Endocrinologia Granata parte 3

Baragli et al., Plos One 2013 In press

glucagone, che è importante perché

l’ormone che viene espresso prima

dell’insulina. Nei controlli invece il

glucagone veniva espresso poco, e al

giorno 15 l’obestatina era capace di fare aumentare notevolmente l’insulina rispetto al

controllo, quindi questo suggeriva che effettivamente era capace di farle differenziare verso le

islets/h) beta cellule. Se poi andiamo ad osservare la produzione di insulina, che in questo caso è

valutata come secrezione del C peptide e non dell’insulina, perché quest’ultima era già

(pmol/ml/5 presente nel terrone di coltura (non si

poteva studiare la secrezione di insulina

islets/h)

C-peptide

(pmol/ml/5

C-peptide Glucose (mM) Plos One 2013

Glucose (mM) Plos One 2013

perché qualcuno poteva obiettare dicendo che le cellule captavano l’insulina del terreno e la

rilasciavano dopo, il C peptide è il precursore dell’insulina ed è indice di secrezione di

quest’ultima), e vedete come l’obestatina a diverse concentrazioni di glucosio era capace di

stimolare la produzione del C peptide in queste isole, dimostrando di nuovo che funziona

nella rigenerazione delle isole e anche nella produzione di insulina. Abbiamo studiato anche i

meccanismi attraverso i quali l’obestatina aveva questi effetti e brevemente vi posso die che

l’obestatina agisce inibendo quelle vie che bloccano il differenziamento nel senso endocrino,

quindi blocca la via del FGFRs e di Notch che bloccano la neurogenina3, che invece è

fondamentale per il differenziamento, e attiva invece la via di neurogenina. Quindi c’è un

aumento della neurogenina, sia per quanto riguarda l’espressione ma anche all’interno delle

isole pancreatiche blocca i pathway che inibiscono il differenziamento, quindi anche il

White AT Brown AT

meccanismo è quello che va verso il

differenziamento endocrino. Poi ci sono ancora gli

studi che abbiamo fatto sugli adipociti, perché sia

grelina acilata, desacilata e obestatina sono capaci

di indurre il differenziamento degli adipociti,

hanno degli effetti a livello adipocitario. È stato

dimostrato che se si toglie il R di grelina nel topo

c’è un miglioramento della massa adiposa (quella

più chiara), che si riduce nel topo KO rispetto al

controllo, e anche un aumento del grasso bruno,

che è considerato un tessuto metabolicamente

attivo e importante sia per quanto riguarda la

termoregolazione, ma anche per l’omeostasi del

glucosio. Diversi studi hanno anche fatto vedere

che cosa fa l’obestatina negli adipociti, noi siamo stati fra questi, e abbiamo dimostrato che

negli adipociti innanzitutto l’obestatina è capace di legare il GLP1R, come abbiamo visto

anche nelle beta cellule. Questo è stato fatto mettendo sia l’agonista, exendin4, sia

l’antagonista, l’exendin9, nelle stesse cellule vedete che c’è uno spiazzamento, cioè i peptidi

competono con l’obestatina per il legame con l’ipotetico R e questi due peptidi vanno a

spiazzare il legame dell’obestatina marcata. La stessa cosa succede se si utilizzano diverse

concentrazioni di obestatina non marcata, ossia a 100 micromolare e ad 1 micromolare,

queste spiazzano l’obestatina marcata e competono con essa per il legame al R, suggerendo

che l’obestatina lega in modo specifico un R su queste cellule. Se invece si utilizza un peptide

che non c’entra niente l’obestatina continua a legare il R delle cellule senza problemi.

Abbiamo fatto anche un silenziamento, infatti silenziando queste cellule per il R di GLP1 non

vedete più di nuovo l’obestatina che si lega sulla superficie delle cellule, a dimostrazione del

fatto che l’obestatina lega il R di GLP1. L’obestatina è prodotta dagli adipociti, questo è stato

fatto sia su linee di ratto 3T3-L1, sia su adipociti umani sottocutanei e viscerali, (eravamo in

b promotes differentiation of mouse and human adipocytes

contatto con dei chirurghi alle Molinette che ci davano grasso viscerale e sottocutaneo

derivato da interventi chirurgici) abbiamo isolato gli adipociti dal grasso e abbiamo potuto

fare poi gli studi. L’obestatina è capace di prevenire

l’apoptosi nelle 3T3-L1 (adipociti di ratto) trattate in

condizioni di deprivazione di siero, c’è infatti un

aumento dell’apoptosi con deprivazione di siero e in

seguito all’utilizzo dell’obestatina c’è una riduzione

dell’apoptosi, la stessa cosa per l’attivazione delle

caspasi 3. Promuove AKT ed ERK1e2, se voi inibite

queste vie si vede una perdita dell’effetto

antiapoptotico di obestatina, suggerendo che le vie

coinvolte sono le stesse che abbiamo visto per grelina.

La cosa interessante è che è capace di promuovere il

differenziamento degli adipociti, questo è un metodo di

studio per vedere il differenziamento in cui si mette il

cosiddetto oil red, che è un olio specifico che viene

incorporato dalla parte lipidica degli adipociti, e vedete che man mano che si trattano gli

adipociti con l’obestatina c’è un aumento di queste gocce lipidiche, che suggerisce come ci

sia un aumento del differenziamento degli adipociti con l’obestatina rispetto al controllo.

Questo si è visto sia nelle 3T3-L1, ma anche nel grasso sottocutaneo umano. Inibisce anche la

lipolisi, quindi la degradazione del grasso quindi un aumento degli acidi grassi circolanti, per

cui ha un effetto importante su questo che avviene attraverso un aumento della fosforilazione

dell’AMPK, che è un importante regolatore della lipolisi. È capace poi di promuovere

dell’uptake del glucosio negli adipociti, sia quando utilizzata da sola, ma anche quando

vengono trattate con insulina, che è capace di far aumentare l’uptake del glucosio, e quindi se

voi utilizzate anche l’obestatina c’è un effetto additivo rispetto all’insulina, quindi c’è un

ulteriore aumento a dimostrazione che l’obestatina è capace di promuovere l’uptake.

Promuove anche la traslocazione del GLUT4, che è un trasportatore importante del glucosio

negli adipociti, e vedete come nei controlli il GLUT4 si trova prevalentemente a livello

nucleare, se voi mettete l’obestatina il GLUT4 trasloca verso la membrana della cellula, a

dimostrare che promuove la traslocazione del GLUT4 in modo simile all’insulina. Abbiamo

anche visto che inibendo SIRT1, che è un regolatore del trasporto del glucosio, nelle cellule

che venivano silenziate per SIRT1 l’obestatina non era più capace di promuovere l’uptake del

glucosio come in condizioni normali. (Era stato possibile vedere che l’obestatina era capace

di far aumentare i livelli di SIRT1, suggerendo che questo meccanismo (trasporto del

glucosio) era mediato dall’aumento di questa proteina.) Infine, nei topi trattati con una dieta

ricca di grassi l’obestatina è stata capace di far aumentare i livelli di insulina, di migliorare la

tolleranza al glucosio, e anche di promuovere il rilascio di insulina nelle isole pancreatiche di

questi topi, sia nella condizione di dieta povera di grassi, sia in quella ricca di grassi, quindi

ha un effetto positivo anche sulla secrezione di insulina in vivo nel topo. L’obestatina regola

la funzione degli adipociti in vivo in topi con una dieta ricca di grassi, promuove l’uptake del

glucosio che è ridotto dalla dieta, riduce la lipolisi che è invece aumentata dalla dieta, e fa

aumentare il numero di adipociti di piccole dimensioni, e questo è importante perché quando

sono piccoli rispondono meglio agli effetti dell’insulina, quindi sono insulino-sensibili e sono

metabolicamente più attivi. L’obestatina riduce anche l’apoptosi, che è invece aumentata

dalla dieta ricca di grassi, che è stata data ai topi per via intraperitoneale. Infine, riduce i

livelli di citochine circolanti, che sono aumentate dalla dieta ricca di grassi, come TNFalfa e

IL-1beta, mentre fa aumentare la liponectina, che invece ha un ruolo positivo sul

metabolismo. Nei tessuti come il grasso sottocutaneo promuove anche un aumento di AKT e

di AMPK, che è fondamentale nel metabolismo del glucosio, quindi complessivamente ha

effetti antinfiammatori e metabolici positivi su questi topi. Gli effetti sul sitema nervoso

centrale: questo è uno studio che abbiamo pubblicato molto recentemente ed è molto

interessante infatti, oltre al ruolo dimostrato dell’obestatina a livello del SNC, come

l’inibizione della sete, ci siamo chiesti cosa facesse nella neurogenesi, soprattutto sulla

sopravvivenza delle cellule ippocampali. La neurogenesi avviene prevalentemente a livello

dell’ippocampo e , soprattutto nell’adulto, è molto importante perché è un modo per

rigenerare i neuroni, che si pensava una volta accadesse solo a livello neonatale o infantile,

ma in realtà la neurogenesi avviene anche nell’adulto. Ed è importante per l’ippocampo, che è

una zona molto importante per la memoria e per le funzioni cognitive. Nel SNC c’è la

cosiddetta nicchia neurogenica che fa sì che vi siano delle cellule staminali e dei progenitori

che possono proliferare e differenziare nelle diverse linee cellulari e nei diversi tipi di cellule

del SNC, fra i quali gli oligodendrociti, gli astrociti e i neuroni. Questo avviene attraverso un

rinnovamento della cellula, la proliferazione, il differenziamento, la migrazione verso i siti

specifici in cui deve avvenire l’integrazione finale di questi neuroni differenziati, che vanno

poi ad integrarsi nelle diverse parti del cervello. Nell’adulto la neurogenesi avviene

nell’ippocampo, che è la zona deputata alla neurogenesi, che è una zona importante per

l’apprendimento, la memoria e il controllo delle emozioni. Ci sono diversi segnali, sia

ambientali sia di altro genere, che possono influenzare la neurogenesi. Possono essere per

esempio l’esercizio, i farmaci antidepressivi, l’apprendimento che è uno stimolo naturale di

neurogenesi, fattori ambientali o anche l’elettroshock è un altro sistema che promuove la

neurogenesi, questi sono diciamo fattori endogeni che a loro volta innescano il rilascio di

fattori di crescita a livello del SNC, che ulteriormente influenzano la neurogenesi. Ci sono

però anche segnali negativi sulla neurogenesi, che possono essere la depressione, lo stress,

l’invecchiamento, i glucocorticoidi sono degli ormoni che hanno un effetto negativo sulla

neurogenesi, il deficit dell’ormone della crescita è un altro meccanismo, quindi c’è un

equilibrio importante fra la neurogenesi, la plasticità neuronale, qui