilitando il ritorno al RE

stesso. Per quanto riguarda lo smistamento e il trasporto di enzimi lisosomiali, le proteine lisosomiali sono

sintetizzate sui ribosomi associati al RER e trasportate poi al complesso di Golgi con altre proteine. Una volta

arrivate al Golgi le proteine solubili lisosomiali vengono riconosciute da enzimi che in due tappe catalizzano

l’aggiunta di un gruppo fosfato a certi zuccheri mannosio delle catene idrocarburiche legate all’azoto. Tali enzimi,

detti mannosio 6-fosfato, possiedono residui di mannosio fosforilati che funzionano come segnali di riconoscimento

per i recettori per il mannosio 6 fosfato (MPR), che sono proteine integrali di membrana che attraversano le

membrane del TGN. Gli enzimi lisosomiali vengono trasportati dal TGN in vescicole ricoperte da clatrina.

- Vescicole rivestite da CLATRINA, che spostano il materiale dal TGN a endosomi, lisosomi, vacuoli delle cellule

vegetali, ma anche materiali dalla membrana ai compartimenti citoplasmatici Al loro esterno vi è una gabbia a

nido d’ape composta, appunto, da clatrina, mentre il guscio interno è composto da complessi proteici detti

adattatori, ovvero molecole che si legano fisicamente a due diverse tipologie di materiale, in particolare dai

GGA. Queste molecole presentano diversi domini, le estremità esterne si legano alla clatrina, arrestando

l’impalcatura, all’interno si legano ad un segnale di smistamento per i MPR. IMPR della membrana del TGN e gli

enzimi lisosomiali del lume del TGN si concentrano nelle vescicole rivestite da clatrina. Inizia quindi il

reclutamento sulla membrana di una piccola proteina G, ARF1, che prepara il terreno per il legame di

altre proteine di rivestimento. Dopo che la vescicola è gemmata dal TGN, perde il rivestimento e procede verso la

sua destinazione, ma prima di raggiungerla i MPR si dissociano dagli enzimi lisosomiali e ritornano al TGN.

Per le proteine non lisosomiali ancora non si è certi di quali siano i meccanismi di smistamento e trasporto.

Secondo un modello recente vi sarebbero trasportatori membranosi prodotti quando il TGN si frammenta in vescicole e

tubuli di diverse dimensioni. Si pensa che le proteine che sono esportate dalla cellula mediante un processo di secrezione

regolata, come nel caso degli enzimi digestivi e degli ormoni, formino aggregato che poi vengono accumulati in grossi

granuli secretori densamente impacchettati. In alcune cellule sono osservabili tubuli che lasciano il TGN mediante

proteine motrici e che si suddividono in un serie di vescicole o granuli per la fissione delle membrane. Una volta lasciato

il TGN, il contenuto dei granuli diviene sempre più concentrato e vengono poi immagazzinati nel citoplasma. Il

trasporto delle proteine integrali di membrana verso la membrana plasmatica dipende da segnali di smistamento

presenti nei domini citoplasmatici delle proteine stesse. Se una cellula è polarizzata le proteine integrali

contengono particolari segnati per essere inviate nella giusta direzione, se non è polarizzata potrebbe non contenerne.

Indirizzamento delle vescicole in un determinato compartimento

La fusione selettiva è uno dei fattori che assicura un flusso altamente direzionale attraverso i compartimenti

membranosi della cellula. Diverse sono le fasi che portano dalla gemmazione alla fusione:

- Movimento della vescicola verso il compartimento bersaglio specifico attraverso il citoplasma grazie ai

microtubuli.

- Ormeggio delle vescicole al compartimento bersaglio mediato da proteine di ormeggio distinte in 2 gruppi: quelle

a forma di bacchetta, proteine fibrose in grado di formare un ponte molecolare tra due membrane poste a distanza

considerevole (50-200 nm), e i grandi complessi multiproteici, che mantengono le membrane ad una distanza più

ridotta. L’ormeggio è una fase molto specifica e tale specificità è conferita da una famiglia di proteine G, detta

Rab, che passa ciclicamente dallo stato attivo a quello inattivo. Quando legate al GTP, quindi attive, si associano

alle membrane attraverso un’ancora lipidica e reclutano proteine citosoliche di ormeggio a superfici di membrana

specifiche. Queste proteine svolgono un importante ruolo regolativo dell’attività di numerose altre proteine coinvolte

in vari aspetti del traffico vescicolare.

- Attracco delle vescicole al compartimento bersaglio grazie all’interazione tra le regioni citosoliche delle proteine

integrali delle due membrane. Quelle più importanti che si agganciano in tali interazioni sono dette SNARE e

costituiscono una famiglia di più di 35 proteine integrali di membrana, localizzate in specifici comparti

subcellulari. Variano in struttura e dimensione e contengono un segmento nel loro dominio citosolico

35

chiamato motivo SNARE, costituito da 60-70

aminoacidi in grado di formare un complesso con un

altro motivo SNARE. Le SNARE sono divise in due

categorie, le v-SNARE, incorporate nelle membrane delle

vescicole di trasporto durante la gemmazione, e le t-

SNARE, situate nelle membrane del compartimento

bersaglio.

- Fusione tra la vescicola e la membrana bersaglio.

Per questa fase non è sufficiente l’interazione tra le v- e le

t-SNARE. Quando un fascio a quattro filamenti della

SNARE resta bloccato in una conformazione inattiva

da interazioni con altre proteine associate, le vescicole

restano attraccate alla membrana e sono pronte a riversare i loro contenuti quando ricevono un segnale

di attivazione. Quando il doppio strato lipidico delle membrane si fonde, le SNARE si trovano nella stessa

membrana ed è dunque necessaria la loro dissociazione, che avviene ad opera di una proteina citosolica a

forma di ciambella, detta NSF, che si attorciglia attorno al fascio di SNARE e lo spezza in due, sfruttando

l’energia fornita dall’idrolisi di ATP.

L’esocitosi è la fusione di una vescicola secretoria o di un granulo secretorio con la membrana plasmatica e la

conseguente estrusione dei suoi contenuti. Uno dei casi meglio studiati è quello della secrezione regolata, durante la

quale la fusione delle membrane produce un’apertura da cui il contenuto dei granuli viene rilasciato nello spazio

2+

extracellulare. In altri tipi di cellule, l’esocitosi è solitamente innescata dal rilascio di Ca da depositi citoplasmatici.

Si pensa che il contatto vescicola-membrana porti alla formazione di un piccolo “poro di fusione” circondato da proteine.

Alcuni pori possono richiudersi ma la maggior parte si dilata per formare un’apertura per l’estrusione del contenuto

vescicolare.

Il citoscheletro

Il citoscheletro è una complessa rete interattiva costituita

da microtubuli, filamenti intermedi e

microfilamenti (o filamenti di actina), che va a

supportare le cellule compiendo diverse funzioni. È

un’impalcatura dinamica, deve conferire forma alla cellula

e nello stesso tempo deve resistere a forze che tendono a

deformarla. Non è stabile nel tempo, ma si crea e si

disorganizza in tempi molto brevi. Forma un reticolo

interno che determina la posizione degli organuli (per

esempio, i microtubuli creano delle specie di binari per le

vescicole). Regola i movimenti di organelli e materiale che

la cellula deve smistare in modo corretto (per esempio

RNA messaggero). È un apparato (perché è un insieme di

strutture filamentose o tubulari, che creano parete) che

genera le forze che determinano lo spostamento di

cellule, è quindi una struttura molto flessibile. È anche un

macchinario per la divisione cellulare: gli elementi del

citoscheletro formano il fuso mitotico e l’anello contrattile.

In ognuna di queste caratteristiche possono non entrare

in gioco tutte e 3 le componenti, ma anche solo una o due (in un certo momento della divisione cellulare i microtubuli,

che sono strutture altamente dinamiche, devono accorciarsi per favorire la migrazione del materiale genetico ai poli della

cellula). Ogni elemento del citoscheletro ha una particolare dimensione, struttura, distribuzione intracellulare. Ogni

componente citoscheletrica è il risultato di un processo di polimerizzazione di specifici monomeri, che la cellula ha

all’interno del proprio citoplasma.

Fino a un po’ di anni fa si pensava che il citoscheletro fosse una peculiarità solo delle cellule eucariotiche, ma questa idea

è andata scomparendo perché si è visto che componenti proteiche paragonabili a microtubuli o a microfilamenti sono

presenti anche nelle cellule procariotiche, e sembrano svolgere la medesima funzione (ovviamente nelle cellule

procariotiche non c’è un traffico vescicolare, però c’è l’esigenza di distribuire dei tratti di RNA). In seguito si è visto che

anche proteine simili a filamenti intermedi sono presenti anche nelle cellule procariotiche. Di conseguenza l’idea che il

citoscheletro fosse una peculiarità solo delle cellule eucariotiche è stata accantonata, anche se, ovviamente, alle

componenti proteiche non si può associare la stessa funzione.

I filamenti intermedi sono strutture filamentose, ma hanno una conformazione diversa rispetto a quella dei filamenti di

actina. I filamenti di actina si attorcigliano e la loro struttura è molto meno resistente rispetto a quella dei filamenti

intermedi, che se sottoposti a trazione resistono a lungo.

Filamenti intermedi, microfilamenti e microtubuli sono dei polimeri che necessitano di sub-unità proteiche per la loro

organizzazione. Le sub-unità proteiche non rimangono sparse all’interno della cellula, ma si trovano in un pool di

proteine. 36

I filamenti intermedi devono rispondere ad una resistenza meccanica, quindi devono contrastare un’azione meccanica,

tale per cui devono essere fibre robuste. Le cheratine sono un esempio di filamenti intermedi. Hanno un diametro di

circa 8-10 nm.

I microfilamenti (filamenti di actina) sono delle strutture piene (come 2 file di perle che si avvolgono l’una rispetto

all’altra. Rispetto alle altre 2 componenti sono le più sottili, e spesso formano reti ramificate. Questo presuppone la

presenza di proteine, le proteine leganti l’actina, che intervengono nello stabilizzare la polimerizzazione dei filamenti di

actina o li disassemblano a seconda delle esigenze della cellula. Hanno un diametro di circa 6 nm.

All’interno del citoscheletro, a livello dei filamenti intermedi, sono presenti i desmosomi, ovvero tipiche giunzioni cellulari.

I microtubuli

I microtubuli sono delle strutture altamente dinamiche. Si possono definire come dei lunghi tubi (cavi), rigidi (perché

devono rappresentare un binario per le vescicole), non ramificati. Hanno un diametro esterno di 25 nm e una parete

dello spessore di circa 4 nm. I monomeri che entrano in gioco per formarli sono 2: monomeri e monomeri Sono

α β.

dunque degli eterodimeri, asimmetrici, dal momento che una

estremità termina con una (estremità meno, è quella

α-tubulina

in cui si trova il centro di nucleazione) e l’altra termina con una β-

tubulina (estremità più). Vengono chiamati microtubuli perché le

loro dimensioni in termini di diametro sono micrometriche (micro)

e perché sono delle strutture cave (tubuli). La parete che delimita

queste strutture è fatta da tubulina, mentre all’interno sono cave.

Delle 3 tipologie è quella meno adatta per ottenere resistenza,

infatti, non ci sono praticamente mai dei microtubuli associati o a

formare giunzioni per garantire resistenza creare strutture che

devono garantire una tensegrità, ma intervengono nel creare

binari su cui mediare il traffico cellulare, nel creare strutture

altamente dinamiche come il fuso mitotico, e nel creare ciglia o

flagelli come supporto di estroflessioni citosoliche (ciglia e flagelli

si muovono, sono strutture che bruciano ATP per poter

funzionare).

Ogni fila di proteine aggregate viene chiamata protofilamento, e

si unisce con altri protofilamenti grazie a legami non covalenti,

che stabilizzano ogni protofilamento con l’altro. Visto che sono

strutture altamente dinamiche, la cellula non può sprecare troppa

energia per disassemblarle e assemblarle quando serve, quindi i legami usati sono non covalenti, ma sono

sufficientemente forti per stabilizzare il protofilamento (questi legami servono anche ad unire i singoli monomeri di

tubulina, così come i singoli monomeri di actina-C). Se queste condizioni (presenza di sub-unità, formazione di legami

non covalenti) vengono rispettate, si può quindi arrivare ad un rapido disassemblaggio e ad un altrettanto rapido

riassemblaggio. I microtubuli si dipartono, formando una struttura a raggera, dalla zona del centrosoma.

Modello di assemblaggio dei microtubuli

Queste strutture sono state studiate in vitro, ossia prendendo i singoli monomeri e mettendoli in condizioni paragonabili

a quelle di una cellula (quindi concentrazione di determinati ioni, molecole giuste…), e si è riusciti ad osservare la

polimerizzazione, importante per intervenire in determinati casi.

Il presupposto per l’assemblaggio di microtubuli in vitro è la presenza dei 2 tipi di monomeri, in modo tale che possano

dare origine a questi microtubuli, in quanto strutture dinamiche, che polimerizzano rispettando determinate regole, con

una polimerizzazione reversibile, che parte da dimeri di tubulina e, in caso di disassemblamento, restituisce dimeri di

tubulina. Essendo un sistema in vitro, non è un contesto dove c’è un centrosoma con dei centrioli che potrebbero darne

la polarità. Ma 2 condizioni estremamente importanti sono: la presenza di ioni magnesio (perché servono per innescare il

processo di polimerizzazione) e una molecola energetica (viene consumata GTP per i legami, anche se sono deboli).

All’inizio (evento molto lento) i dimeri cominciano ad interagire tra di loro e cominciano ad unirsi a formare quelli che

vengono considerati degli oligopodi (corti polimeri); l’associazione tra i dimeri rispetta sempre l’alternanza Si arriva

α-β.

quindi ad una situazione in cui il processo diventa un po’ più stabile (l’instabilità porterebbe ad un disassemblamento), in

modo che si arrivi ad un protofilamento, che deriva dall’allungamento dell’oligomero per aggiunta di altri dimeri. Diversi

protofilamenti vanno quindi ad unirsi tra di loro, fino ad arrivare ad un foglio ben completo, che poi richiudendosi alle 2

estremità e stabilizzandosi dà origine al microtubulo stesso. Per formare un microtubulo completo servono 13 (di regola,

ma non sempre) protofilamenti. Si parla di 13 protofilamenti ogni volta che c’è un microtubulo completo, ma ci sono

anche degli esempi in cui più microtubuli si associano l’uno all’altro e all’interno di questa struttura che si viene a creare

non viene rispettato il numero di 13 protofilamenti.

Il concetto di protofilamento è estremamente importante perché è a livello di un protofilamento che si identificano una

estremità positiva e una estremità negativa: all’estremità positiva si troverà sempre un cerchio fatto solo da β-tubulina,

mentre all’estremità si troverà un cerchio fatto solo da In ogni caso non si ragiona su subunità singole, ma

α-tubulina.

sono i dimeri che entrano a far parte del microtubulo, quindi il primo dimero che va ad associarsi agli altri è orientato in

modo tale che l’α-tubulina o la siano orientate verso il basso. In prossimità dell’estremità negativa del

β-tubulina 37

microtubulo si trova il centro di nucleazione, cioè quella struttura centriolare immersa in una matrice, il centrosoma, che

crea il punto di nucleazione per tutti i microtubuli.

In condizioni fisiologiche, in una cellula, queste condizioni devono essere presenti, e la cellula, per di più, è in grado di

regolare la polimerizzazione o la depolimerizzazione di queste strutture a seconda delle sue esigenze.

Come si formano i microtubuli

L’assemblaggio dei microtubuli avviene in due fasi distinte: una lenta di nucleazione e una rapida di allungamento.

La fase di nucleazione è associata a diverse strutture specializzate dette centri di organizzazione dei microtubuli

(MTOC), di cui un esempio è il centrosoma (centrioli + matrice circostante, materiale pericentriolare). Nelle cellule

animali i microtubuli del citoscheletro sono nucleati dal centrosoma, costituito da due centrioli a forma di barilotto di

circa 0,2 di diametro e circa 0,4 di lunghezza, circondati da un materiale pericentriolare (PCM) amorfo ed

µm µm

elettrondenso. Un centriolo contiene nove fibrille, ognuna formata da una banda di tre microtubuli, dei quali il più

interno è stato chiamato microtubulo A, quello in posizione intermedia microtubulo B, e il più esterno microtubulo C; solo

il microtubulo più interno, il microtubulo A, è formato da 13 protofilamenti, gli altri no perché si appoggiano man mano

su quello precedente.

Queste fibre si dispongono in modo tale da creare una struttura a girandola e le fibre sono disposte perifericamente,

all’interno ci sono delle strutture che servono a tenere in registro le fibre, a mantenerle equidistanti dal nucleo centrale,

e, inoltre, ci sono delle braccia proteiche che uniscono il microtubulo A alla regione centrale, mantenendo quindi

l’equidistanza fra le fibre periferiche, c’è anche un braccio proteico che unisce ogni fibra a quella successiva. In questo

modo i centrioli sono delle strutture altamente organizzate e ben definite, ad essi quindi è dato il compito di nucleare

ogni microtubulo. I centrioli si trovano quasi sempre a coppie. Il centrosoma è generalmente collocato al centro

della cellula ed è dunque sito di nucleazione dei microtubuli che hanno sempre la stessa polarità: l’estremità

meno è associata al centrosoma, l’estremità più è situata dalla parte opposta ed è in accrescimento.

Nelle cellule eucariotiche i microtubuli si dividono in due gruppi: microtubuli citoplasmatici (sono quelli delle

cellule polarizzate e non polarizzate) associati al centrosoma e i microtubuli assonemali, non associati al

centrosoma. Generalmente il centrosoma delle cellule non polarizzate, ad esempio i fibroblasti, è situato vicino al

centro della cellula ed è associato all’estremità meno di molti altri microtubuli, i microtubuli delle cellule

polarizzate, ad esempio quelle epiteliali, sono ancorati con le estremità meno a siti sparsi nella regione apicale della

cellula, mentre le estremità più sono associate alla regione basale. Ci sono poi i microtubuli assonemali, che presentano

un corpo basale alla base dell’organello con la stessa struttura dei centrioli, di fatto possono essere convertiti gli uni negli

altri: un esempio è il corpo basale del flagello dello spermatozoo che diventa il centriolo per la formazione del primo

fuso mitotico dello zigote e il centriolo del fuso che ha formato lo spermatidio che diventa corpo basale del flagello dello

spermatozoo. Le cellule vegetali sono prive di qualunque tipo di MTOC, i microtubuli si generano intorno alla superficie

nucleare e in tutta la cortex. Il compito dei MTOC è quindi quello di: controllare il numero dei microtubuli, la loro

polarità, il numero dei protofilamenti, il luogo e il momento dell’assemblaggio. Una componente fondamentale per la

nucleazione dei microtubuli è la che costituisce circa lo 0,005% delle proteine totali. Essa sfrutta come

ɣ-tubulina,

sito di attacco per strutture anulari aventi lo stesso diametro dei microtubuli (25 nm) le fibre insolubili del PCM.

L’anello di forma uno stampo aperto sul quale si assembla il primo giro di polimeri di di modo

ɣ-tubulina α-β-tubulina,

che solo le vi si possano legare, garantendo il mantenimento della giusta polarità.

α-tubulina

I ricercatori hanno notato che, essendo il centro stesso di nucleazione a scaturire la polarità del microtubulo, significa

che questo centro di nucleazione deve avere in primo luogo la capacità di selezionare i protofilamenti orientandoli verso

se stessi in modo corretto, e, di conseguenza, oltre a stabilire la loro polarità, deve anche stabilire il numero di

microtubuli che dovrà nucleare da quel centro di nucelazione. È l’anello di che è in grado di creare una sorta

γ-tubulina

di stampo, ogni monomero è il punto di attacco per il protofilamento. Perciò i ricercatori hanno attribuito alla γ-tubulina

la funzione di determinare la polarità dei microtubuli.

Tappe della polimerizzazione:

- Formazione di dimeri e nucleazione, cioè aggregazione dei dimeri di tubulina (processo lento).

- Allungamento, cioè aggiunta di subunità ad un’estremità (processo veloce).

- Fase di stabilizzazione, l’assemblaggio e il disassemblaggio si bilanciano.

- Legami non covalenti uniscono i protofilamenti.

La rete di microtubuli è importante per regolare il traffico vescicolare e ha contatto con gli organelli all’interno del

citoplasma della cellula, qualsiasi alterazione a livello del processo di localizzazione o distribuzione all’interno della cellula

può interferire con la corretta morfologia e funzionalità della cellula stessa; questo è un esempio dell’importanza della

componente microtubulare in associazione ad una particolare tipologia di organuli cellulari.

Proteine associate ai microtubuli

I microtubuli contengono un insieme eterogeneo di proteine associate ai microtubuli (microtubule-associated

proteins o MAP). Le MAP si dividono in due gruppi: il tipo I, include le MAP 1 e il tipo II, che include le MAP2, MAP 4,

MAP tau. L’attività di legame ai microtubuli delle diverse MAP è regolato tramite l’aggiunta e la rimozione di gruppi

fosfato. Per questo sono fondamentali la proteinchinasi, che lega, e la fosfatasi, che rimuove. Un livello anormalmente

alto di fosforilazione delle tau sembra correlato con lo sviluppo di diverse malattie neurodegenerative letali, per esempio

38

l’Alzheimer, dal momento che tali molecole diventano incapaci di legarsi ai microtubuli e formano dei grovigli

neurofibrillari. Le MAPs favoriscono l’assemblaggio dei microtubuli, mantengono l’allineamento, favoriscono la

stabilità. Ad esempio il dominio C-terminale di una proteina filamentosa lega un microtubulo mentre il suo dominio N-

terminale si estroflette. Un particolare tipo di MAP sono le proteine motrici: esse convertono l’energia chimica in energia

meccanica utilizzata per trasportare i carichi cellulari legati al motore. Si dividono in tre famiglie: miosine, chinesine,

dineine. Le chinesine e le dineine si muovono lungo i microtubuli, le miosine lungo i microfilamenti, nessuna proteina

sfrutta invece i filamenti intermedi, dal momento che, non essendo polarizzati, non possono fornire una direzione al

carico. Le proteine motrici si muovono in modo unidirezionale, mano a mano che la proteina si sposta, subisce una serie

di modificazioni conformazionali che costituiscono il ciclo meccanico, al quale si associa il ciclo chimico, o

catalitico, che fornisce l’energia necessaria per produrre il movimento (ciclo chimico: legame molecola di ATP al

motore, idrolisi ATP, rilascio prodotti, legame di una nuova molecola di ATP). Le chinesine sono state scoperte nel 1985

da R. Vale e dai suoi colleghi. La chinesina I è un tetramero costituito da due catene pesanti identiche e due

catene leggere identiche. Ogni molecola è formata da due teste globulari, che si legano al microtubulo e agiscono

come macchine per l’idrolisi di ATP. Ciascuna testa, o dominio motore, è connessa ad un collo, ad uno stelo

bastoncellare e ad una coda a ventaglio che si lega al carico da trasportare. Il dominio motore della chinesina è simile a

quello della miosina, ma questo è molto più grande e inoltre viaggiano su binari differenti. La chinesina è detta

motore microtubulare diretto verso l’estremità più, quindi con moto centrifugo, e la velocità del suo movimento è

proporzionale alla concentrazione di ATP. La chinesina si muove con un movimento “mano a mano”, quindi le due teste

si alternano nelle posizioni di anticipo e di ritardo in assenza di una concomitante rotazione del peduncolo e del carico ad

ogni passo. Il movimento è processivo, quindi continuo, ovvero la proteina tende a muoversi sul singolo microtubulo per

distanze considerevoli senza staccarsi, questo perché almeno una delle teste resta attaccata ad ogni momento. È una

proteina adatta quindi al trasporto indipendente e ad effettuare lunghe distanze. Il microtubulo ricopre un ruolo

attivo in quanto stimola alcuni passaggi nel ciclo meccanico e chimico della molecola. La chinesina I è però

solo un membro della famiglia di KLP (kinesi-like proteins) e pare che i mammiferi ne producano circa 45, simili nelle

sequenze amminoacidiche, diverse nelle code che devono legare carichi diversi. Le chinesine si muovono verso

l’estremità più, ma una particolare famiglia di KLP si muove nella direzione opposta. Le differenze nella direzione sono

determinate dalla struttura delle adiacenti regioni del collo delle due proteine. Un’altra famiglia (la chinesina-13) è

incapace di movimento. Pare che queste proteine si leghino all’estremità di un microtubulo destabilizzandolo invece di

agire come motori e vengono per questo dette depolimerasi dei microtubuli, fondamentali nel processo di divisione

cellulare. Nella maggior parte delle cellule i microtubuli sono allineati con le loro estremità più in direzione del centro

della cellula, dunque le chinesine portano i carichi verso la periferia. Le chinesine utilizzano proteine integrali e

periferiche per mediare con la membrana delle vescicole che trasportano. Nel 1943 fu scoperta la dineina, proteina

responsabile del movimento di ciglia e flagelli. Si scoprì poi l’esistenza di una dineina citoplasmatica. Ciascuno di noi

ne possiede due (a differenza delle molte miosine e chinesine). È una proteina enorme (1500 kD) formata da

due catene pesanti identiche e da diverse catene intermedie e leggere. Ogni catena pesante è formata da una grande

testa globulare con una proiezione allungata, detta peduncolo, che è il sito di legame al microtubulo situato alla sua

estremità. La proiezione lunga, detta stelo o coda, lega le catene leggere e intermedie. I ruoli della dineina

citoplasmatica sono quelli di generare forza nella disposizione del fuso mitotico e nel movimento dei cromosomi

durante la mitosi e di costituire il motore microtubulare diretto verso l’estremità meno, quindi con moto centripeto, che

determina la posizione del centrosoma e del complesso di Golgi oltre al movimento vescicolare. Necessita della

dinactina per interagire con la membrana plasmatica delle vescicole.

Disassemblaggio dei microtubuli

I microtubuli sono stabilizzati dalla presenza di MAP a loro legate e da altri fattori ancora sconosciuti. Sono caratterizzati

però da una labilità fondamentale dovuta al fatto che sono polimeri formati dall’associazione non covalente di

subunità dimeriche e possono dunque disassemblarsi esattamente come si assemblano. Il disassemblaggio può

2+

essere indotto dal freddo, dalla pressione idrostatica, da elevate concentrazioni di ioni Ca e da una varietà di sostanze

chimiche, quali colchicina, vinblastina, vincristina, nocodazolo, podofillotossina, taxolo. Quest’ultimo si lega al polimero

microtubulare, inibendone il disassemblaggio ed impedendo alla cellula di assemblare nuove strutture microtubulari dove

richiesto. Il taxolo viene utilizzato nella terapia contro il cancro perché si presume che uccida cellule tumorali che si

dividono molto velocemente, in breve, in realtà le cellule sane hanno meccanismi di controllo che impediscono la loro

divisione in presenza di tali farmaci che alterano il fuso mitotico, mentre molte cellule tumorali continuano la divisione

anche senza un fuso funzionante e vanno incontro alla loro stessa morte. Queste sostanze vengono utilizzate tutte le

volte che si vuole interferire con la formazione dei microtubuli stessi. La labilità dei microtubuli è osservabile nelle cellule

vegetali: durante l’interfase sono distribuiti in tutta la cortex, dunque da essi se ne originano altri che poi si staccano e

vengono incorporati in fasci paralleli che circondano la cellula. Quando essa si avvicina alla mitosi rimane una

fascia trasversale detta fascia preprofascia, che segna il sito del futuro piano di divisione, quando la mitosi progredisce

la fascia viene persa e i microtubuli ricostituiscono il fuso mitotico, quando i cromosomi sono separati il fuso sparisce e

viene sostituito da un fascio di microtubuli detto fragmoplasto che ha un ruolo nella formazione della parete cellulare

che separa le due cellule figlie.

Ciglia e flagelli sono sottili organelli motori che si proiettano dalla superficie di una gran varietà di cellule eucariotiche.

Un ciglio muove la cellula in una direzione perpendicolare a se stesso. Le ciglia tendono ad essere presenti in gran

numero sulla superficie di una cellula e il loro battito di solito è coordinato, ma non tutte le ciglia sono mobili: alcune

cellule contengono un unico ciglio immobile che ha funzione sensoriale dunque sonda le proprietà del fluido

39

extracellulare. I flagelli hanno differenti tipi di battito, o forme

d’onda, a seconda del tipo cellulare. Tutta l’estroflessione del

ciglio o del flagello è coperta da una membrana continua con

la membrana plasmatica della cellula. La parte centrale è detta

assonema e contiene un insieme di microtubuli che percorre

longitudinalmente l’intero organello. L’assonema è formato da

nove coppie o doppiette periferiche di microtubuli che

circondano un paio di microtubuli singoli centrali in una

“disposizione a 9+2”. Tutti i microtubuli dell’assonema hanno

la stessa polarità, le loro estremità più (+) sono all’apice

dell’estroflessione, quelle meno (-) alla base. Le coppie

periferiche sono costituite da un microtubulo completo, tubulo

A, e da uno incompleto, tubulo B, di 10 o 11 subunità. I tubuli

centrali sono circondati da una guaina centrale collegata ai

tubuli A delle coppie periferiche da una serie di raggi. Le

coppie sono collegate tra loro tramite ponti intercoppia di nexina, una proteina elastica fondamentale nel

movimento perché limita l’estensione dello scorrimento reciproco delle doppiette adiacenti causando una flessione

dell’assonema. C’è poi una coppia di bracci, uno interno e uno esterno, che si proietta dal tubulo A. i tubuli A e B del

corpo basale si prolungano a formare le coppie del ciglio o del flagello del corpo basale si prolungano a formare le coppie

del ciglio o del flagello. Ciglia e flagelli si muovono grazie alla presenza di bracci di dineina detta ciliare o assonemale

che rilascia l’energia richiesta per il movimento che avviene per scorrimento reciproco delle coppie microtubulari

adiacenti.

Cigli e flagelli sono quindi strutture che richiedono un corpo basale per la formazione dei microtubuli. Strutturalmente un

corpo basale è simile a un centriolo, e questo potrebbe avere un’influenza biologica: visto che si basano su fibre che si

dispongono perifericamente creando una sorta di girandola, all’interno di una cellula i centrioli possono essere convertiti

in corpo basale o viceversa a seconda dell’esigenza.

I microfilamenti (o filamenti di actina)

Hanno un diametro di circa 8 nm. Una cellula che ha bisogno

di motilità deve polimerizzare filamenti di actina. La motilità

delle cellule dipende quindi dalla presenza di microfilamenti.

Durante lo sviluppo embrionale, per esempio, le cellule

migrano attratte da gradiente di concentrazione, i leucociti

perlustrano i tessuti alla ricerca di detriti o microorganismi, le

cellule epiteliali ai bordi di una ferita formano espansioni per

chiuderla. Quindi i filamenti intermedi intervengono in modo

attivo in specifici momenti della vita di una cellula o di un

tessuto a seconda delle esigenze. A livello del citoplasma

della cellula anche i microfilamenti sono delle strutture

altamente dinamiche, quindi si possono presentare in forma monomerica, G-actina o actina globulare, e la forma

filamentosa (actina-F), cioè quella polimerizzata; queste due forme sono comunque in equilibrio tra di loro, la forma

monomerica viene rinnovata tutte le volte che i microfilamenti depolimerizzano, diminuisce invece nel momento in cui

polimerizzano a formare strutture.

L’estremità positiva e quella negativa delle strutture formate dalla polimerizzazione dei monomeri possono essere

evidenziate sperimentalmente con la possibilità di marcare i polimeri con una porzione della miosina. Quindi la molecola

di actina marcata, con il frammento S1, si presenta con un’estremità a punta di freccia e quella opposta sfrangiata,

questa possibilità di marcatura ha evidenziato come i microfilamenti sono localizzati.

L’actina globulare è stata identificata in tutte le cellule eucariotiche, infatti viene definita una proteina ubiquitaria; inoltre

esistono diverse forme o isoforme di actina. La disposizione dell’actina filamentosa può dare origine a strutture diverse:

può creare dei fasci dove le molecole sono disposte in modo parallelo, o creare delle trame, tutto dipende dalle proteine

che intervengono nel mediare questa organizzazione.

Polimerizzazione, assemblaggio e disassemblaggio dell’actina

I primi studi che sono stati fatti per quanto riguarda anche questa componente citoscheletrica sono stati condotti in vitro

e hanno riguardato i processi di polimerizzazione. (Essendo una situazione in vitro, ci sono delle piccole differenze con le

situazioni in vivo). I ricercatori hanno visto che il monomero di G-actina necessita di una molecola di ATP, per questo

motivo le molecole G di actina sono state definite ATP-protein (la tubulina, invece, ha bisogno di GTP), quindi per poter

procede in vitro bisogna fornire delle molecole di ATP, altrimenti non si ha la formazione della proteina: il complesso

monomero-ATP è quello che interviene per essere inserito nel polimero, nella struttura nascente. Come per i microtubuli,

si è visto che c’è una fase di nucleazione (lenta), alla quale segue una fase di allungamento (veloce). Nella fase iniziale

deve organizzarsi un insieme di molecole che poi, una volta ben disposte, sono pronte per favorire l’allungamento del

polimero stesso. La condizione che serve perché possa avvenire questo processo in vitro (nella cellula in vivo non è

proprio così) è che si deve partire da una piccola porzione di microfilamento pre-formato. 40

I monomeri si attaccano ad entrambe le estremità, si può dire che questo filamento è sottoposto a un processo di

polimerizzazione perché di ciò che era preformato non c’è più traccia e la porzione finale è più lunga e formata solo da

nuovi monomeri: da ciò si deduce che è una struttura altamente dinamica, i monomeri continuano ad attaccarsi e a

staccarsi, e questa dinamicità continua nella cellula, a meno che ci sia l’esigenza di bloccare il microfilamento alle 2

estremità in modo che sia una struttura stabile per l’intervallo di tempo che la cellula richiede. All’estremità più (+) i

monomeri si attaccano, ma si staccano anche: i monomeri nella prima fase hanno una maggior affinità per essere inseriti

all’estremità più rispetto all’estremità meno, nelle situazioni successive, man mano la concentrazione dei monomeri

comincia a diminuire e all’estremità + è maggiore la quantità di monomeri che si attaccano mentre dall’altra parte è

nettamente sbilanciata in quanto non c’è più la possibilità di inserirli perché l’affinità ad inserirli è minore e quella ad

allontanarli è maggiore, quindi da questa estremità cominciano a staccarsi quelli del filamento preformato. Si arriverà poi

ad una sorta di equilibrio, con una concentrazione pressappoco constante: il microfilamento è giunto alla fine della sua

fase di allungamento e il numero di monomeri che si attaccano e si staccano all’estremità positiva e il numero di

monomeri che si attaccano e si staccano all’estremità negativa sono praticamente identici. Non si tratta di una

condizione stabile statica, ma di una condizione stabile dinamica, perché comunque i monomeri continuano ad essere

staccati e attaccati; questa condizione di equilibrio in un sistema in vitro lo è anche in un sistema in vivo. Il tratto pre-

formato in vivo non esiste, ma per poter innescare e regolare una nucleazione si pensa che possano essere presenti dei

complessi di proteine che intervengono.

Una volta formatisi, i microfilamenti si devono organizzare (in vitro non lo possono fare perché non sono presenti quelle

proteine che una cellula mette a disposizione per ordinarli, quindi non sono capaci di interagire tra loro). Affinché possa

avvenire questa organizzazione, devono essere presenti delle importanti proteine che variano a seconda del tipo cellulare

in cui vengono coinvolte.

Possono essere presenti delle proteine ARP 2/3, un complesso di proteine che interviene nel garantire ed innescare il

processo di nucleazione dei microfilamenti. Sono proteine che hanno una grandissima affinità con l’actina perché

condividono una sequenza amminoacidica in parte paragonabile a quella dell’actina, tale per cui sono anche state

definite “actine non vere”; quando nella cellula c’è l’esigenza di nucleare nuovi microfilamenti, questo complesso cambia

la sua conformazione, aumenta ancora di più l’affinità con l’actina, i monomeri vengono chiamati, e inizia

l’organizzazione. Si è visto che queste proteine sono in grado di creare strutture filamentose che possono disporsi anche

a creare delle trame, poi, in un secondo momento, si è visto che in alcuni casi molto precisi non è questo complesso

proteico ad entrare in gioco ma è un’altra proteina, la formina, che serve a creare uno stampo per la polimerizzazione di

filamenti di actina non ramificati; la formina è associata a anelli contrattili e contatti focali (il primo strato di cellule di un

epitelio pluristratificato o il primo e l’ultimo strato di cellule di un epitelio pseudostratificato o monostratificato, hanno

una porzione di membrana plasmatica che poggia sulla lamina basale e le giunzioni che aiutano queste cellule ad essere

ancorate alla lamina basale sono i contatti focali). Alla base di un contatto focale c’è una proteina transmembrana che

ancora la membrana di quella cellula alla sua lamina basale, ma questa proteina transmembrana non avrebbe nessun

sostegno se non ci fosse una componente proteica, quindi in questo caso i microfilamenti svolgono questa funzione e i

contatti focali servono a mediare l’adesione della cellula alla lamina basale.

Si ottengono quindi dei filamenti di actina, che possono assumere delle disposizioni diverse.

Per il disassemblaggio dei microfilamenti possono intervenire diverse sostanze. I processi cellulari mediati da actina si

bloccano quando la cellula è trattata con una di queste sostanze:

- Falloidina (molecola velenosa viene estratta da un fungo, l’ammanite falloide) Essendo definita come veleno, se

qualcuno inavvertitamente mangiasse funghi di questo tipo, a livello cellulare la falloidina andrebbe a legarsi ai

filamenti di actina impedendone il loro turnover, quindi bloccandoli nella loro posizione. È una molecola velenosa,

ma da un punto di vista scientifico è stata sfruttata questa sua caratteristica, infatti può essere utilizzata per

marcare i microfilamenti all’interno di una cellula.

- Citocalosina (estratta da un tipo di muffa) È in grado di legarsi all’estremità (+) del filamento di actina

permettendo la depolimerizzazione all’estremità (-). Andando a bloccare l’estremità positiva, dove si legano nuovi

monomeri con maggiore affinità, quindi impedendo un eventuale allungamento, rimane libera l’estremità negativa,

che va ad imporre al microfilamento una depolimerizzazione. Se una cellula è sottoposta a citocalasina e non si

provvede a rimuoverla entro breve tempo, può andare incontro alla perdita di questa componente citoscheeltrica.

- Latrunculina (estratta da una specie di spugne marine) Si lega ai monomeri impedendo la loro incorporazione nel

filamento. È in grado di sequestrare monomeri presenti all’interno del citoplasma della cellula, possono essere

presenti, ma la cellula non li sa utilizzare, è come se venissero mascherati.

Considerando questi esempi e altre tipologie di molecole esogene all’organismo che possono intervenire, si può dedurre

che i processi cellulari, a patto che le cellule vengano esposte a queste molecole, possono essere bloccati, andando a

interferire con la funzionalità della cellula stessa. Di conseguenza, la condizione fisiologica è quella ideale, qualsiasi

anomalia a carico di questi processi interferisce non solo con la vitalità della cellula, ma con la totalità dell’organismo. Se

un organismo adulto può essere suscettibile nei confronti di queste molecole, la barriera placentare può lasciar passare

queste sostanze e andare a interferire con l’embrione che si sta formando, a volte andando a creare situazioni che sono

incompatibili con la vita. 41

I microvilli

I microvilli sono delle espansioni digitiformi della membrana

apicale e hanno diametro di circa 0,1 e lunghezze di circa 1-2

µm

quindi con un solo microscopio ottico si presenta una certa

µm,

difficoltà nel vedere la loro struttura. Osservando un immagine al

microscopio si può notare che la porzione in cui sono presenti i

microvilli risulta molto più scura rispetto a quella del citoplasma

della cellula, questo significa che c’è la presenza di materiale

elettrondenso e questa maggior elettrondensità è dovuta ai

filamenti di actina che sono disposti in fasci paralleli compattati

da specifiche proteine che mediano i legami microfilamento-

microfilamento e microfilamenti-membrana della cellula. La

regione corticale del citoplasma presenta delle linee scure, che

sono i filamenti di actina che non terminano nella loro lunghezza

alla base del microtubulo, ma entrano nella regione corticale

formando delle radici, ovvero dei microfilamenti che inseriti nel

citoplasma creano una struttura estremamente stabile. La funzione dei microvilli è quella di aumentare la superficie della

membrana della cellula nelle fasi di assorbimento, in modo che questo sua più efficiente. La struttura del microvillo, al di

là dell’estroflessione della membrana apicale della cellula, è quindi data da un denso fascio di microfilamenti, le cui

estremità positive sono rivolte verso l’apice del microvillo e immerse in una matrice di natura amorfa (ad oggi non si è

ancora riusciti a capire da che cosa sia costituita questa matrice). Oltre a microfilamenti disposti in modo ordinato,

all’interno dei microvilli ci sono altre proteine, delle quali le più studiate e caratterizzate sono la fimbrina, disposta in

modo regolare a creare dei punti di contatto microfilamento-microfilamento, la villina, che sembra rafforzare il ruolo della

fimbrina, e altre proteine, in particolar modo la miosina-1, che è una miosina particolare in quanto è una proteina

vescicolare (potrebbe intervenire nel trasporto delle vescicole ai microfilamenti, ma la sua reale funzione è tutt’oggi

.

sconosciuta)

Il trasporto intracellulare e le proteine motrici

All’interno di una cellula il traffico non è solo riconducibile ai microtubuli. L’ipotesi di partenza è stata che il trasporto

fosse a carico di chinesina e dineina, poi è stata modificata, e oggi si pensa che la maggior parte del trasporto sia a

carico di dineina e chinesina, ma che intervengono anche i filamenti di actina (i filamenti intermedi sono esclusi da

qualsiasi trasporto a livello della cellula). La maggior parte del traffico è mediato dai microtubuli, che si diramano in

modo ben preciso, mentre i microfilamenti mediano il traffico nella regione periferica. I filamenti di actina, infatti, sono

localizzati al di sotto della membrana plasmatica delle cellule, nella regione, definita corticale (o cortex), che va a

rafforzare la regione periferica della cellula. La proteina citoscheletrica che inizia il traffico lungo i microfilamenti è la

chinesina, e visto che essa si sa legare solo ai microtubuli, se l’esigenza è quella di portare in dei punti della cellula

determinate vescicole o molecole, si fa carico di questo trasporto; nel momento in cui si avvicina alla regione più

periferica, dove si addensano i filamenti di actina, il carico, legandosi anche alla miosina-V, completa il traffico grazie ai

microfilamenti. Lungo i microfilamenti si muovono le miosine, le quali sono tutte accomunate da un dominio (testa), che

contiene un sito che lega un filamento di actina e uno che lega e idrolizza ATP, ma differiscono nei domini della coda,

che contengono anche una varietà di catene a basso peso molecolare. Possono essere divise in 2 categorie:

- Miosine convenzionali (è la miosina II) Rappresentano i principali motori della contrazione muscolare ma

si trovano anche in molte cellule non muscolari. Il genoma umano codifica 16 differenti catene pesanti della

miosina II, tre delle quali svolgono la loro funzione nelle cellule non muscolari. Ogni molecola di miosina II è

formata da sei catene polipeptidiche (una coppia di catene pesanti e due di catene leggere). Consiste in: due teste

globulari, che contengono il sito catalitico della molecola, 2) un paio di colli, formati da ininterrotta e da due

α-elica

catene leggere associate, e una lunga coda (150nm) formata dall’avvolgimento reciproco dei tratti di delle

α-elica

due catene pesanti. La testa costituisce il meccanismo d'azione, in quanto si lega ai microfilamenti, la coda ha ruolo

strutturale quindi permette alla proteina di firmare filamenti. Le molecole di miosina II si assemblano in modo che le

estremità delle code siano rivolte verso il centro del filamenti mentre le teste verso l'esterno. Per questo

motivo il filamento viene detto "bipolare", per via dell'inversione di polarità al centro.

- Miosine non convenzionali, che possono essere divise in almeno 17 classi differenti La prima fu scoperta nel

1973 da T.Pollard e E.Korn, fu chiamata miosina I, aveva solo una testa ed in vitro non era capace di assemblarsi in

filamenti. Il suo ruolo è ancora sconosciuto. La miosina V, invece, è una miosina con due teste che si sposta lungo i

filamenti di actina, grazie all'alta affinità delle teste stesse. Ha un collo molto lungo, di 23 nm, circa tre volte quello

della miosina II, e questo le consente di fare passi molto lunghi, di circa 36 nm, equivalente alle ripetizioni del

filamento elicoidale. Cammina secondo il modello "mano a mano" come dineina e chesina. Diverse miosine non

convenzionali sono associate a diversi tipi di vescicole e organelli citoplasmatici, dal momento che alla fine del

trasporto sui microtubuli, tali elementi passano su binari formati da microfilamenti e vengono portati alla periferia

della cellula. I granuli di pigmento, detti melanosomi, ad esempio sono trasportati nei processi periferici da miosina

V e sono poi trasferiti nei follicoli piliferi. Le cellule capellute presentano un fascio di stereociglia rigide che sporgono

dalla superficie dalla superficie apicale della cellula verso il fluido che riempie la cavità dell'orecchio interno. Ogni

stereociglio è sostenuto da un fascio di filamenti di actina paralleli le cui estremità sfrangiate sono localizzate alla

42

punta esterna e le estremità appuntite alla base. La miosina VI è l'unica che si muove in direzione inversa, quindi

dall'estremità più a quella meno, appuntita. Si ritiene che sia coinvolta nella formazione di vescicole rivestite da

clatrina a livello della membrana plasmatica, nel movimento di vescicole non rivestite verso gli endosomi precoci e

nell'ancoraggio delle membrane ai filamenti di actina.

La contrattilità muscolare

Il muscolo è rivestito di una guaina di natura connettivale,

all’interno della quale c’è un fascetto muscolare formato da fibre

muscolari. Una fibra muscolare (sinonimo di cellula muscolare

striata scheletrica) è una cellula molto lunga, tale per cui c’è un

rapporto nucleo : citoplasma pari a 1 : 2. Queste grosse fibre

muscolari sono derivanti, durante lo sviluppo embrionale, dalla

fusione di mioblasti, cioè tante cellule che si fondono tra di loro

costituendo una cellula con tanti nuclei; sono quindi un esempio di

cellule plurinucleate presenti nel nostro organismo. Nella regione

più periferica del citoplasma, al di sotto della membrana

plasmatica, sono localizzati i nuclei. Questa cellula è talmente

particolare che la membrana plasmatica viene detta sarcolemma, il

citoplasma viene detto sarcoplasma, e l’unità contrattile all’interno

di ogni fibra muscolare è il sarcomero (struttura dalla quale deriva

il prefisso “sarco” per i nomi delle altre componenti). All’interno del

citoplasma ci sono tanti piccoli cilindri messi tutti vicini e paralleli

tra di loro che vengono chiamati miofibrille, ogni miofibrilla è la

disposizione ordinata di tanti sarcomeri. Una fibra muscolare è

quindi una struttura cava che contiene tante strutture più sottili,

che sono le miofibrille. Ogni miofibrilla è l’associazione di

componenti proteiche: microfilamenti e miosina, con proteine

accessorie che si legano in vario modo ai microfilamenti.

Il sarcomero è l’unità contrattile, tanti sarcomeri associati, che si

contraggono insieme, permettono il movimento dei nostri muscoli.

La miosina muscolare è la miosina II. La miosina è una proteina di

per sé abbastanza semplice, per formarne un’unica molecola

servono almeno 2 subunità. Ogni subunità è formata da una

porzione bastoncellare e una regione terminale globosa, l’insieme

costituisce una catena pesante. Le 2 porzioni bastoncellari si

avvolgono tra di loro creando una struttura più resistente. Su

entrambi i monomeri sono presenti anche delle catene leggere, che possono essere catene leggere escreziali o catene

leggere regolatorie. Si è visto che le regioni globose, le teste, hanno un’alta affinità per i microfilamenti e vanno a legarsi

con essi. La miosina-S1 è la componente che lega i microfilamenti in modo da dare direzionalità, utilizzando una blanda

digestione enzimatica si può staccare il frammento S1 dalle porzioni, quindi, avendo una preparazione purificata di

frammenti S1 e mettendoli in presenza di actina, grazie alla componente globosa si identifica la direzionalità del

microfilamento.

Ci sono dei confini che identificano l’inizio e la fine di un sarcomero, e questi confini sono le due strie Z che ci sono alle

estremità, e servono a delineare l’unità contrattile. Su queste strie Z si agganciano i microfilamenti, ci sono delle

specifiche proteine che ancorano i filamenti di actina sulla stria Z. Questi microfilamenti si dispongono con una polarità

ben precisa: l’estremità positiva è rivolta verso le strie Z, sia da una parte che dall’altra; nella parte centrale del

sarcomero, invece, compare la miosina, che non è agganciata alla linea Z, ma è confinata nella parte centrale del

sarcomero, sono presenti 2 porzioni di miosina, che si interfacciano tra di loro con la porzione bastoncellare.

Caratteristica fondamentale: le teste della miosina sono orientate verso le strie Z, da una parte e dall’altra, e possono,

all’occorrenza, agganciarsi ai microfilamenti che stanno sotto. Disponendo in modo corretto le 3 componenti (strie Z,

microfilamenti e molecole di miosina), è possibile identificare delle zone, che possono essere alla base della striatura che

poi si identifica in un’immagine istologica: la regione che si trova tra la stria Z e l’inizio delle molecole di miosina viene

chiamata banda I (in termini proteici, a livello della banda I, si possono riconoscere solo i microfilamenti); la regione più

centrale, che va dall’estremità della banda I all’estremità della banda I successiva, viene chiamata banda A, è la più

estesa, ed è la regione in cui sono presenti ancora porzioni di microfilamenti, ma anche tutte le molecole di miosina. Dal

punto di vista strutturale: esattamente a metà della banda A c’è una piccola regione chiamata zona H, che coincide, in

termini proteici, alla regione bastoncellare delle miosine, mentre non c’è traccia dei microfilamenti. Al centro della zona H

si trova la banda M, che delinea perfettamente la metà del sarcomero.

A livello sarcomerico, se il muscolo è rilassato le molecole di miosina sono localizzate in modo tale da interessare la parte

centrale, la banda A; in una situazione di contrazione muscolare, invece, il muscolo, a livello sarcomerico, è molto più

ridotto nella sua estensione. La distanza fra la strie Z è maggiore in muscolo rilassato rispetto a un muscolo contratto:

con la contrazione le strie Z si avvicinano tra di loro. Ogni fibra muscolare si accorcia, la banda A rimane costante in

lunghezza mentre le bande H e I si accorciano fino a scomparire, le strie Z si avvicinano fino a toccare i margini esterni

43

della banda A. Tale movimento è dato dallo scorrimento dei singoli filamento. Questo accade perché la miosina e i

microfilamenti scorrono l’uno sull’altro e quindi si sovrappongono in quelle regioni in cui nel muscolo rilassato non lo

erano. Questa situazione permane finché il muscolo è contratto, poi il sarcomero riprende la sua conformazione iniziale.

Non c’è un accorciamento del sarcomero, ma c’è uno slittamento di miosina su microfilamenti, il tutto favorito da ponti

trasversali di miosina (componente globosa) che prendono contatto con i microfilamenti e li fanno scorrere verso il

centro del sarcomero. Inoltre, anche altre proteine intervengono nel regolare l’aggancio e lo scorrimento dei

microfilamenti rispetto alla miosina.

I filamenti sottili, oltre all'actina, contengono altre proteine: la tropomiosina e la troponina. La tropomiosina è una

molecola allungata che si inserisce nelle scanalature all'interno del filamento, ha una forma bastoncellare ed è associata

con sette subunità di actina. La troponina, invece, è una proteina globulare composta da tre subunità, ognuna con

un ruolo distinto, le cui molecole sono distanziate di circa 40 nm e sono in contatto sia con la tropomiosina che con la

componente actinica. I filamenti spessi sono formati da centinaia di molecole di miosina II ed altre proteine. La loro

polarità è invertita al centro del sarcomero, costituito dalle regioni delle code contrapposte delle molecole di miosina ed

è privo di testa. Dalla linea M prendono invece origine le molecole di titina che si allungano sui filamenti di miosina

continuando oltre la banda A e terminando sulla linea Z. È estremamente elastica e impedisce che il sarcomero venga

strappato durante lo stiramento dei muscoli. Le basi molecolari della contrazione sono le teste delle molecole di miosina,

in quanto generatrici di forza. Durante la contrazione ciascuna testa prendere contatto con il filamento sottile, formando

ponti trasversali. Questo causa un cambiamento conformazionale che muove il filamento sottili e di circa 10 nm verso il

centro del sarcomero. La miosina muscolare, II, è un motore non processivo, quindi non continuo, ma il fatto che ogni

filamento sia contemporaneamente in contatto con circa un centinaio di teste fa sì che il movimento del filamento sia

continuo. Il fatto che siano le teste a consentire tutto questo si spiega dicendo che l'energia rilasciata dall' idrolisi

dell'ATP induce un piccolo cambiamento conformazionale nella testa mentre è legata al filamento. Il movimento e

amplificato dal movimento a pendolo del collo ad quindi si dice che il collo è il "braccio di leva", la forza del quale

α-elica,

è garantita dalle catene leggere. La lunghezza misurabile del colpo di potenza delle molecole di miosina è direttamente

proporzionale alla lunghezza dei colli. L'energia è generata attraverso l'impiego di ATP. Una molecola di ATP si lega alla

testa della miosina, il che induce alla dissociazione del ponte dal filamento di actina, segue l'idrolisi dell'ATP

prima che la testa sia entrata in contatto con il filamento. I prodotti del l'idrolisi, ADP e P rimangono attaccati al sito

i

attivo dell'enzima mentre l'energia rilasciata viene assorbita dalla proteina. La miosina si attacca dunque alla molecola di

actina e rilascia il fosfato legato, questo causa il cambiamento che sposta il filamento di actina verso il centro del

sarcomero (tale movimento è la fase attiva della testa di miosina). Il rilascio dell'ADP legato e seguito dal l'attacco di una

nuova molecola di ATP. In assenza di ATP la testa di miosina rimane legata al filamento.

I filamenti intermedi

Sono le strutture meno dinamiche fra le componenti

citoscheletriche, sono più stabili, devono garantire stabilità

strutturale alla cellula, e la loro stabilità è anche strettamente

correlata al fatto che sono poco solubili. L’ipotesi iniziale, che era

stata attribuita alla scoperta dei filamenti intermedi, era che la

loro funzione fosse quella di fornire il maggior supporto per

l’intero complesso citoscheltrico, essendo molto stabili. Quindi

resistono molto di più e si disorganizzano solo in momenti ben

precisi. Sono filamenti pieni, non ramificati, del diametro di circa

10-12 nm. Sono fibre forti e flessibili, presenti solo nelle cellule

animali, che forniscono una resistenza meccanica alla cellula.

Essendo stabili e fornendo supporto alla componente

citoscheletrica, devono potersi collegare ai microfilamenti e ai

microtubuli, e visto che non possono farlo direttamente, si

avvalgono di molecole proteiche, come la plectina, che crea dei

ponti di contatto tra filamento intermedio e microtubulo e tra

filamento intermedio e microfilamenti. Le molecole di plectina

sono quindi dei ponti proteici, la molecola di plectina è una

proteina che ha una porzione che riconosce il microtubulo e una porzione che riconosce il microfilamento, e che sono in

grado di legare direttamente il filamento intermedio al microtubulo o al microfilamento.

All’interno di una cellula sono localizzati nelle aree in cui la cellula stessa è sottoposta a maggiore stress meccanico,

come i desmosomi (tipologia di giunzioni che per eccellenza resistono ad una trazione meccanica). Quando l’epitelio è

sottoposto a trazione, le cellule non cedono perché i filamenti intermedi offrono resistenza, ciò che cambia è la

morfologia cellulare: la cellula modifica la propria altezza per resistere all’azione di trazione. I filamenti intermedi, quindi,

per poter completare la loro funzione, hanno bisogno di placche proteiche su cui ancorarsi.

Categorie di filamenti intermedi

I filamenti intermedi sono costituiti da un gruppo eterogeneo di proteine e differiscono da tessuto a tessuto; questo

presuppone che ci siano anche altrettanti geni che ne codificano la sintesi a livello delle cellule. Nei mammiferi sono stati

44

identificati 65 geni, che sono preposti alla sintesi di diverse tipologie di filamenti intermedi. Si possono dividere in almeno

2 grosse categorie:

- Filamenti intermedi citoplasmatici (sono i più numerosi) Di questa categoria fanno parte le cheratine, che

costituiscono le principali proteine strutturali delle cellule epiteliali e sono prodotte dai cheratinociti, che sono per

eccellenza le cellule della nostra epidermide (i filamenti intermedi contenenti cheratina si diramano attraverso il

citoplasma, legati all’involucro nucleare al centro e al margine periferico della cellula); vimentina o vimentina-simili,

che si trovano nei tessuti connettivi, a livello muscolare e nelle cellule della neuroglia, che sono cellule a supporto

delle cellule nervose (la componente vimentina o vimentina-simili è quella più abbondante); neurofilamenti, che

sono tipici delle cellule nervose, e si associano parallelamente all’assone della cellula.

- Filamenti intermedi nucleari L’esempio è dato dalle lamìne nucleari, l’insieme delle quali costituisce la lamina

nucleare, la quale concorre a conferire forma al nucleo e ad essere un punto di ancoraggio per la cromatina, in

particolar modo per l’eterocromatina.

Ogni filamento intermedio è costituito da monomeri, quindi da strutture unitarie che si devono associare tra di loro, ma,

a differenza dei microtubuli e dei microfilamenti, i cui monomeri sono globulari, questa in generale è una proteina

fibrosa: i monomeri dei filamenti intermedi sono proteine fibrose, e come tutte le strutture fibrose hanno una peculiarità,

ovvero una regione centrale (la più estesa) a forma bastoncellare, e 2 estremità; essendo una proteina, presenta quindi

un dominio centrale, definito (si è visto che questo dominio è stato altamente conservato durante l’evoluzione

α-elica,

nelle varie specie di organismi), e 2 domini alle estremità, ovvero un’estremità carbossi-terminale e un dominio ammino-

terminale. Questo monomero, di per sé, non sarebbe sufficiente a rispondere all’esigenza di una tensegrità cellulare,

deve quindi associarsi, ma rispettando regole ben precise, per creare una struttura altamente complessa, che è il

filamento intermedio. A questo punto deve formarsi un dimero, che deriva dall’attorcigliamento del dominio di un

α

monomero sul dominio di un altro monomero, tale per cui 2 estremità carbossi-terminali e 2 estremità ammino-

α

terminali vengono a trovarsi unite tra di loro. Ma la struttura di un filamento intermedio va ben oltre quella di un singolo

dimero, perciò dai dimeri devono formarsi dei tetrameri, che consistono nell’aggregazione di 2 dimeri vicini, non

perfettamente paralleli ma sfalsati. Il tetramero è l’unità fondamentale del filamento intermedio ed è formato da 2

dimeri con le 2 estremità antiparallele, quindi orientate in senso opposto; per questo motivo il tetramero non ha polarità

(è per il fatto che non hanno polarità che non vengono utilizzati per il trasporto, in quanto la mancanza di polarità non

indica una direzionalità). a questo punto si devono avvicinare i tetrameri, e si avvicinano in modo che l’estremità

carbossi-terminale interagisca con l’estremità ammino-terminale e viceversa. In questo modo la struttura aumenta nella

sua lunghezza, 8 tetrameri si uniscono a formare un’unità di lunghezza, di circa 60 nm, e queste unità poi si associano

ad allungare i filamenti. Nessuna di queste fasi richiede apporto di ATP o di GTP.

I filamenti intermedi tendono ad essere meno sensibili agli agenti chimici e difficile da solubilizzare, per questo in un

primo momento si è pensato che fossero permanenti e non modificabili. In realtà, il loro assemblaggio e disassemblaggio

è regolato da fosforilazione e defosforilazione delle subunità. La fosforilazione, ad esempio, dei filamenti di vimentina da

parte della proteina-chinasi A porta al loro completo disassemblaggio.

I filamenti intermedi sono fondamentali all’interno della cellula, la loro mancanza causa gravi patologie, come la

epidermolysis bullosa simplex, causata da mutazioni del gene che codifica il polipeptide K14; è una malattia della pelle,

rara e di carattere genetico, causa lo scollamento marcato dell’epidermide dal derma sottostante, che quindi risulta

esposto; il deficit o le alterazioni sono a carico di alcune proteine della cute (come collagene, cheratina, laminine,

desmocolina, desmoplachina, placoglobina, integrine), che formano le giunzioni. La miopatia collegata con la desmina,

invece, è causata da mutazioni del gene che codifica la desmina, fondamentale nel mantenimento dell’allineamento delle

miofibrille delle cellule muscolari, causa debolezza dei muscoli scheletrici, aritmie cardiache, paralisi cardiaca congestizia.

Tuttavia, non tutti i polipeptidi sono così essenziali, la mancanza di vimentina, ad esempio, non causa gravi problemi.

La componente citoscheletrica interviene non solo a costituire il citoscheletro della cellula, non solo a garantire un

traffico cellulare di vescicole o organuli, ma anche a mediare l’adesione cellula-cellula (dal quale però sono

completamente esclusi i microtubuli).

Lo spazio extracellulare

Muovendosi dalla membrana plasmatica verso l’esterno, si possono esaminare i vari elementi extracellulari che

circondano i diversi tipi di cellule. Ad esempio, praticamente tutte le proteine integrali di membrana, ma anche certi

lipidi, contengono catene di zuccheri di lunghezza variabile che formano uno strato strettamente addossato alla

superficie esterna della membrana, chiamato glicocalice (o rivestimento cellulare). Esso è molto abbondante in

alcuni tipi di cellule, quali le cellule epiteliali che rivestono il canale digerente dei mammiferi, ad esempio. Il

glicocalice media le interazioni cellula-cellula e cellula-substrato, fornisce protezione meccanica alla cellula, serve da

barriera e lega importanti fattori di regolazione. Molti tipi di cellule animali sono avvolti da una matrice extracellulare

(MEC), ovvero una rete organizzata di materiale extracellulare presente nelle immediate vicinanze della m.pl. Una delle

MEC meglio definite è la membrana basale (o lamina basale), uno strato continuo spesso circa 50-200 nm che circonda

le fibre nervose e le cellule muscolari e adipose, si trova al di sotto della superficie basale dei tessuti epiteliali e sotto al

rivestimento endoteliale interno dei vasi sanguigni. Fornisce supporto meccanico, genera segnali, serve da substrato per

la migrazione cellulare, separa i tessuti adiacenti, costituisce una barriera al passaggio di macromolecole (impedisce ad

esempio il passaggio di proteine fuori dal circolo sanguigno mentre il sangue scorre attraverso i capillari), fornisce una

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Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher lauramacrinss di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Citologia e istologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Colombo Anita.

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