Epigenetica appunti lezione

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.EPIGENETICA 2020.

Prof. A. Salvi

• REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENETICA NEI PROCARIOTI:

I procarioti sono i batteri che

hanno il nucleoide, quindi

hanno il dna libero nel

citoplasma. Hanno un unico

cromosoma circolare dove

sono racchiusi i geni che

codificano per proteine.

l’operone è un gruppo di

geni strutturali codificanti

per proteine con funzioni

correlate (es. coinvolte nella

stessa via metabolica)

sottoposti ad una

regolazione unica e

coordinata. Sono indotti o

repressi dal prodotto di un

gene regolatore , distinto dai

geni strutturali. Es. operone

Lac.

L’operatore (=sequenza di controllo) è una sequenza di dna interposta tra il promotore e il primo

dei geni strutturali.

Ci sono due tipi di operone nei procarioti:

1)Un operone inducibile: (il repressore da solo è in forma attiva e si

lega all’operatore e impedisce la trascrizione. Il legame con il

corepressore fa staccare dall’operatore il repressore rendendo

accessibile il promotore alla RNA polimerasi e consentendo la

trascrizione). 2

2)Un operone reprimibile: (il repressore da solo è in forma

inattiva e non è in grado di legarsi all operatore, il

promotore è accessibile alla RNA polimerasi e quindi vi è

trascrizione. In presenza di corepressore-repressore

legati all’operatore vi è il blocco della trascrizione).

Un esempio di operone inducibile è l’operone Lac di E.Coli che è stato descritto per la prima volta

da Jacob e Monod qualche anno dopo la scoperta del mRNA. Questo comprende geni strutturali

LacZ, l’operatore, il gene regolatore. A livello di promotore c’è il sito di legame della RNA

polimerasi e a monte il sito di legame con la proteina cAMP-CRP. 3

I tre geni strutturali descritti da Jacob e Monod codificano per tre enzimi, in particolare, LacZ

codifica per la B-galattosidasi, LacY codifica per una permeasi, LacA codifica per una

transacetilasi.

Questi enzimi consentono al batterio di utilizzare il lattosio come fonte di energia.

In assenza di corepressore (allolattosio), il repressore è attivo, lega l’operatore e la sintesi degli

enzimi è repressa.

Quando la cellula utilizza lattosio come fonte di energia (è presente allolattosio): il repressore si

stacca dall’operatore, l’RNA polimerasi si lega al promotore e sintetizza l’mRNA policistronico che

codifica per i tre enzimi che fanno si che la cellula usi il lattosio.

Esempio di operone reprimibile è l’operone trp (triptofano) che presenta pero il fenomeno

chiamato della attenuazione trascrizionale, cioè la regolazione della fine della

trascrizione dell’mRNA,

coinvolta nel controllo

dell’espressione di alcuni

operoni batterici. È ben

conosciuta nella trascrizione

dell’operone triptofano. Se

nella cellula la quantità di

triptofano è sufficiente, la

trascrizione si arresta in

corrispondenza di un tratto

di DNA, chiamato

attenuatore, producendo un

frammento molto piccolo di

mRNA che non codifica tutti

i geni necessari alla sintesi

del triptofano. La

trascrizione riprende

normalmente quando la

concentrazione di triptofano

risulta insufficiente.

• REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI:

Tale regolazione è diversa dalla precedente per 3 motivi principalmente:

- Negli eucarioti è presente la regolazione dell’espressione spazio-temporale.

- È presente il fenomeno del differenziamento: cellule con genoma identico, si specializzano

morfologicamente e funzionalmente attivando o reprimendo l’espressione di geni specifici.

- L’espressione di un gene eucariotico (dal DNA alla proteina) prevede molti più stadi a differenza

dei procarioti, ognuno regolato.

Esperimento di Gurdon (1962): il nucleo di una cellula somatica di anfibio (X. Laevis) venne

trasferito all’interno del citoplasma di un ovocita precedentemente enucleato. Si sviluppo l’anfibio

adulto. Questo esperimento ha dato il via alla clonazione animale.

Il DNA nucleare contiene l’intero corredi di geni necessario per generare un organismo completo. 4

Esperimento di Wilmut e Campbell: la pecora Dolly (1996-97):

Come abbiamo già detto quindi la regolazione degli eucarioti avviene secondo più step, in

particolare 6:

1. Controllo a livello genomico (variazione di un numero di copie di un gene, CNV).

- L’esempio che facciamo è quello dell’ovocita di anfibio. Qui i geni che codificano per i

precursori del rRNA, sono presenti in un numero di copie circa 1000 volte in più delle cellule

somatiche dell’anfibio. L’ovocita dell’anfibio presenta una rindondanza di nucleoli perché è

necessaria una massiccia sintesi proteica durante l’embriogenesi. L’ rDNA in eccesso risiede

quasi tutto in nucleoli extracromosomici.

2. Modulazione dello stato della cromatina (eucromatina ed eterocromatina).

- I geni attivi adottano una conformazione della cromatina più “aperta” per l’accesso della RNA

polimerasi. (cromatina con una conformazione meno condensata, quindi decondensata). 5

- Le regioni regolative dei geni hanno bassa densità nucleosomica.

- I fattori di trascrizione sono in grado di reclutare enzimi che modificano gli istoni e i fattori di

rimodellamento della cromatina.

La decondensazione della cromatina consente la trascrizione di quei geni che si trovano nella

cromatina. In questa immagine si notano dei puff (=rigonfiamenti della cromatina che

rappresentano zone di decondensazione della cromatina e siti trascrizionalmente attivi).

I cromosomi politecnici di drosophila sono cellule delle ghiandole salivari (stadio pre-pupale) dove

avviene la replicazione del dna ma non si separano i cromatidi fratelli (no segregazione). Sono

molto grandi, ogni cromosoma è costituito fino a 1024 cromatidi fratelli.

Questo fenomeno della decondensazione della cromatina ci porta alla definizione di epigenetica,

ovvero l’insieme di modificazioni chimiche di dna e istoni che hanno effetti sulla trascrivibilità della

cromatina senza modificazione delle sequenze di dna.

La più importante modifica

a carico del DNA è la

metilazione. Nel regno

animale la metilazione

delle citosine è

essenzialmente limitata

alle citosine in un contesto

CpG. Circa il 70-80% del

genoma è costituito di

nucleotidi CpG.

Il gruppo metile alla

citosina lo aggiunge la

classe di enzimi DNMT

(famiglia di quattro enzimi:

DNMT1, DNMT3A,

DNMT3B, DNMT3L).

DNMT1 è quello principale ed è il responsabile del mantenimento della metilazione del DNA.

Gli altri tre sono responsabili della metilazione de novo.

Le CpG islands indica il legame fosfodiestere tra i due nucleotidi C-G. Sono lunghe tra le

200-2000 basi e in quella lunghezza almeno la meta è C-G.

Nel genoma ce ne sono 29000 di isole e generalmente sono localizzate a livello del promotore dei

geni, e se sono ipermetilate (citosine tutte metilate) allora quel gene è silenziato, se invece le

citosine sono demetilate allora il gene è attivamente trascritto.

Nei tumori assistiamo a una disregolazione di metilazione del profilo di determinati geni. La cellula

utilizza la metilazione per controllarne il livello di espressione, ma quando la cellula si allontana da

questa condizione fisiologica, allora ci avviciniamo a condizioni patologiche, incluso il cancro.

Nei tumori troviamo i “tumors suppressor gene” che sono i geni che controllano per esempio il

livello di replicazione cellulare. Esiste inoltre un altra classe di geni, gli oncogeni che sono gli

acceleratori stimolando la replicazione.

La diregolazione di questi geni fa si che una cellula diventi tumorale.

La metilazione è un processo reversibile, ci sono enzimi che metilano una citosina ma anche

enzimi che la demitilano.

Il ruolo naturale della metilazione del dna nei mammiferi si riversa su alcuni fenomeni:

- Imprinting

- Inattivazione cromosoma X

- Mantenimento eterocromatina

- Controllo dello sviluppo

- Controllo espressione tessuto specifico 6

Nelle cellule germinali (gameti), vi è un livello di metilazione più basso rispetto all’embrione o alle

cellule somatiche degli adulti.

L’ imprinting è il profilo di metilazione specifico e diverso tra la copia paterna e quella materna di

alcuni geni.

Un dato gene è soggetto ad imprinting quando uno dei due alleli, ma sempre lo stesso in tutti gli

individui di una data specie, viene silenziato tramite metilazione delle citosine e rimane stabile per

l’intera vita dell’organismo.

Nell’uomo circa 100 geni sono soggetti ad imprinting.

es. IGF2 (fattore di crescita fetale), nell’uomo si esprime solo l’allele paterno. È silenziato l’allele

materno (perché il promotore di tale gene è ipermetilato). 7

Patologie umane associate a difetti di imprinting:

- Diabete mellito neonatale transiente

- Sindrome di wang

- Sindrome di angelman

- Sindrome di mussel-silver

- Sindrome di beckwith-wiedemann:

- Sindrome di prader-willi:

Possiamo ora dopo aver descritto metilazione e imprinting, faremo dei cenni alle tecniche che si

usano in laboratorio per studiare i livelli di metilazione del dna:

- La prima tecnologia è l’analisi della metilazione del DNA basata su enzimi di restrizione sensibili

o meno alla metilazione (MSRE): sono enzimi che sono in grado o meno di tagliare il DNA a

secondo se è metilato o meno, cioè ççççç aspetta slide….—,,—

- Conversione del DNA con il bisulfito: composto che trasforma la citosina demitilata in uracile.

Se invece la citosina è metilata il bisulfito non modifica la citosina. Applicabile nel

sequenziamento per capire quale è il tasso di metilazione di un promotore o di un gene

(contando quante C diventano U). 8

- Tecnologia cobra: tecnologia che combina il trattamento del dna con il bisulfito e l’utilizzo di

enzimi di restrizione. Il dna quindi viene trattato con il bisulfito e poi viene amplificato con la

tecnologia della PCR (si scelgono delle coppie di primer che stanno ai margini della porzione di

DNA di cui si vuole conoscere il livello di metilazione. I primer in se non contengono CpG,

perché questi stanno all’interno della porzione amplificata). Una volta che il frammento è stato

amplificato viene sottoposto al taglio di enzimi che contengono nel sito di restrizione il sito C-G

(se non c’è non c’è taglio). Generando cosi più frammenti di restrizione. Per distinguere la

lunghezza dei frammenti carico il tutto su un gel d’agarosio (vi stanno sfumature in base al<