Epigenetica appunti lezione

Complementarità imperfetta e blocco della traduzione

Trattandosi di una complementarità imperfetta, questo causa il blocco della traduzione e talvolta anche la degradazione soprattutto nei bassi vertebrati e nelle piante. Mentre nell'uomo e nei mammiferi si ha il blocco della traduzione. Sono stati identificati centinaia di microRNA e uno di questi può silenziare più mRNA, ma anche un singolo mRNA può essere silenziato da più microRNA.

Biogenesi dei microRNA

Come vengono originati i microRNA? Abbiamo detto che i microRNA sono codificati dal genoma e quindi ci sono geni che codificano per i microRNA. Questi vengono trascritti generalmente dalla RNA polimerasi II (stessa RNA dei mRNA), che trascrive una lunga molecola di RNA chiamato pri-miRNA, e questa molecola ha il cap e la coda di poli-a (molecola lunga circa 1000 nucleotidi). Tale molecola all'interno del nucleo viene tagliata da un enzima che è una RNAasichiamato drosha, nei pressi di una porzione a forcina e queste forcine vengono

Riconosciute dalla drosha che in realtà lavora insieme a DGCR8. La struttura che ne deriva prende il nome di pre-miRNA, che è una struttura a forcina (lunga circa 100 nucleotidi), che viene traslocata poi dal nucleo verso il citoplasma ad opera dell'esportina (proteina). Uscita, il pre-miRNA viene riconosciuta da un'altra RNAasi 3 (=dicer) che taglia il loop e in tal modo si forma una molecola a doppio filamento parzialmente complementari senza loop. Solo uno dei due filamenti, lungo circa 21-25 nucleotidi, che è il microRNA maturo, viene incorporato dal RISC che lo guida verso la molecola di mRNA target a cui si lega per parziale complementarità di sequenza.

I microRNA sono stati identificati recentemente, il primo in particolare (lin-4) nel 1993 da Victor Elegans, Ambros e i suoi collaboratori studiando lo sviluppo del verme nematode Caenorhabditis si imbatterono in una molecola di RNA molto piccola (22 nucleotidi) che regolava in maniera inusuale la

traduzione di un gene appaiandosi col suo mRNA, pensarono probabilmente di aver trovato un'eccezione, uno di quelli strani scherzi dell'evoluzione che a volte si parano davanti a chi studia gli organismi viventi. Lin-4 è parzialmente complementare all'mRNA di lin-14 e lin-28. La sintesi delle proteine lin-14 e lin-28 è normalmente repressa da lin-4 durante le fasi precoci dello sviluppo della larva di C. Elegans. Il meccanismo mediante il quale avviene questa inibizione è rappresentato in questo schema: Lin-4 riconosce il 3' primo del mRNA di lin-14 in siti multipli. Il secondo microRNA fu scoperto negli anni 2000, ed è il let-7, che codifica un miRNA che controlla la transizione dello stadio larvale L4 allo stadio adulto. Questo riconosce la porzione 3' UTR dell'mRNA di lin-41 e lin-57. Sempre nel 2000 uno scienziato italiano fornì le prove che la regolazione dei geni mediata da microRNA era presente anche in altre specie. Il miRBase è il

database pubblico che raccoglie tutte le informazione sui microRNA: 21I microRNA all'interno del database sono identificati con dei numeri, quindi dei numeri cheaumentano in base alla data di identificazione. Inoltre presentano un codice di accesso.Questa per esempio è la carta d'identità del mir-21:

Il gruppo con cui lavora il prof. Salvi qualche anno fa hanno trovato un nuovo microRNA(miR-1199), che in realtà era già stato descritto, ma loro hanno contribuito a dimostrare cheera presente in altre specie: 22Riassumiamo ora un po le principali differenze tra siRNA e miRNA:

• La complementarità (siRNA perfettamente complementari , mentre microRNA parzialmentecomplementari)
• Quando si legano al mRNA (in seguito a un legame di un siRNA viene degradato l'mRNA,invece per i miRNA si ha il blocco della traduzione)
• Legame con mRNA ( i miRNA si legano all'estremità 3primo UTR, mentre i siRNA si lega inqualsiasi porzione).

microRNA sono disregolati nel cancro, cioè il loro livello di espressione tumorale è diverso rispetto al livello di espressione nel tessuto normale. I livelli dei loro target mRNA di conseguenza vengono alterati rispetto alla condizione fisiologica. I ricercatori hanno dimostrato che ciò è direttamente implicato nella trasformazione tumorale (=processo mediante il quale una cellula normale diventa tumorale). Capire quanti miRNA sono disregolati nel cancro può essere importante nel comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base dell'insorgenza e progressione di un tumore, e nel definire terapie più efficaci basate sul ripristino dei livelli di espressione di tali miRNA.

Mettiamo ora un po' insieme tutte le informazioni che abbiamo studiato e stanno sotto incappello dell'epigenetica: La cellula normale a sinistra e cellula tumorale a destra. La metilazione del DNA e la modifica degli istoni possono influenzare l'espressione genica.

che in una cellula si traduce in un'espressione genica normale. Quando tali processi vengono alterati, allora ci spostiamo verso la cellula tumorale, dove la metilazione è aberrante, i microRNA vengono disregolati e la modifica degli istoni che silenzia, per esempio, o attiva oncogeni (che potenzialmente indirizzano la cellula verso lo sviluppo di un fenotipo neoplastico. Solitamente gli oncogeni intervengono nello sviluppo tumorale e aumentano le possibilità che lo sviluppo (proliferazione e differenziamento) di una cellula si diriga in senso tumorale).

ClinicalTrials.gov è un database che contiene tutte le informazioni sui trial clinici (gli studi sperimentali sull'essere umano per introdurre un farmaco), e sono di 3 tipi nell'uomo: di tipo 1, 2, 3. Quindi si valutano gli effetti di farmaci su porzioni piccole di persone (tipo 1), fino a grandi quantità (tipo 3).

Introduciamo ora i Long non-coding RNAs (lncRNAs): sono scarsamente conservati tra leospita la sequenza che lo codifica. Questo tipo di lncRNA può interagire con il trascritto del gene in senso opposto, formando coppie di basi complementari e influenzando la sua espressione.- Bidirezionale: in questo caso il lncRNA è trascritto nella stessa direzione del gene che ospita la sequenza che lo codifica, ma a partire da un promotore diverso.- Intergenico: il lncRNA è trascritto da una regione intergenica, cioè da una regione del genoma che non contiene geni codificanti per proteine. Gli lncRNA possono essere trascritti da regioni del genoma precedentemente considerate "spazzatura" o "DNA non codificante", ma che in realtà svolgono importanti funzioni regolatorie. La loro espressione può essere regolata da fattori di trascrizione, modificazioni epigenetiche e interazioni con proteine regolatrici. In conclusione, gli lncRNA sono una classe di molecole di RNA che svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell'espressione genica e nella modulazione di importanti processi biologici. La loro scoperta e caratterizzazione rappresentano un campo di ricerca in rapida crescita e potrebbero aprire nuove strade per la comprensione e il trattamento di molte malattie umane.loospita.- Bidirectional: il lncRNA può essere trascritto in entrambi gli orientamenti.- intergenic: la sequenza che codifica per un lncRNA è situata tra due geni adiacenti, quindi non è ospitata da nessun gene. Un'altra classificazione è quella in base al meccanismo molecolare di azione: Andiamo ora a vedere i meccanismi d'azione dei lncRNAs: - Regolazione epigenetica e rimodellamento della cromatina. - Regolazione della trascrizione. - Regolazione post-trascrizionale. Come per i microRNA, anche per i lncRNAs esistono dei database pubblici nei quali sono depositate le sequenze. I lncRNAs sono anche impiegati nell'insorgenza di patologie umane, e in particolare l'alterazione della loro struttura (per es. ripiegamenti) porta da malattie neurogenerative fino al cancro. Questi sono importanti anche nella clinica (come anche i microRNA): - Bersaglio molecolare (ripristino dei normali livelli d'espressione) - Biomarcatori tissutali e circolanti di prognosi eprogressione tumorale e di altre patologie (neurodegenerative, cardiovascolari, autoimmuni) - Biomarcatori di risposta e/o di resistenza all'azione di terapie farmacologiche o trattamenti (chemioterapia, radioterapia) Faremo ora alcuni esempi dei più famosi e studiati lncRNAs:

1. H19 (si comporta da oncogene nei tumori), è stato il primo lncRNAs ad essere identificato (circa 1989-90). Questo è un RNA che va in contro a controllo grazie all'imprinting: Il gene H19 è localizzato sul cromosoma 11 a livello del braccio corto. È importante nello sviluppo embrionale. In tale immagine troviamo il cromosoma 11 paterno e quello materno, in cui troviamo i due alleli di H19 e i due alleli di IGF2. Il gene che codifica IGF2 è vicino al gene che codifica H19. H19 è espresso solo nell'allele materno mentre per IGF2 l'allele è spento, questo perché nei pressi del gene che codifica H19, è presente una regione chiamata ICR che

può essere metilata o meno: in particolare l'allele materno presenta l'ICR non metilata, e questo fa sì che un repressore trascrizionale (chiamato CTCF) si leghi facendo sì che l'enhancer non attivi IGF2 (per il fatto che non vi è stata la creazione dell'ansa); mentre H19 può essere trascritto. Per l'allele paterno invece ICR è metilata e accade il contrario (IGF2 attivo e H19 non trascritto a causa di ipermetilazione). - Hotair (HOX Transcript Antisense RNA): - tale nome deriva dal fatto che il gene che codifica per hotair è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 12 dove sono presenti i geni che codificano per il cluster HOXC (abbiamo già visti, codificano per dei fattori di trascrizione che regolano l'arrangiamento spaziale del corpo dell'embrione e quindi il differenziamento, la suddivisione in segmenti etc... avevamo visto che nei mammiferi ci sono 4 cluster di geni HOX, mentre i

drosophila un solo cluster.). QuestolncRNAs è lungo 2158 nucleotidi.

La funzione di hotair è quella di fungere dascaffold sia all'interno del nucleo, sia nelcitoplasma. Nel nucleo hotair funge dascaffold per due fattori LSD1 e PRC2 checonsente il loro posizionamento indeterminati punti del genoma in relazione aigeni che devono controllare. In particolarePCR2 promuove la tremetilazione della lisina27 dell'istone 3: questa modifica è ilmarcatore di repressione trascrizione, quindii geni a valle vengono soppressi.

LSD1 è una demetilasi che demetila(inibisce) la lisina 4 dell'istone 3.

Nel citoplasma svolge invece una funzionetotalmente diversa, in quanto è implicato nelprocesso di senescenza delle cellule: anchein questo caso funge da scaffold per dueproteine ubiquitine l