Enzimi e regolazione enzimatica

Enzimi e regolazione enzimatica

Enzimi

La spontaneità della reazione può essere calcolata dalla Keq e quindi, quando ho il valore della k, posso dire in che senso la reazione è spontanea. La spontaneità della reazione è correlata al valore di ΔG. Dato un ΔG negativo —> la reazione è esoergonica. Qualsiasi reazione con ΔG negativo è una reazione che spontaneamente va verso la formazione dei prodotti e libera energia.

Esempio: reazione acqua ossigenata. Se una reazione ha un ΔG negativo c'è ancora un altro fattore da considerare: il tempo. Quindi questa reazione è spontanea. Se metto l’acqua ossigenata su un taglio, nel taglio ci sono i globuli bianchi che muoiono per difenderci e morendo liberano il loro contenuto, tra cui l’enzima catalasi che accelera questa reazione.

Le reazioni possono quindi essere spontanee ma impiegare un tempo lunghissimo —> c'è la barriera del tempo. Nelle reazioni bisogna tenere conto della velocità delle reazioni. In ambito industriale, si alza la temperatura per accelerare le reazioni. Negli esseri umani, la temperatura è costante e per questo ci sono gli enzimi —> proteine codificate dal DNA che servono per accelerare e regolare le reazioni chimiche dell’organismo. Sono dei catalizzatori biologici che aumentano la velocità di reazione.

È importante riconoscere che non alterano l’equilibrio della reazione stessa. Se la reazione è esoergonica avviene più velocemente, ma se lo metto in una endoergonica, non la fa avvenire perché non cambia l’equilibrio, ma solo la velocità di reazione. Siccome gli enzimi sono catalizzatori, essi partecipano alla reazione, la velocizzano, ma non si modificano e alla fine della reazione sono identici all’inizio e possono continuare la loro funzione di catalasi.

Per mantenere la sua identità, l’enzima avrà bisogno di coenzimi che sono aiutanti dell’enzima che però si modificano nella reazione. Tutti gli enzimi, da quando sono stati scoperti, sono classificati in sei importanti classi. Dato un enzima, viene inserito in una classe.

Classi di enzimi

• Ossidoriduttasi —> Enzimi che catalizzano reazioni redox, che avranno sempre bisogno di un coenzima che li aiuti nella catalisi delle ossidoriduzioni.
• Transferasi —> Trasferiscono gruppi, hanno sempre bisogno di coenzimi.
• Idrolasi —> Idrolizzano legami.
• Liasi
• Isomerasi —> Operazioni di isomerizzazione.
• Ligasi —> Catalizzano legami come legami covalenti ex novo, hanno sempre bisogno di energia perché catalizzano quasi sempre reazioni endoergoniche e di coenzimi.

Molti enzimi necessitano di cofattori che si dividono in:

• Ioni metallici
• Coenzimi

La maggior parte degli enzimi necessita di ioni metallici es. Zn, Fe, Mg, ecc. I coenzimi sono molecole più grosse che possono essere attaccate all’enzima addirittura prendendo il nome di gruppo prostetico oppure essere vicino all’enzima quando opera l’azione di catalasi. I coenzimi sono molecole molto grosse e complicate, ognuno di questi è derivato vitaminico. Le vitamine servono quindi a costruire i coenzimi.

Esempio: vitamina B12 va a formare un importante complesso enzimatico che si usa in certe reazioni.

Deidrogenasi

• NAD (Nicotin ammina dinucleotide) è formata da:
  • Adenosina
  • Zuccheri
  • Vitamina nicotinammide

È un importante enzima della classe delle deidrogenasi, catalizza reazioni redox. Quindi in queste reazioni ci sono spostamenti di elettroni, ma non potendosi modificare l’enzima, i coenzimi hanno la capacità di cedere e accettare protoni. Le deidrogenasi catalizzano le redox aiutate da questo importante coenzima che accetta o cede protoni. Forma ossidata —> NAD+ o NAD ossidato, Forma ridotta —> NADH accetta un protone.

• FAD (Flavin adenina dinucleotide) è sempre un coenzima delle deidrogenasi. C’è la flavina derivato vitaminico —> aiuta anche lui nelle redox. La molecola può accettare protoni. FADH2 —> ridotto, FAD —> ossidato. Il FADH2 prende due protoni mentre il NADH solo uno.

Quando scrivo NADH devo mettere di fianco H+ perché c’è conservazione della materia e questo protone sta intorno al NADH —> NADH/H+.

Transferasi

Sono enzimi che trasferiscono gruppi. Tra queste abbiamo la chinasi, esse trasferiscono l’ultimo gruppo fosfato dell’ATP su un’altra molecola fosforilandola. Sono molecole che tagliano il fosfato da ATP e lo legano ad un’altra molecola. Se non c’è questa molecola, l’ATP non diventerà mai ADP + P perché sarebbe una reazione troppo lenta per avvenire spontaneamente nelle nostre cellule.

Gli enzimi sono molto grossi, molto più grossi del substrato su cui devono andare a lavorare.

Sito catalitico

Tutti gli enzimi hanno un sito detto sito catalitico o sito attivo che riconosce il substrato. L’enzima per esempio, deidrogenasi, conosce solo l’etanolo —> il sito catalitico riconosce la molecola e soprattutto la molecola si va a legare al sito catalitico dell’enzima giusto. Ci sono enzimi talmente specifici che riconoscono solo un substrato.

La maggior parte degli enzimi sono solubili, la maggior parte hanno anche strutture quaternarie che assumono una conformazione ben definita nello spazio ed è costruito in modo tale da permettere il riconoscimento del sito catalitico. Il sito catalitico è costruito con amminoacidi in modo tale che ci sia il riconoscimento del substrato. Tra il substrato e il sito catalitico si formano solo legami deboli (ponte idrogeno, idrofobici, ecc.). Il substrato si lega al sito catalitico e si ha la velocizzazione delle reazioni in qualche modo.

Essendo l’enzima una proteina, le cariche elettriche del sito catalitico degli amminoacidi sono molto importanti per la funzionalità della proteina. Essendo una proteina è influenzata da variazioni di:

• pH
• Temperatura

Effetto del pH

Variando, variano le cariche degli AA del sito cat. Per esempio, la maggior parte degli enzimi hanno un pH ottimale, nel caso del nostro organismo il pH ottimale è attorno a 7,3 e 7,4 che è quello fisiologico. Se io abbasso o alzo il pH cambio le cariche e le interazioni dell’amminoacido - sito catalitico e cambio affinità. Es. la pepsina ha un massimo di funzionamento di pH tra 1,5 e 2 perché funziona nello stomaco, quando il cibo va nell’intestino il pH è più basico e la pepsina smette di funzionare. La tripsina funziona invece a pH più alto che è caratteristica dell’intestino. La colinesterasi che degrada acetilcolina funziona a pH più alti.

Effetto temperatura

L’enzima, essendo una proteina, a temperature alte o basse cambia la conformazione, cambiando la conformazione altera il sito catalitico e quindi non riconosce in modo corretto il substrato e non fa andare la reazione. A temperature basse la molecola diventa più rigida e il sito catalitico non riesce ad adattarsi al substrato, a temperature alte invece la proteina viene denaturata. La temperatura negli organismi viventi è attorno a 36/37°C.

Perché e come l’enzima accelera la reazione?

ΔG negativo —> la reazione è spontanea. La riporto su assi cartesiani —> ascissa tempo / ordinata ΔG. Dalla curva si vede che la curva a una variazione energetica sale, fa un picco e poi scende subito a picco. La molecola deve passare prima ad una conformazione ad alta energia che è poco probabile, più il picco è elevato, più la conformazione è ad alta energia, meno è probabile che venga raggiunta e quindi la reazione è più lenta.

Più è alto il picco, più la reazione è lenta perché esiste una bassa probabilità che la molecola si porti in cima al picco e poi scenda. L’enzima abbassa l’energia di attivazione. Come fa l’enzima ad abbassare l’energia di attivazione? Se metto l’enzima, il substrato si lega all’enzima, l’enzima aiuta il substrato a portarsi nella conformazione ad alta energia, questo significa che il substrato interagendo con il sito catalitico e con eventuali coenzimi aiuta il substrato ad arrivare nella conformazione particolare —> si abbassa quindi l’energia di attivazione —> la reazione viene quindi velocizzata.

Più riesco ad abbassare il picco, più velocizzo la reazione.

Esempio

Una delle vie più importanti di cui parleremo per la produzione di energia è la glicolisi. Il glucosio in presenza di ossigeno darà CO₂ e acqua e durante la reazione si producono -2870kj/mole. Questa reazione ha un’energia di attivazione molto alta, quindi la probabilità che ciò avvenga senza niente è praticamente impossibile. La reazione è invece spezzata in fasi intermedie con molti enzimi che abbassano enormemente l’energia di attivazione rendendo la reazione velocissima, soprattutto se la cellula è in carenza energetica perché è una reazione fortemente esoergonica.

Riconoscimento substrato-enzima

Come fa il substrato a riconoscere l’enzima giusto? Come fa a portare il tutto nello stato di transizione ecc? Ci sono varie teorie:

• Teoria chiave-serratura —> Il substrato riconosce l’enzima come una chiave nella serratura —> la molecola di glucosio è riconosciuta dall’enzima glucochinasi perché è perfettamente specifico e speculare al substrato. Se però il substrato è esattamente complementare al sito catalitico chi lo fa muovere e gli fa assumere la conformazione, quindi questa teoria inizia a vacillare.
• Teoria dell’adattamento indotto —> Il sito catalitico non è speculare al substrato ma alla struttura che il substrato deve ottenere quando si porta allo stato attivo. Se il sito catalitico porta più velocemente alla conformazione ad alta energia questo mi porta a velocizzare la reazione. Il sito catalitico non è quindi speculare al substrato, ma è speculare allo stato ad alta energia.

Il sito catalitico è speculare alla forma della molecola nello stato di transizione. Ogni enzima funziona in modo diverso e ha delle caratteristiche particolari che permette al substrato di raggiungere lo stato di transizione. Una strategia per esempio è che le molecole continuano a spostarsi di conformazione, se il substrato lo porto nel sito catalitico la molecola diventa più rigida e più facilmente essa riesce ad arrivare alla conformazione ad alta energia bloccando i movimenti.

Un’altra strategia è che le molecole che sono solubili nel citosol è avvolta da un guscio di solvatazione e questo guscio di acqua non permette facilmente le reazioni con altre molecole e ci sia la formazione di legami. Se il substrato per entrare nel sito catalitico (idrofobico) deve togliere il guscio d’acqua, la molecola deve cambiare conformazione perché si trova in un ambiente diverso che è idrofobico e quindi cambia conformazione.

Un’altra strategia è delle cariche, se nel sito catalitico so che ho una carica elettrica o positiva oppure negativa, quando arriva il substrato le interazioni con le cariche portano alla modifica del substrato.

Cinetica enzimatica

Abbiamo visto che una reazione ha solo una Keq. Io ho il substrato che si lega all’enzima, si forma il complesso enzima-substrato, si formerà poi un complesso enzima-prodotto dove il prodotto è ancora legato all’enzima. Quindi le reazioni sono tante. Abbiamo poi un’ultima reazione che è lo sgancio del substrato dall’enzima. Ognuna di queste reazioni ha la sua Keq. Se io riesco a definire tutte queste k posso dire quanto la reazione è veloce e l’enzima efficiente.

Nel 1913 il dottor Michaelis con la dottoranda Menten iniziano a studiare e risolvere questa situazione. Michaelis si chiede come dare un ordine alle Keq e capire come tutto funzionava. Iniziano ad affrontare il problema con elaborazioni matematiche. La legge è —> corrisponde ad una curva data una concentrazione di enzima fisso, con una concentrazione di substrato in aumento quale sarà la velocità di reazione —> essa sarà data da un fattore che è Vmax x concentrazione substrato/km (comprende tutte le k di eq) + concentrazione substrato.

Si ottiene una curva a iperbole che tende a infinito ad un valore asintotico che è la velocità massima. Quindi se aumento la concentrazione di substrato a valore infinito la reazione tende a Vmax senza mai arrivarci però. Se ho 100 molecole di enzima e 2 di substrato la probabilità che l’enzima trovi il substrato è altissima, aumentando il substrato la reazione va sempre veloce perché c’è ancora poco substrato. Aumentando la concentrazione del substrato sempre di più, l’enzima inizia ad andare in difficoltà; quindi è chiaro che la velocità diminuisce tendendo in modo asintotico ad una velocità massima che non raggiungerà mai.

Vmax —> velocità massima a cui il mio enzima tende senza mai arrivarci. All’interno delle cellule, le quantità degli enzimi sono abbastanza costanti, la quantità del substrato posso invece aumentarla ma non arriverà mai a concentrazioni infinite all’interno della cellula.