Endocrinologia Granata parte 4

GHRHR

promoter Poi c’è ancora un altro meccanismo che è

GHRHR

gulatory pathways in pituitary somatotrophs

PKA l’attivazione della proteinchinasi A, che a

GHRHR GHRHR sua volta può fosforilare CREB, che a livello

nucleare induce sia la sintesi del GHRH sia

la sintesi quindi la trascrizione del GH, per cui ha un

effetto sulla secrezione e sulla trascrizione, quindi sulla

produzione a livello genico del GHRH (questa è una

cellula somatotropa dell’ipofisi anteriore). Il R del

GHRH e della sst, uno che stimola la subunità G

via L. Asa & Shereen Ezzat

2

presses cell-surface receptors for growth-hormone-releasing hormone (GHRH), a seven-

ain G-protein-coupled receptor. Ligand binding induces conformational changes that result in

from the β- and γ-subunits

-subunit of the stimulatory G protein (Gs), which activates adenylyl

stimolatoria e l’altro che stimola la G inibitoria perché hanno effetti opposti, poi di nuovo

CREB a livello nucleare provoca l’attivazione di TFs, come FOS e PIT1, che inducono un

aumento del GH che poi viene rilasciato e ha i suoi effetti classici. Questo è invece uno studio

abbastanza vecchio che vi fa vedere l’espressione sia del GHRH sia del GHRH-R, quindi

vedete come si trovino espressi molto a livello del SNC però anche in organi periferici, come

ad esempio il cuore, infatti sono stati fatti molti studi sul cuore. Ci sono alcuni lavori che

hanno dimostrato gli effetti centrali e periferici degli antagonisti del GHRH, gli effetti

periferici sono l’effetto endocrino, che stimola il rilascio del GH, mentre a livello locale il

GHRH è capace di promuovere la riparazione delle ferite (wound-healing) e la proliferazione

e la migrazione dei fibroblasti che contribuiscono alla riparazione delle ferite. Hanno un

effetto importante di cardioprotezione, inducono la sopravvivenza dei cardiomiociti, e hanno

anche effetti sulla riparazione del miocardio in seguito ad ischemia riperfusione. Hanno effetti

sulle isole pancreatiche perché promuovono la sopravvivenza delle isole pancreatiche ma

anche la secrezione di insula, hanno effetti sul sistema immunitario perché regolano il

differenziamento e anche la produzione di citochine. Hanno effetti sulla riproduzione, forse

sulla placenta ma non è ancora chiaro, e anche sulla crescita dei tumori. Partendo dalla

GHRH promuove la guarigione delle ferite

riparazione delle ferite vedete ad esempio questo studio, sempre fatto dal gruppo di Schally,

in cui hanno fatto il cosiddetto scratch S, cioè

si prendono delle cellule, si mettono in coltura,

e con la pipetta si fa una specie di graffio o

solco sulla plastica, si mette lo stimolo e si

vede la velocità che hanno le cellule per

riparare questo scratch. Qua è stato usato il

GHRH 100 nMolare e il JI-38, che invece è un

analogo del GHRH, e vedete come entrambi

sono capaci di promuovere la chiusura di

queste ferite (ci sono i grafici che dimostrano

l’effetto). Però, se si usano concentrazioni

troppo elevate l’effetto non si vede più, si vede

prevalentemente a 100 nMolari. Questo è lo

stesso studio, in cui per oltre a fare un

esperimento in vivo l’hanno fatto anche in

vivo, quindi hanno creato nel topo una ferita e hanno visto cosa succedeva mettendoci il

HRH and JI-38 induce migration of cultured mouse embryonic fibroblasts (MEFs). (A) Scratch migration assay of MEFs

posed to 100 nM GHRH or JI-38 showed increased migration of cells as compared with controls. (B) GHRH and JI-38 at

GHRH oppure l’analogo JI-38 a diversi tempi. Il GHRH e JI-38 con l’andare del tempo a

0 nM significantly increased migration of MEFs in an 8-μm-pore transwell system. (C) GHRH stimulated proliferation of

GHRH promuove la guarigione delle ferite

EFs but only at a concentration of 100 nM. *P < 0.05.

circa 10 giorni creano una chiusura della ferita, che è più rapida rispetto alla guarigione

Dioufa N et al. PNAS 2010

normale in assenza dello stimolo. Questo è il

grafico che vi mostra come il JI-38 e il GHRH

abbiano un effetto più veloce rispetto al

controllo nel promuovere la guarigione della

ferita. Nel pancreas invece è stata studiata

l’espressione del GHRH-R, e si è visto che il

GHRH è capace di promuovere la

sopravvivenza e la proliferazione delle isole

pancreatiche umane e riduce l’apoptosi (anche

il JI-36, che è un altro analogo, utilizzato a

diverse concentrazioni ha gli stessi effetti). Poi

hanno fatto uno studio in vivo, in cui hanno

trapiantato delle isole pancreatiche di topo in

Dioufa N et al. PNAS 2010;107:18611-18615

topi diabetici, e hanno visto che pretrattando queste isole con GHRH si aveva un

Healing of 4-mm circular skin wounds in mice exposed to GHRH or GHRH agonist JI-38 twice per day at 100 nM. Four

miglioramento sia dei livelli di glucosio. All’inizio il glucosio è molto elevato nei topi

wounds were generated in each mouse and always included controls, exposed to vehicle alone. Time points and

reatment regimens are indicated. (A) Representative microphotographs of control, GHRH, and JI-38-treated wounds on

diabetici, poi dopo il trapianto c’è un miglioramento del glucosio che invece non si osserva

ays 0, 5, and 10 after incisions. Relative wound area is shown in the graph (B). Experimental groups for wound-area

measurements consisted of 5, 7, and 5 wounds, respectively for the control, GHRH, and JI-38-treated wounds. Data are

xpressed as mean ± SEM of percent wound area relative to wound area on day 0. *P < 0.05.

ptor (GHRH-R) in adult rat ventricular

ARVMs) and H9c2 cardiac cells

nei topi non trattati con il GHRH, cioè con l’analogo JI-36. È stato fatto anche un test di

tolleranza al glucosio, sempre in questi topi, e il trattamento con l’analogo porta ad una

riduzione del glucosio, mentre nei topi non trattati non si arriva nemmeno alla riduzione

completa dei livelli del glucosio, dimostrando che anche in vivo il trattamento con questi

cardiac myocyte analoghi possa migliorare anche il trapianto delle isole pancreatiche e

che si possa utilizzare anche per il trapianto delle isole nel diabete di

GHRH-R tipo I. Noi siamo stati i primi a dimostrare gli effetti del GHRH a

RNA livello cardiovascolare, adesso è stato studiato dopo da Schally

soprattutto, e abbiamo fatto vedere che la forma ipofisaria del R è

201 bp presente sia nelle H9c2, che sono dei cardiomiociti di ratto che si

tengono in coltura, ma anche nei cardiomiociti di ratto adulto che

abbiamo isolato e ottenuto dal ratto e utilizzato in questi studi. Qui

vedete un cardiomiocita adulto di ratto, dove si dimostra l’espressione

del GHRH-R. Lo studio di Schally fa vedere essenzialmente la stessa

cosa, c’è il controllo dell’ipofisi per l’espressione del GHRH-R in

verde, quelli in blu sono i nuclei con DAPI, nel cuore c’è

l’espressione del GHRH-R, mentre nel muscolo scheletrico non è

Granata R et al, Cardiovasc Res 2009 espresso. Voi sapete che l’infarto del miocardio è un evento che

porta all’apoptosi dei cardiomiociti, quindi una delle cose che si

fa per studiare il cuore è proprio valutare gli effetti apoptotici di

diverse sostanze, perché succedono diversi fenomeni nell’infarto

del miocardio in cui c’è un tentativo di compensazione che porta

ad un aumento di diverse sostanze, fra le quali le catecolamine,

l’angiotensina, l’aldosterone, oppure semplicemente lo stress

meccanico, che poi inducono apoptosi dei caridomiociti, per cui

uno dei sistemi è quello di capire se ci può essere un modo per

prevenire l’apoptosi dei cardiomiociti. Le catecolamine a loro

volta agiscono sui R betadrenergici attivando diverse vie di

segnale, anche a livello mitocondriale, che portano ad esempio

all’attivazione delle caspasi e quindi alla perdita del

funzionamento dei cardiomiociti e anche alla morte per necrosi o

per apoptosi. Noi abbiamo valutato gli effetti del GHRH (la concentrazione migliore è stata

0,5 micromolare) su cardiomiociti adulti di ratto, ma anche sulle cellule H9c2, in presenza di

isoproterenolo, che è un agonista betadrenergico che induce apoptosi, e osservato che a

diverse concentrazioni il GHRH è capace di promuovere la sopravvivenza, che è invece

GHRH counteracts ISO effect on PNAS 2010

ridotta dall’isoproterenolo, e di inibire anche l’apoptosi. Poi un modo per dimostrare che

Inducible cAMP Early Repressor (ICER) increase in ARVMs

l’effetto è mediato dal R è quello di utilizzare un antagonista, noi abbiamo utilizzato

l’antagonista JV-1-36, che blocca il legame del GHRH al R, e abbiamo osservato che in

presenza dell’antagonista questo effetto protettivo di GHRH veniva perso, dimostrando che

ICER mRNA

era un effetto mediato dal GHRH-R- l’antagonista poi di per sé era capace anche di ridurre la

sopravvivenza di queste cellule, dimostrando ancora una volta che l’antagonista da solo può

avere degli effetti di inibizione. GHRH poi stimola nei cardiomiociti

delle vie di sopravvivenza, che sono le MAPK 1 e 2 e PI3K/AKT,

quindi le classiche vie di proliferazione e sopravvivenza, anche se

cAMP

ISO sapete che i cardiomiociti non proliferano ma è comunque una via di

GHRH sopravvivenza. Agisce attraverso le vie classiche del R, quindi

ICER

PKA attivando l’cAMP, l’adenilato ciclasi e la proteinchinasi A, perché in

presenza dell’inibitore si ha la perdita degli effetti di sopravvivenza

ICER protein

Bcl-2 del GHRH, e porta anche ad un aumento della fosforilazione di

CREB CREB. La cosa strana però era che l’isoproterenolo agisce attivando

l’cAMP, la proteinchinasi A e CREB, quindi ci si è chiesti come

Apoptosis fosse possibile che il GHRH inducesse la protezione attraverso le

stesse vie dell’isoproterenolo, che invece fa morire le cellule. Quindi abbiamo valutato quale

potesse essere la differenza e abbiamo scoperto che c’è questa piccola via di segnale, che si

chiama ICER, che viene attivata dall’isoproterenolo. ICER a sua volta è proapoptotico, quindi

Cardiovasc Res, 2009 riduce Bcl-2 che è una proteina antiapoptotica, se però mettiamo il GHRH ICER si riduce,

quindi vuol dire che il GHRH è capace di inibire questa parte delle vie di segnale bloccando

gli effetti dell’isoproterenolo.

Questi studi sono stati fatti anche nel cuore isolato, nel modello di Langendorff, che è un

cuore del ratto o del topo che viene tolto dall’animale e viene messo in un sistema o apparato

che permette l’ossigenazione, quindi il flusso continuo verso il cuore, come se fosse un cuore

in vivo però in realtà è