Appunti esame Epigenetica

Epigenetica

Il termine epigenetica fa riferimento a modificazioni ereditabili nella funzione del genoma che si verificano senza cambiamenti strutturali della sequenza di DNA. Dunque, fa riferimento a cambiamenti nel fenotipo che non comportano cambiamenti nel genotipo. La regolazione epigenetica influenza numerosi fenomeni come la metamorfosi della farfalla, i polifenismi degli insetti (che si esplicano sia a livello del fenotipo sia a livello comportamentale), la differenziazione tra regina e operai negli insetti sociali. Inoltre, la regolazione epigenetica è coinvolta in differenti aspetti della vita come lo sviluppo degli organismi multicellulari. I diversi tipi cellulari che si sviluppano nel corso del differenziamento hanno tutti lo stesso genoma. Però, ogni tipo cellulare ha una funzione specifica che viene garantita da un pattern differenziale di espressione genica che viene regolato epigeneticamente.

Un altro aspetto da tenere in considerazione è il ruolo che l’ambiente esercita nel regolare le funzioni del genoma. I fattori ambientali esterni come la dieta riescono ad agire sull’espressione dei geni modulando meccanismi epigenetici come la metilazione del DNA. Un altro aspetto molto importante che coinvolge fenomeni di natura epigenetica è la patogenesi delle malattie. Infatti, molte malattie sono legate a difetti di regolazione epigenetica. Basti pensare alle malattie dovute a difetti di imprinting.

Studi su gemelli monozigoti

I gemelli monozigoti hanno esattamente lo stesso genoma. Se si seguono questi gemelli negli anni si osserva che a 3 anni d’età i profili di metilazione sono simili mentre a 50 anni d’età i profili di metilazione presentano differenze importanti. Questo si riflette anche a livello del fenotipo. Infatti, da bambini i gemelli sono assolutamente identici mentre da adulti riusciamo a distinguerli. È possibile fare quest’analisi anche mediante ibridazione in situ fluorescente. Questa tecnica consiste nell’ibridare sui cromosomi le regioni di DNA metilate provenienti da un gemello e le regioni di DNA metilate provenienti da un altro gemello. Quando c’è perfetta corrispondenza allora le sequenze metilate nell’uno e nell’altro gemello sono assolutamente identiche e questo risulta in una colorazione gialla. Quando le sequenze ipermetilate e ipometilate nell’uno e nell’altro gemello sono diverse, allora non si ottiene la colorazione gialla.

Come hanno fatto a identificare nei 2 gemelli queste diverse sequenze metilate? Hanno fatto questo attraverso una tecnica che si chiama AIMS. Si tratta di una tecnica che consiste nell’amplificazione specifica di siti intermetilati. I ricercatori sono partiti dai genomi dei 2 gemelli e hanno digerito il DNA con l’enzima di restrizione SmaI. SmaI è una endonucleasi di restrizione che taglia la sequenza CCC/GGG in corrispondenza della barra soltanto se il sestetto non è metilato. Questo taglio produce delle estremità piatte. Dopo questo primo taglio è stato fatto un secondo taglio con un’altra endonucleasi di restrizione chiamata XmaI. XmaI ha come target la stessa sequenza C/CCGGG ma taglia tra la prima e la seconda C solo quando il sestetto è metilato. Questo taglio produce delle estremità sticky. I ricercatori hanno attaccato a queste estremità sticky un adattatore e poi in un esperimento di PCR hanno utilizzato degli oligo disegnati su questo adattatore. Quindi, a partire da ogni gemello hanno amplificato tutte le sequenze di DNA metilate.

In un gemello le sequenze metilate prodotte con questa PCR sono state marcate con un fluorocromo rosso. Nell’altro gemello le sequenze metilate sempre prodotte con questa PCR sono state marcate con un fluorocromo verde. Dopodiché, queste sequenze sono state riunite e ibridate sui cromosomi dei singoli gemelli. Laddove sul cromosoma si vedeva il giallo significava che il DNA marcato col verde e il DNA marcato col rosso ibridavano sulla stessa regione, che era quindi metilata allo stesso modo. Questo succedeva nei gemelli a 3 anni d’età. Se invece i pattern rossi e verdi erano differenziali, come è stato visto a 50 anni d’età, questo significava che le sequenze metilate in un gemello non lo erano nell’altro gemello e viceversa. Infatti, il rosso e il verde si separano e non co-localizzano dando il giallo.

Gli studi su gemelli sono stati estremamente importanti non solo per chiarire il fatto che l’epigenetica rende differenziale il pattern di espressione genica in coppie di gemelli con lo stesso genoma ma anche per chiarire quali malattie avessero una determinazione prevalentemente genetica e quali malattie invece avessero una determinazione prevalentemente ambientale. In caso di una malattia a determinazione genetica mi aspetto che entrambi i gemelli abbiano la malattia. Invece, in caso di una malattia a determinazione ambientale non per forza entrambi i gemelli manifestano la malattia. Ad esempio, la dislessia ha una forte componente genetica. Invece, per l’artrite reumatoide la componente ambientale è preponderante rispetto alla componente genetica.

Regolazione epigenetica del gene Agouti

Oggi parleremo della regolazione epigenetica del gene agouti che codifica per la feomelanina. Gli alleli genetici sono forme alternative dello stesso gene e sono polimorfici e quindi differiscono tra di loro per la sequenza di DNA. Invece, gli epialleli sono 2 sequenze assolutamente identiche che però esibiscono un pattern di espressione differenziale in relazione alla loro organizzazione cromatinica. In questo sistema di regolazione del gene agouti possiamo identificare sia degli alleli genetici sia degli epialleli.

Il gene agouti presenta 2 alleli genetici. Il primo di questi è l’allele “a” e si chiama allele agouti. Si tratta di un allele genetico recessivo assenza di funzione. Questo significa che nella sequenza dell’allele agouti a è presente una lesione molecolare che fa sì che l’allele a non sia in grado di codificare per una proteina agouti funzionale. Oltre all’allele genetico a esiste anche un altro allele genetico del gene agouti che viene indicato come allele “A” e si chiama agouti viable yellow. Questo allele è dominante rispetto all’allele a. Questo allele A presenta subito a monte del sito d’inizio della trascrizione del gene agouti l’inserzione di un elemento retrotrasponibile che si chiama IAP. IAP è un elemento retrotrasponibile LTR molto frequente nel genoma murino. È un elemento retrotrasponibile di classe I quindi traspone attraverso un intermedio a RNA. La sua presenza a monte del sito d’inizio della trascrizione del gene agouti definisce l’allele agouti viable yellow.

Questo allele genetico esiste in 2 forme epialleliche. Questi 2 epialleli agouti viable yellow differiscono tra di loro per il pattern di metilazione che si trova sull’elemento trasponibile IAP. L’epiallele nella sequenza è esattamente uguale all’allele genetico. L’unica differenza è nello stato di metilazione del DNA in corrispondenza di IAP. In una situazione normale di un individuo eterozigote A^vy/a il retrotrasposone IAP è metilato e il gene agouti viene espresso normalmente ossia nella giusta finestra temporale.

Quando questo gene funziona normalmente il topo presenta una colorazione scura del manto e all’estremità terminale del pelo la colorazione è giallina. Questa colorazione giallina è proprio dovuta all’espressione del gene agouti in una specifica finestra temporale durante lo sviluppo del topo. Invece, quando il retrotraspone IAP non viene metilato allora il gene agouti viene espresso ectopicamente. Infatti, gli elementi trasponibili contengono all’interno delle loro sequenze dei putativi siti promotori. Quindi, il gene agouti anziché utilizzare per la propria trascrizione il suo promotore endogeno utilizza il promotore donato dal retrotrasposone. Quindi, il gene agouti viene espresso ectopicamente. Un gene viene espresso ectopicamente quando viene espresso in un tessuto dove normalmente non deve essere espresso o in una finestra temporale in cui normalmente non viene espresso. In questo caso viene espresso in un momento molto più esteso durante lo sviluppo del topo. Quindi, viene prodotta la feomelanina in un prodotto temporale molto più esteso. Questo comporta una colorazione completamente gialla del manto del topo. In genere, questi topolini gialli sono anche obesi perché hanno un metabolismo alterato dei lipidi. Sviluppano diabete perché hanno anche un metabolismo alterato degli zuccheri.

Se ai topolini di sesso femminile viene fornita una dieta che favorisce la metilazione di IAP come, per esempio, una dieta a base di supplementi di acido folico allora la progenie avrà colorazione scura del manto. Quando invece questi supplementi non vengono forniti allora la colorazione del manto della progenie sarà prevalentemente giallina in quanto non c’è disponibilità di donatori di gruppi metile e IAP non verrà metilato. Quindi, l’ambiente modificando i profili di espressione genica può alterare i fenotipi.

Organizzazione della cromatina e modificazioni epigenetiche

L’epigenetica modifica l’espressione dei geni in maniera indipendente dalla sequenza. Questo è possibile perché la regolazione epigenetica è una regolazione che dipende dalla struttura della cromatina. Negli organismi viventi esiste una evidente sproporzione tra la lunghezza totale del DNA genomico e le dimensioni del nucleo. La problematica posta da tale elementare considerazione va ben oltre la questione strutturale. La precisione spaziale e temporale propria dei processi replicativi e trascrizionali troverebbe difficilmente spiegazione in assenza di un ordine strutturale all’interno del nucleo.

All’interno del nucleo eucariotico il DNA è strutturalmente e funzionalmente organizzato in un complesso nucleoproteico estremamente dinamico formato da DNA, proteine istoniche e proteine non istoniche: la cromatina. La cromatina si compatta in livelli di impacchettamento via via progressivi. Il più alto grado di compattamento della cromatina viene raggiunto durante la divisione nucleare e si realizza nel cromosoma metafasico. Il primo livello di impacchettamento della cromatina è rappresentato dalla fibra di 10 nm o collana di perle. La fibra da 10 nm è formata dal DNA che si avvolge intorno all’ottamero istonico formando il nucleosoma ossia l’unità strutturale della cromatina. Le proteine istoniche sono H2A, H2B, H3 e H4. Si tratta di proteine basiche molto piccole. Queste proteine si assemblano a formare appunto all’ottamero. In particolare, 2 dimeri H2A-H2B si legano al tetramero H3-H4. Il DNA fa 1,65 giri intorno al nucleosoma (circa 146 nucleotidi). Tra un nucleosoma ed il successivo vi è un tratto di connessione lungo fino a 80 nucleotidi associato all’istone H1 (DNA linker). Ogni istone presenta delle code N-terminali che protrudono dal nucleosoma e che possono essere variamente modificate post-traduzionalmente compromettendo o facilitando l’interazione dell’ottamero con il DNA. Ad esempio, l’acetilazione è una modifica che favorisce una cromatina meno densamente compattata e quindi più propensa alla trascrizione. Invece, la metilazione è in genere associata a una cromatina più compatta e quindi a repressione trascrizionale (vd. H3K27me3 e H3K9me3). Sul DNA agiscono 3 elementi: writers che scrivono la modifica, erasers che cancellano la modifica e readers che leggono la modifica. Oltre alle modifiche delle code istoniche anche i lncRNA possono contribuire all’organizzazione strutturale della cromatina.

Il secondo livello di organizzazione gerarchica della cromatina è rappresentato dalla fibra di 30 nm. La fibra da 10 nm si avvolge su se stessa a formare il solenoide ossia una super-elica con 6 nucleosomi per giro. La fibra di 30 nm è stabilizzata dalle code N-terminali degli istoni del core nucleosomale e dall’istone H1. Si susseguono livelli di compattamento via via successivi fino alla formazione del cromosoma metafasico.

Nel modulare lo stato conformazionale della cromatina non solo sono importanti le modifiche a carico delle code degli istoni ma sono importanti anche le varianti istoniche. Si tratta di proteine basiche che presentano caratteristiche strutturali e funzionali estremamente simili a quelle degli istoni. La loro peculiarità è quella di sostituire gli istoni canonici in certi contesti cromatinici. Ad esempio, l’istone H3.3 è una variante istonica dell’istone H3 ed è associata ad attivazione trascrizionale. Infatti, H3.3 rende la cromatina più lassa e meno densamente compattata. Anche le varianti istoniche, così come gli istoni canonici, possono essere modificate post-traduzionalmente a livello delle code N-terminali. In condizione di stress termico in Drosophila si attiva il cluster di geni che codifica per le proteine heat shock. L’istone H3.3 partecipa a questa attivazione che è immediata.

CENPA è un’altra variante dell’istone H3 e sostituisce l’istone H3 nelle regioni cromosomiche di cromatina centromerica. Serve dunque alla formazione del centromero. Questo non significa che in tutta la cromatina centromerica in tutti i nucleosomi l’istone H3 è sostituito da CENPA. Le varianti istoniche dell’istone H2A sono H2AX, H2AZ e macroH2A. H2AX è estremamente importante perché sostituisce H2A in corrispondenza delle rotture a doppio filamento. Quindi, la sua presenza segnala la rottura agli apparati proteici che servono per riparare il danno al DNA. La variante macroH2A è molto importante durante l’inattivazione del cromosoma X nei mammiferi ed è associata a cromatina trascrizionalmente silente. Infatti, garantisce un’elevata densità di compattamento della cromatina.

Compensazione del dosaggio

La compensazione del dosaggio è un meccanismo che permette alle cellule di eguagliare il dosaggio dei geni associati al cromosoma X in tutte le specie in cui le femmine sono XX e i maschi sono XY. Se non ci fosse il fenomeno della compensazione del dosaggio le femmine esprimerebbero in doppia dose tutti i geni associati all’X. Per ovviare a questo problema si attuano negli organismi diverse strategie di compensazione del dosaggio. Ad esempio, nelle femmine di C. elegans i 2 cromosomi X hanno un passo di trascrizione ridotto a metà rispetto all’X dei maschi. In Drosophila, il cromosoma X dei maschi è ipertrascritto.

Nei mammiferi molto precocemente durante lo sviluppo uno dei 2 cromosomi X viene completamente silenziato ed eterocromatinizzato. In questo fenomeno di silenziamento è coinvolta la variante istonica macroH2A. Gli studi sull’eterocromatina hanno fornito le basi per la comprensione dei fenomeni epigenetici. Uno dei principali meccanismi epigenetici dell’espressione genica coinvolge modificazioni conformazionali a carico della cromatina. Tutti i genomi eucariotici sono caratterizzati dalla presenza di 2 distinti domini nucleoproteici che esibiscono differenti caratteristiche strutturali e funzionali.

Eterocromatina ed eucromatina

L’eterocromatina è costituita da regioni cromosomiche estremamente condensate che attraversano l’intero ciclo cellulare senza subire sostanziali modificazioni nel loro stato di condensazione e che mostrano eteropicnosi positiva in profase. L’eucromatina mostra una minore densità di impacchettamento e assume un aspetto diffuso in interfase. Nel 1966 Brown distinse l’eterocromatina in costitutiva e facoltativa. L’eterocromatina costitutiva è rappresentata da regioni cromosomiche che sono sempre eterocromatiche. Si trova dunque associata al centromero, ai telomeri e alle regioni organizzatrici del nucleolo. L’eterocromatina facoltativa è costituita da regioni che sono normalmente eucromatiche ma che in determinati tipi cellulari o in determinati momenti dello sviluppo assumono le caratteristiche strutturali tipiche dell’eterocromatina costitutiva.

Il corpo di Barr è un esempio tipico di eterocromatina facoltativa. Da un punto di vista strutturale l’eterocromatina facoltativa è esattamente uguale all’eterocromatina costitutiva. Però, i determinanti epigenetici che definiscono l’eterocromatina facoltativa sono diversi dai determinati epigenetici che definiscono l’eterocromatina costitutiva. In entrambi i casi parliamo di una cromatina densamente compattata e quindi di una cromatina incompatibile con l’attività trascrizionale. Però, questa elevata densità di compattamento viene raggiunta attraverso dei meccanismi molecolari diversi. Nell’eterocromatina costitutiva i marker epigenetici tipici che partecipano alla compattazione sono prevalentemente la dimetilazione e la trimetilazione dell’istone H3 nella lisina 9. Invece, un marker tipico dell’eterocromatina facoltativa è la trimetilazione dell’istone H3 nella lisina 27. L’eterocromatina si dispone alla periferia del nucleo in associazione alla lamina nucleare mentre l’eucromatina permea il resto dello spazio nucleare oppure si trova in corrispondenza dei pori nucleari.

Il termine “eterocromatina” è stato coniato da Heitz (1928) per definire le regioni cromosomiche che rimangono condensate durante il ciclo cellulare ed esibiscono eteropicnosi positiva in profase. Anche in profase, ovvero quando la cromatina è fortemente decondensata, queste regioni eterocromatiche sono molto visibili proprio in relazione alla loro elevata densità di impacchettamento. Le caratteristiche principali sono: localizzazione pericentromerica, telomerica e in corrispondenza delle regioni organizzatrici del nucleolo; replicazione tardiva e cioè le regioni di eterocromatina sono quelle che durante la fase S vengono replicate più tardivamente; ridotta ricombinazione meiotica; alto contenuto di sequenze mediamente ed altamente ripetute; bassa densità di geni; i geni eterocromatici sono molto grandi in quanto possiedono introni molto lunghi; intrinseca plasticità.