Riassunto esame Istologia, Istologia Monesi, prof. Canipari

ISTOLOGIA

Le cellule sono l’unità fondamentale della materia dotate di vita propria e indipendente.

I virus non possono essere considerati cellule perché non sono dotati di vita propria e necessitano di infettare un organismo vivente ed usare i suoi prodotti

metabolici per vivere e riprodursi. I virus infettano organismi eucarioti e procarioti, nel primo caso si parla di virus, nel secondo di batteriofagi. I virus sono

composti da DNA o RNA senza nucleo circondato da una membrana proteica (diversa dalla membrana plasmatica) detta capside.

Il batteriofago si ancora alla membrana di un batterio mediante appositi recettori sulla membrana e, con enzimi presenti nella coda, digerisce un pezzo della

membrana, la coda si contrae e la parte terminale di essa entra nella membrana liberando all’interno il suo DNA (la testa e la coda rimangono fuori dalla

membrana).

I virus dotati di membrana, si fondono con la membrana plasmatica della cellula da infettare e liberano all’interno DNA e capside (che sarà degradato); i virus

senza membrana vengono fagocitati dalle cellule.

Una volta all’interno, virus e batteriofagi, usano componenti della cellula ospitante (proteine, mitocondri ed enzimi) al fine di replicare il proprio DNA:

nell’infezione di batteri, una volta avvenuta la replicazione e ricostituita una membrana attorno al DNA replicato, la cellula si lisa e il contenuto virale fuoriesce;

nell’infezione di cellule eucariote si osserva endocitosi del contenuto virale (che si porta via anche un po’ di membrana plasmatica). Esistono anche i virus a

RNA che codificano DNA a partire dall’RNA (con la trascrittasi inversa) che portano il loro RNA ad essere componente stabile del nucleo della cellula infettata.

I batteri, detti procarioti, sono cellule prive di nucleo e con una sola molecola di DNA circolare. Mancano di organelli ma hanno una membrana cellulare contente

proteoglicani (zuccheri – glicosaminoglicani ­ + proteine). Hanno invaginazioni della membrana che formano mesosomi nei quali avviene la respirazione

cellulare e nel caso siano batteri fotosintetici hanno il cromatoforo contenente clorofilla e altri componenti necessari alla fotosintesi. Nel citosol del procarioto

troviamo ribosomi, particelle di RNA, proteine ed enzimi.

Gli eucarioti sono cellule complesse dotate di membrana plasmatica, di nucleo e di organelli rivestiti da membrane. All’interno del nucleo troviamo la cromatina

(DNA + proteine). Gli eucarioti possono essere unicellulari o pluricellulari e sono capaci di differenziamento.

Negli organismi pluricellulari le cellule assumono varie forme e si organizzano nei tessuti dove asserviscono ad una funzione comune. Normalmente assumono

forma sferica se poste in liquido ma nei tessuti presentano diverse forme a causa dell’interazione tra cellule diverse. Le cellule hanno dimensioni variabili tra 20

e 30 μm e sono visibili al microscopio.

Le cellule hanno un nucleo che solitamente è centrale (non sempre) e hanno un solo nucleo (non sempre) e che all’interno contiene la cromatina e i nucleoli

(dove si sintetizza rRNA) organizzati in cromosomi durante la divisione cellulare. Il nucleo è rivestito di membrana plasmatica.

Il citoplasma è una sostanza gelatinosa che contiene diversi componenti come mitocondri, RE, apparato del Golgi e via dicendo: le componenti citosoliche

differiscono in componenti necessarie alla vita cellulare (solitamente sono gli organelli con membrana), componenti specifiche in base all’attività della cellula

(miofibrille nelle cellule muscolari) e componenti nutritive. Il citosol è rivestito dalla membrana plasmatica ed è costituito da un mix di sostanze organiche

(elementi nutritivi, precursori, prodotti di degradazione) e inorganiche.

La cellula può essere capace di movimento ameboide (tipico degli organismi unicellulari), ciliato o flagellato (come per lo spermatozoo).

In definitiva il citosol si occupa delle funzioni vitali della cellula che però sono regolate dal nucleo che ha anche il compito di dirigere e garantire la duplicazione

della cellula. Il citosol e così anche la cellula e la matrice cellulare sono composti da macromolecole a loro volta costituiti da monomeri di varia natura (proteine,

zuccheri, lipidi).

Metodi analitici istologici e citologici

I tessuti sono formati da cellule e le cellule non possono essere osservate ad occhio nudo in quanto il potere risolutivo (ovvero la capacità di distinguere due

oggetti con una distanza minima tra loro) è troppo basso (per l’occhio umano è 0,1 mm). Esistono diversi metodi che ampliano la nostra capacità di osservare e

dipendono dall’ingrandimento che possiamo ottenere dell’oggetto e dalla luce che viene usata.

Nel 1600 Hooke inventò il microscopio, tutt’ora utilizzato, che necessita di preparati istologici particolari.

Non è possibile prendere un pezzo di tessuto e osservarlo e per tale motivo il tessuto che vogliamo studiare deve essere tagliato in fette di 5­10 μm (la

dimensione di una cellula) attraverso l’uso del microtomo.

Il tessuto, prima di essere tagliato, deve essere incluso in una sostanza più densa che impedisca di ottenere una poltiglia, pertanto viene incluso in una miscela

di idrocarburi alifatici detta paraffina (cera che fonde a 44­60°): prima di inserire il tessuto nella paraffina bisogna scambiare l’acqua con cui è costituita la cellula

con alcool etilico e xilolo (o fenolo) in modo che paraffina e tessuto diventino mescolabili.

• Microscopio ottico: Un fascio di luce inonda una sezione di tessuto disposta su un vetrino e passando per una serie di lenti aumenta il nostro potere

risolutivo a 0,2 μm.

• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): Un fascio di elettroni attraversa il preparato istologico e va a colpire le lenti. Dato che gli elettroni

difficilmente attraversano il composto il preparato deve avere dimensioni di 20­40 nm ed è tagliato con l’ultramicrotomo.

• Microscopio elettronico a scansione (SEM): Il fascio di elettroni illumina il vetrino e rimbalza sulle lenti con una determinata diffrazione che viene

rilevata. Il preparato non viene tagliato e viene trattato con metalli pesanti che riflettono gli elettroni.

• Microscopio a contrasto di fase: non necessita di coloranti perché si basa sulla diffrazione delle onde di luce

• Microscopio confocale: rileva piani diversi della sezione permettendo di avere una visione virtuale del composto.

Le cellule e i loro componenti, fuori dal tessuto biologico, vanno rapidamente incontro a degradazione e per poterli osservare è necessario fissarli e renderli non

degradati il più a lungo possibile (ma morti): la fissazione fa denaturare le proteine ma le rende stabili nella loro posizione originaria (perché le rendono

insolubili).

I metodi di fissazione più usati sono l’alcool etilico e le aldeidi (formaldeide per il m. ottico e gluteraldeide per l’elettronico) che formano legami con le proteine

fissandole nella loro posizione. E’ anche possibile congelare i tessuti: questo metodo rispetta maggiormente i componenti biologici a danno della struttura

generale (perché la densità dell’acqua diminuisce quando si forma un solido e la cellula scoppia) ma se svolto con l’azoto liquido preserva integra la cellula (che

volendo, se scongelata, torna in attività) ma richiede l’uso del criostato per tagliare la sezione (cioè un microtomo con bassissime temperature).

Le cellule, tuttavia, sono particolarmente trasparenti (perché sono costituite al 70% da acqua) e necessitano di colorazione per essere viste al microscopio. Non

è noto come i coloranti agiscano tranne che per i coloranti acidi o basici.

 Colorante acido: si lega a strutture basiche della cellula che vengono quindi definite acidofile

 Colorante basico: si lega a strutture basiche (come molti componenti del citosol) che si chiamano basofili.

 Coloranti idrosolubili: la maggior parte dei coloranti sono idrosolubili e richiedono che sia rimosso lo xilolo della paraffina e che l’alcool sia diluito con

acqua prima di inserire il colorante

I coloranti sopracitati non distinguono tra diverse molecole e colorano generalmente la cellula. Per cellulare alcuni componenti e non altri bisogna eseguire delle

modifiche istochimiche che ci permettono di colorare solo l’obiettivo come nel caso della colorazione di un enzima cui viene legato un substrato appositamente

colorato. Altre colorazioni specifiche prevedono di colorare selettivamente il DNA rispetto all’RNA e via dicendo.

Volendo colorare componenti tra loro simili (non enzimi) bisogna affidarsi all’immunoistochimica e si basa sull’uso di anticorpi colorati che si legano

specificatamente a una proteina piuttosto che all’altra.

* Gli anticorpi si ottengono inserendo un antigene in un organismo e aspettando la risposta immunitaria. Una volta avvenuta la risposta l’organismo produce gli

anticorpi che vengono prelevati dal sangue (anticorpi policlonali) che reagiscono su tutta la molecola. Recentemente si è potuto produrre in vitro gli anticorpi,

coltivando i linfociti dell’organismo, per la produzione di anticorpi che leghino la molecola selettivamente in una particolare regione (anticorpi monoclonali).

fluorocromo

Gli anticorpi vengono marcati con che legandosi alla molecola la rende visibile se colpita da luce ultravioletta (il composto resta al buio e si

illuminano solo gli anticorpi legati alla molecola da studiare) e studi di immunocitochimica studiano i rapporti spaziali tra componenti cellulari usando questa

tecnica.

E’ anche possibile studiare l’anticorpo, legato a qualche molecola, associandolo ad un enzima con una sua propria attività e osservando con un normale

microscopio l’attività dell’enzima e tutto il tessuto in generale.

Volendo usare l’immunocitochimica con un microscopio elettronico bisogna “marcare” gli anticorpi con metalli pensanti opachi, perché il composto sarà

illuminato da elettroni e non da luce.

Recentemente si impiegano tecniche sempre più complesse che permettono di identificare parametri morfologici della cellula come con il citometro a flusso,

dove un fascio di luce laser attraversa le cellule e un rilevatore posto dall’altro lato del vetrino vede come si distribuisce la linea del laser verticalmente e

orizzontalmente.

In biologia e istologia si usa anche il metodo della coltura cellulare che vengono fatte crescere in vitro aggiungendo al tessuto i componenti nutritivi essenziali

alla sopravvivenza (naturali, come plasma, liquido embrionali e siero di vitello o sintetici): queste tecniche hanno permesso di visualizzare il comportamento dei

tessuti come accade realmente nell’organismo, come nel caso della divisione cellulare, di replicare le cellule e impiantarle nel paziente (come nel caso di zone

ustionate) o di modificare geneticamente la vita cellulare.

In istologia sono anche importanti i metodi che studiano la composizione delle macromolecole che necessitano della separazione delle stesse: è possibile

separare gli organelli in base al peso di sedimentazione valutato inserendo un tessuto in una provetta di saccarosio sedimentato (con diversi pesi) e poi

prelevate dalla provate e divise per peso di sedimentazione (S)

Metodi e mezzi di indagine istologici (da integrare perché chiede!!)

L’istologia si prefigge di valutare l’aspetto morfologico (organizzazione, forma, rapporti) dei tessuti e lo fa mediante analisi dirette della materia vivente o analisi di

preparati fissati e colorati.

La metodologia più frequentemente usata in istologia è l’uso del microscopio ottico.

Il microscopio, attraverso un sistema di più lenti, è descritto attraverso 3 parametri:

 Potere di risoluzione – Distanza minima alla quale 2 punti possono essere distinti. Per il microscopio ottico è 0, 25 μm

 Ingrandimento – Rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e le vere dimensioni dell’oggetto

 Contrasto – Le cellule sono normalmente trasparenti a causa della loro prevalente composizione di acqua. Pertanto è opportuno usare coloranti

istologici per rendere efficiente l’assorbimento della luce da parte del microscopio (e ottenere diversi contrasti per diversi componenti)

L’uso del colorante istologico non è possibile nella cellula vivente e per ovviare a questo problema sono stati predisposti due diverse metologie:

• Microscopio a contrasto di fase ­ rileva le differenze di fase nei fasci di luce che attraversano il composto e trasforma queste differenze in contrasti

visibili al microscopio

• Microscopio a interferenza ­ simile al precedente metodo ma attraverso il quale è fornita anche una misura della massa secca del componente

(attraverso misurazioni prima e dopo la rimozione di un particolare componente cellulare).

• Microscopio in campo oscuro ­ che permette di porre in rilievi scuri i componenti cellulari in quanto la luce non è proiettata verticalmente verso la

lente ma obliquamente verso l’osservatore.

• Microscopia a luce polarizzata ­ che permette di valutare la rifrazione e la deviazione di un raggio di luce polarizzato e da questo, indirettamente,

capire la posizione relativa di componenti cellulari.

• Microscopio a fluorescenza ­ sfrutta la capacità di alcuni componenti di essere visibili se illuminati da raggi UV (diversa dalla fluorescenza

secondaria, in cui un componente è legato ad un colorante fluorescente).

• Microscopio elettronico – Permette un ottimo potere di risoluzione 0,7­1 nm e consiste nell’ “illuminare” il composto con un fascio di elettroni (prodotti

da un filamento di tungsteno) che vengono rifratti su una lente che è costituita da un campo elettrostatico.

I metodi in vivo sarebbero preferibili ma la cellula, escissa dal suo tessuto, dopo poco va incontro ad autolisi. E’ altresì possibile studiare una cellula in coltura

ma la cosa diventa particolarmente problematica perché il potere risolutivo è molto basso e il microscopio non è un ottimo strumento per valutare la

tridimensionalità della cellula.

Fissazione

Primo passo per la preparazione del vetrino necessario alla conservazione della morfologia cellulare. Consiste nel far morire la cellula rapidamente e rendere i

contenuti proteici insolubili e precipitati in modo da impedire agli enzimi litici di attivarsi. La precipitazione dei componenti cellulari crea artefatti dell’immagine

(cose che quando la cellula era in vita non si osservavano). I migliori mezzi di fissazione sono quelli che portano a precipitazioni in piccoli granuli “quasi” invisibili

come la gluteraldeide, la formalina o l’acido osmico. Gli acidi causano una rapida fissazione con precipitazioni ben visibili. Spesso viene impiegato alcool etilico.

Solitamente a questo scopo si usano delle soluzioni di varia natura.

Dopo la fissazione il tessuto deve essere tagliato in fettine sottili 3­10 μm attraverso il microtomo.

Prima di tagliare il tessuto è però necessario solidificarlo/includerlo: per fare ciò bisogna prima disidratare il tessuto (con metanolo) e poi bagnarlo con un

solvente della gelatina (paraffina) usata per solidificarlo (il solvente è lo xilolo). Se il tessuto da includere è più spesso si usa come “gelificante” plastica liquida

che viene fatta polimerizzare all’interno del tessuto.

Una volta che il tessuto è stato incluso può essere tagliato con microtomo o ultramicrotomo (che permette di avere sezioni di 20­40 nm necessarie per l’uso del

microscopio elettronico).

A causa dell’inclusione (che necessita di disidratazione) e della fissazione la cellula, necessariamente, muore.

Per aumentare il contrasto viene usato come “inclusore” l’osmio che oltre che solidificare il tessuto si lega alla lipoproteine colorandole e causando,

genericamente, un aumento di diffrazione per gli elettroni usati nel microscopio elettronico (altrimenti vengono usati metalli pesanti che con i loro atomi pesanti

causano un aumento del contrasto).

Una volta fissato, il tessuto è posto su uno strato sottile di carbonio a sua volta su una finissima rete metallica.

Recenti metodologie prevedono di congelare rapidamente il composto, solitamente con azoto liquido, e quindi causare l’evaporazione dell’acqua ponendo il

tessuto nel vuoto: in questo modo si evitano possibili artefatti causati da fissativi di varia natura. Il tessuto congelato è poi tagliato con il criostato, ovvero un

microtomo a basse T°.

Colorazione

Il tessuto fissato è posto su uno strato di vetro sottile e poi si procede con la colorazione. I coloranti sono solitamente solubili in acqua e pertanto è necessario

reidratare il tessuto eliminando la sostanza di inclusione (mediante appositi solventi, gli stessi che hanno permesso di inserire il gelificante) e reidratando il

composto diminuendo gradualmente la quantità di metanolo. Il colorante viene quindi inserito nel tessuto e si procede al montaggio, procedura che prevede di

coprire il tessuto colorato con un altro vetrino fatto aderire al primo con resine trasparenti. Prima del montaggio il tessuto colorato viene nuovamente disidratato

e gelificato.

La colorazione è solitamente impiegata per aumentare il contrasto ma, a volte, può essere usata per identificare specifiche strutture cellulari: in questo caso si

usano coloranti che si legano alle strutture da studiare (compito dell’istochimica).

Solitamente i coloranti usati sono composti organici aromatici e non è noto come facciano a colorare la sostanza: per alcuni coloranti, tuttavia, si sa che si

legano elettrostaticamente al composto da colorare; distinguiamo dunque coloranti acidi (che si legano a composti basici, detti acidofili) e coloranti basici (che si

legano ad acidi, detti basofili). I più comuni coloranti basici sono blu di toluidina, blu di metilene e gli acidi sono l’esoina e l’arancio G.

Solitamente si usano miscele di coloranti che permettono di distinguere i vari componenti cellulari: di impiego comune è l’ematossilina­eosina, dove

l’ematossilina è acida è colora di blu il nucleo e l’eosina è acida e colora di varie gradazioni di rosa i componenti del citosol.

L’istochimica è la parte dell’istologia che studia, in