Endocrinologia Granata parte 3

Lezione 7

L’altra volta avevamo parlato degli ormoni che inibiscono il rilascio del GH, ovvero la

somatostatina, oggi invece parliamo di un altro ormone, che si chiama ghrelin, che però ha

diverse forme che vedremo, e che invece stimola il rilascio del GH, quindi ha un effetto

opposto rispetto alla somatostatina. Vi ricordate l’asse GH-Igf-1, ossia a livello ipotalamico ci

sono degli ormoni che vendono rilasciati, ossia la somatostatina che inibisce il rilascio del GH

da parte dell’ipofisi, e invece il GHRH, sempre rilasciato dall’ipotalamo, che stimola il

rilascio del GH dall’ipofisi. Il GH che viene rilascio dall’ipofisi può avere degli effetti diretti

e indiretti: gli effetti diretti sono sul fegato, perché il GH legandosi ai R che si trovano a

livello del fegato promuove il rilascio di un altro ormone, ovvero l’Igf-1, che promuove la

crescita e la proliferazione cellulare, oppure può avere degli effetti indiretti sui tessuti

bersaglio, sono prevalentemente effetti metabolici, e sono effetti opposti rispetto all’Igf-1,

infatti il GH induce insulino-resistenza, fa aumentare l’adiposità, quindi ha degli effetti sul

metabolismo del glucosio che sono essenzialmente negativi. Igf-1 ha un effetto di inibizione

di feedback negativo sul rilascio di GH, quindi è un sistema di controllo, e oltre a questi

ormoni che avete visto adesso sono stati individuati negli anni 70 dei peptidi, che casualmente

erano stati individuati mentre si stavano studiando degli altri composti a scopo terapeutico, in

particolare dei peptidi che derivavano da sostanze oppioidi che avevano azione simile

oppioide, come per esempio la metionina encefalina. Sono tutti di derivazione sintetica,

quindi tutti prodotti chimicamente, che avevano la capacità di stimolare il rilascio del GH, e

non si sapeva per quale motivo, quindi erano state scoperte tutte queste sostanze che venivano

usate a scopo terapeutico, come per esempio in condizioni di deficit di GH o situazioni in cui

era necessario avere un aumento del rilascio di GH. Questi erano detti GH secretagoghi,

ovvero che avevano la capacità di stimolare il rilascio di GH, e i più conosciuti e studiati

erano il GHRP2 fra quelli peptidici, e fra quelli non peptidici c’era l’MK-0677, studiato a

lungo per queste funzioni.

GHS peptidici (GHRPs) GHS non peptidici

- (D-Trp2)-MetEnkephalin 1976

- GHRP-6 1984

- GHRP-1 1991

- Hexarelin 1992 - L-629,429

- GHRP-2 1993

1994 - L-692,885

1995 - MK-0677

- EP-51389 1996

- Ipamorelin 1998 Adapted from Kojima et al., Physiol Rev 2004

del recettore “GH secretagogue

Scoperta receptor (GHS-R)”

Però, nonostante ci fossero questi peptidi, non si sapeva ancora quale fosse il R riconosciuto

(Howard et al., Science 1996)

da queste sostanze. Soltanto successivamente, nel 1996, il gruppo di Howard ha scoperto il

cosiddetto R di GH secretagoghi, che è un R simile a quello del GHRH, quindi un R

accoppiato a proteine G, che una volta legato da questi peptidi GH secretagoghi era capace di

far aumentare i livelli del Ca2+ intracellulare a livello delle cellule dell’ipofisi somatotrope

(che rilasciano il GH), e in questo modo attraverso l’aumento del Ca2+ facevano aumentare i

livelli e la secrezione del GH. Però c’era un problema in più, nel senso che esisteva un R, ma

questo R non aveva un ligando perché questi peptidi che avete visto erano tutti sintetici,

quindi se esiste un R nel nostro organismo doveva esserci per forza un ligando naturale che

lega questo R. per questo motivo ci sono diverse strategie per identificare le molecole e

sostanze che possono legare i cosiddetti R orfani, ovvero che il quale non è stato identificato

un ligando. Per quanto riguardo i GPCR sono moltissimi ancora quelli orfani, ci sono tanti R

che non hanno al momento un ligando, ma in questo caso l’importante era identificare il

peptide che legasse questo R, e qual è la strategia per fare questo? Innanzitutto identificare il

R e quindi capire quali sono le cellule che esprimono questo R, ed era stato identificato dal

gruppo di Howard che ha clonato ed identificato questo GHS-R. Dopodiché bisogna creare

un modello che overesprima questo R, perché se noi facciamo overesprimere una cellula

questo R e poi trattiamo queste cellule con una serie di estratti di tessuti cellulari possiamo

vedere se c’è una risposta sul secondo messaggero per esempio (trattandosi di un R

accoppiato a proteine G), quindi noi facciamo overesprimere queste cellule con il R, le

trattiamo con degli estratti proteici o tissutali, qualcosa che noi supponiamo che contenga il

ligando naturale del R, e vediamo se c’è un aumento del Ca2+ indotto da questi estratti

proteici. In seguito facciamo una purificazione se vediamo che c’è un aumento del secondo

messaggero, facciamo una purificazione e da questa, che può essere per cromatografia o

utilizzando tecniche più recenti, si può isolare e identificare fra le diverse sostanze quella che

lega questo R. Dopo che è stato isolato si studiano le funzioni del ligando, che cosa fa nelle

diverse cellule, l’espressione nei diversi tessuti, e in generale l’approccio quando si individua

un nuovo ormone è sempre quello di caratterizzarlo. Nel caso dei GH secretagoghi si pensava

inizialmente che questi estratti o sostanze, che potessero contenere il ligando naturale del

GHS-R, si trovassero nell’ipotalamo, perché essendo rilasciato a livello dell’ipotalamo

l’ormone e legandosi all’ipofisi per stimolare il GH si era partiti da un estratto ipotalamico. In

realtà facendo tantissimi estratti ipotalamici si era visto che non si otteneva niente, cioè non si

riusciva a trovare questo ipotetico ligando. Successivamente il gruppo giapponese di

Kangawa ha pensato poi che questo ipotetico ligando potesse derivare dallo stomaco, perché

il R aveva degli effetti simili al R GPR28, e quindi invece di cercare il ligando endogeno

nell’ipotalamo l’hanno cercato nello stomaco, ed effettivamente isolando estratti proteici di

stomaco e, incubando questi estratti nelle cellule che contenevano questo R, si sono accorti

che c’era effettivamente una risposta. Da qui hanno capito che stranamente questo ormone si

trovava nello stomaco, però mancava ancora un pezzo, infatti questo peptide, che loro

à à

avevano chiamato ghrelin (da grow crescere, e releasing rilascio), non funzionava sulla

stimolazione del GH così com’era, perché mancava ancora un ulteriore pezzo, che era

un’addizione del gruppo octanoico di acidi grassi sulla serina 3 di questo peptide. Questi

giapponesi sono invasatissimi, infatti non smettono mai di lavorare, e uno di questi che vedete

Ghrelin, ligando endogeno naturale del GHS-R

era il chimico, forse Kojima, che mentre era sul treno ha avuto un’illuminazione, dopo che ci

ha pensato non so quanto tempo, ed ha capito c’era questo gruppo octanoico, che ha buttato

giù su questo foglietto che vedete, riuscendo quindi ad identificare la forma finale del ligando.

La scoperta di ghrelin è un esempio di farmacologia inversa: identificato prima il

recettore (GHS-R), poi il suo ligando (ghrelin)

“ghre,” “grow,”

Ghrelin: da che significa crescere

gh (GH) + relin (releasing) = ghrelin

Good results in research depend partly on luck. Though, it

may be hackneyed to profess that good luck in research depends

on the researcher's passion, I believe it's true.

Kojima M. The discovery of ghrelin--a personal memory. Regul Pept. 2008 ;145:2-6.

Questo perché soltanto il gruppo octanoico fa in modo che questo peptide possa legarsi al R,

senza questo gruppo il peptide non si lega al R e di conseguenza non indice nemmeno la

stimolazione del GH. Quindi è un esempio di farmacologia inversa, perché anziché

identificare prima l’ormone e poi il R è stato identificato il R e poi il ligando. Hanno quindi

isolato questo ormone ghrelin, ed hanno iniziato a studiare che cosa facesse, e hanno visto che

fra le attività principali c’era appunto quella di stimolare la secrezione del GH delle cellule

ipofisarie, sia in vitro che in vivo in diversi modelli animali e anche nell’uomo, e si è vista la

capacità di grelina di stimolare proprio la sintesi e la secrezione del GH. Per quanto riguardo

l’ACTH e la prolattina, in studi successivi, è stato dimostrato che sono anch’essi stimolati

dalla grelina, anche se in quantità inferiori rispetto al GH. Non è poi finito qui, perché ci si è

chiesti successivamente in che modo questo peptide normale venisse attaccato un acido

grasso a livello di un aminoacido, e a lungo i chimici hanno studiato come mai c’era questa

acidazione. Hanno scoperto solo successivamente, due gruppi di due diverse industrie

farmaceutiche, un enzima, che hanno chiamato GOAT (ghrelin O-acyltranferase), che era

capace, grazie agli acidi grassi presenti nell’organismo, di promuovere l’acilazione di questo

peptide, catalizzando questa reazione per far sì che ci fosse l’acilazione sulla serina 3. Questa

Regolazione del metabolismo energetico

è stata una scoperta importante che poi ha portato a studi successivi per vedere cosa

succedeva se si inibiva l’acilazione della grelina, vedendo le conseguenze sulla mancata

acilazione. Adesso vi parlerò della regolazione della fame, perché? Perché la grelina, oltre a

stimolare la secrezione del GH, una

delle sue principali azioni è quella di

stimolare l’assunzione del cibo, cioè è

un peptide che induce il senso di fame.

Fa questo sempre attraverso il R dei

GH secretagoghi e sempre grazie a

questa acilazione che ha sulla serina 3.

Esistono delle forme diverse che non

hanno l’acilazione, ma che fanno cose

diverse, quindi soltanto la grelina

acilata è in grado si stimolare la

produzione del GH e l’assunzione del

cibo. Qui vedete uno schema sulla

regolazione dell’assunzione del cibo:

ci sono innanzitutto diversi ormoni

rilasciati sia dal tratto

gastrointestinale, sia dagli adipociti

Ghrelin (come ad esempio la leptina rilasciata

dal grasso) o l’insulina rilasciata dal

pancreas, che inibiscono l’assunzione

(colecistochinina) del cibo, quindi la leptina per

(glucagon-like

peptide 1)

Morton CJ et al., Nat Rev Neurosc 2014 definizione è uno degli ormoni più

L’omeostasi energetica è un processo mediante il quale l’organismo mantiene le

importanti nella regolazione del cibo perché inibisce la fame. Tutti questi ormoni hanno delle

riserve di grasso regolando l’equilibrio tra l’assunzione ed il consumo dell’energia

funzioni importanti dipendentemente da quando voi mangiate, perché vengono rilasciate in

seguito all’assunzione del cibo, oppure nel caso di ghrelin vengono indotti dalla mancanza del

cibo e quindi stimolano la fame. Ovviamente l’assunzione del cibo induce un senso di sazietà

che va ad inibire l’ulteriore assunzione del cibo, e la sazietà andrà anche ad inibire il

cosiddetto reward, ossia il senso di appagamento che si ha dal cibo, e quindi vi mancherà la

voglia di mangiare ulteriormente se avete appena mangiato. Ci sono sei segnali a lungo e

breve termine che arrivano al SNC da parte del tratto gastrointestinale per dire mangia o non

mangiare, e questi sono, per quanto riguarda il segnale a lungo termine, quelli rilasciato dal

tessuto adiposo, quindi dalle riserve di grasso, come la leptina, mentre quelli a breve termine

possono essere la grelina o altri peptidi come GLP1, che è quell’ormone che a livello del

pancreas ha degli effetti positivi sulla secrezione insulinica e regola anche l’assunzione del

cibo in senso negativo, quindi la inibisce, e si comporta come la leptina sostanzialmente. I

peptidi gastrointestinali sono molto importanti per la regolazione dell’assunzione del cibo e

Peptidi gastrointestinali

per tutta l’omeostasi di tutto l’organismo, agiscono attraverso delle afferenze vagali che

arrivano al cervello e

trasmettono degli impulsi a

livello del cervello. Questi

sono i principali ormoni che

vedete nel tratto

gastrointestinali, come il GLP1

nel colon, la grelina nello

stomaco, il pancreas è uno dei

principali organi che produce

questi peptidi come l’insulina

e il glucagone, e poi il GLP1 è

prodotto da diverse

componenti del tratto

gastrointestinale. La cosa

GLP-1, glucagon-like peptide 1 interessante è che tutti i peptidi

CCK, colecistochininca

GRP, gastrin-releasing peptide hanno un effetto di inibizione

PP, polipeptide pancreatico

NMB, neuromedina B sull’assunzione del cibo e

Cummings DE & Overduin J, J Clin Invest 2007

grelina è l’unico che stimola l’assunzione del cibo, quindi è stata una scoperta importante

Meccanismi centrali di regolazione dell’appetito

perché nessuno si aspettava di individuare qualcosa che avesse questo ruolo, infatti sul

momento quando era stato scoperto questo ormone c’è stato un grandissimo interesse perché

poteva essere implicato nello studio dell’obesità e nello studio del comportamento alimentare.

Qua vedete diversi ormoni che

possono o stimolare o inibire

l’assunzione del cibo: per

esempio, la grelina che stimola

l’assunzione del cibo viene

prodotta dalla stomaco, arriva ai

nuclei arcuati dell’ipotalamo nel

SNC, agisce attraverso il proprio

R su questi neuroni che si

chiamano NPY e, stimolando

questi neuroni particolari,

stimola il rilascio di proteine che

agiscono nei nuclei arcuati

nell’ipotalamo su altri neuroni

per promuovere l’assunzione del

cibo, quindi per spostare il

bilancio sul food intake. Invece

altri ormoni come la leptina,

rilasciata dal tessuto adiposo, il GLP1 rilasciato dal tratto gastrointestinale, o altri come PYY

Schwartz MW & Morton GJ, Nature 2002

rilasciato dal colon, che agisce inibendo questi nuclei che stimolano la fame bloccando gli

effetti dei neuroni che stimolano la fame, e come l’insulina che agiscono stimolando invece

quei neuroni che bloccano la fame, quindi hanno un effetto opposto rispetto alla grelina.

Questi sono i cosiddetti neuroni propiomelanocortinici che fanno sì che vi sia il rilascio

dell’ormone melanocortina, che agisce sugli stessi neuroni su cui agiscono quelli stimolati

da grelina, inibendo la fame. Come spesso succede, i neuroni NPY possono a loro volta

inibire quelli che bloccano la fame, così come quelli che bloccano la fame possono invece

inibire quelli che stimolano la fame, quindi ci sono sempre dei meccanismi di regolazione

sullo stimolo della fame. Quindi, come vi ho detto prima, grelina è stata scoperta per il fatto

di avere questa capacità di stimolare l’appetito e l’assunzione del cibo, quindi ci sono diversi

peptidi, che sono la grelina rilasciata dalla stomaco, che stimola a livello ipotalamico

l’assunzione del cibo e altri come molti ormoni del tessuto adiposo, fra cui la leptina, che

invece hanno un effetto opposto. Fra questi c’è anche l’insulina, che è invece un ormone

pancreatico, che ha effetti anch’essa sulla inibizione dell’assunzione del cibo. Ricordiamo

anche l’azione incretinica del GLP1, che a livello pancreatico è capace anche, oltre ad avere

mi di ghrelin nella regolazione ipotalamica dell’appetito

effetti sulla fame, di promuovere il rilascio dell’insulina e promuovere la sopravvivenza della

beta cellula. Qui vedete le afferenze vagali, ossia la

grelina è in grado si stimolare a livello

centrale l’assunzione del cibo, quindi la

fame, grazie anche a queste che arrivano al

cervello, e quindi comunicano con il SNC

dal tratto gastrointestinale. Quest’ultimo è

α MSH una zona del nostro corpo

(melanocortina) interessantissima, perché a sua interno

vengono rilasciate tantissime sostanze ed è

molto innervata, tant’è che era stato

considerato come un secondo sistema

nervoso. Ovviamente non lo è perché ha

funzioni diverse, però avendo questa

innervazione così importante è considerato

Leptin una zona cruciale del nostro organismo. La

(adipocytes) grelina è rilasciata dallo stomaco,

attraversa la barriera ematoencefalica,

entra nell’ipotalamo e stimola i neuroni

NPY/AgRP attraverso il legame con il R

ein; ARC, arcuate nucleus of GHS. Questi neuroni stimolati, una volta

gamma-aminobutyric acid;

sferase; MC4R, melanocortin attivati, rilasciano questi peptidi che sono

melanocyte-stimulating le NPY/AgRP nei nuclei paraventricolari

ide Y; POMC, pro-

araventricular nucleus. dell’ipotalamo, quindi una zona diversa dell’ipotalamo. Qui di nuovo si legheranno ad un R

Briggs and Andrews, Neuroendocrinol 2011

specifico per promuovere il comportamento alimentare, quindi in questo caso l’assunzione del

cibo. Una cosa in più che hanno questi neuroni è la capacità di inibire quelli che invece

bloccano l’assunzione del cibo, che si chiamano POMC proopiomelanocortinici, quindi non

soltanto la grelina stimola l’assunzione del cibo, ma a bloccare anche l’effetto di altri ormoni

come la leptina che invece inibisce l’assunzione del cibo, e lo fa anche attraverso il rilascio

Ghrelin e obesità

del neurotrasmettitore GABA, che legandosi al R blocca l’effetto di questi altri ormoni e

quindi è inibito il rilascio della melanocortina e l’effetto sul blocco dell’assunzione del cibo,

quindi sul senso di sazietà. Oltre a questi effetti la grelina può anche direttamente arrivare ai

nuclei paraventricolari dell’ipotalamo per stimolare i neuroni, quindi può anche bypassare la

prima parte, ma questo ulteriore meccanismo in realtà non è stato ancora ben