Riassunto esame Embriologia, Embriologia Umana, De Felici, prof. Canipari

Embriologia

L'embriologia consiste nello studio dei processi molecolari e strutturali che succedono nel passaggio da una cellula uovo fecondata a un organismo adulto. È una scienza antica e solo con l’uso del microscopio si è avviata la reale ricerca embriologica.

Ricerca e tecniche in embriologia

La ricerca in embriologia si affida a studi citologici ed istologici (mediante l’uso di microscopio ottico, TEM e SEM) e anche della “coltura d’organo” che prevede il prelievo di porzioni di tessuto embrionale per osservare in vitro come questo si sviluppa nel contesto delle relazioni cellulari. A volte è necessario isolare un determinato tipo cellulare all’interno di una coltura cellulare primaria e questo è reso possibile tramite digestione da parte di enzimi proteolitici e affini e la separazione degli elementi cellulari (anche con citofluorometria a flusso che permette di legare gli antigeni portati da un determinato tipo cellulare con anticorpi appositamente sintetizzati).

Recentemente l’embriologia e l’istologia hanno applicato metodi ingegneristici allo studio di processi morfo-funzionali all’interno della cosiddetta ingegneria tissutale che ha lo scopo di creare tessuti 3D funzionalmente e strutturalmente paragonabili al tessuto reale al fine di poterli usare in esperimenti o ripristino di tessuti lesionati. Per costruire tessuti e organi artificiali si usa il metodo scaffold nel quale si permette a cellule di aderire a una struttura formata da materiali biocompatibili con la preforma dell’organo da “costruire” che sarà successivamente assorbita dal corpo in modo tale da far restare solamente il tessuto/organo di interesse.

È possibile studiare i tessuti e le cellule mediante le tecniche istochimiche che prevedono la fissazione e la colorazione di un tessuto o anche mediante tecniche di immunofluorescenza che prevede l’uso di anticorpi marcati a fluorescenza per poter osservare determinati antigeni ad essi legati mediate l’irradiamento con raggi UV. È altresì possibile usare anticorpi non marcati da fluorocromi ma da enzimi idrolitici di qualcosa specifica e osservare il legame di questi con l’antigene, nel punto dove l’enzima lavora, con il normale microscopio ottico.

Microscopia e tecniche analitiche

• Microscopia a fluorescenza: I preparati assorbono luce di una determinata lunghezza d’onda se trattati con specifici reagenti ed emettono la luce al termine della stimolazione che viene analizzata dal rilevatore.
• Microscopio confocale: Permette di ottenere immagini tridimensionali del tessuto perché rileva sottili sezioni di tessuto in sequenza perché viene illuminato solo un fluorocromo alla volta rendendo possibile un’analisi tridimensionale del tessuto.
• Ibridazione in situ: Tecnica di analisi del DNA, mRNA che prevede l’uso di sonde complementari (marcate a fluorescenza con sostanze anche non radioattive) alla sequenza di DNA da studiare che “illumina” quando ci si appaia.

Utilizzo di organismi transgenici

L’esperimento inizia scegliendo quale gene andare ad osservare per capirne la funzione ed inserirlo in una regione contenente una sequenza promotrice ove possa legarsi la RNA pol e altri fattori di trascrizione (è anche possibile studiare una sequenza promotrice andando a collegarla con una proteina rapidamente identificabile come la galattossidasi) ed è possibile mutare qualche base di un gene prima di inserirlo all’interno del genoma di un animale da esperimento.

Prima di inserire il gene all’interno dell’organismo ospite è necessario clonarlo inserendolo in un plasmide capace di replicazione autonoma e con uno specifico marcatore e inserire questo plasmide ricombinante all’interno di un batterio in modo da ottenere numerosi cloni della sequenza di interesse. Ottenuto il clone del gene di interesse è possibile impiantare con una microiniezione il gene all’interno di una cellula uovo enucleata (precisamente nel pronucleo aploide maschile) che sarà poi impiantata nell’utero di una femmina pseudogravida che darà origine a un animale chimerico con geni appartenenti a organismi diversi.

Creazione di topi knock in e knock out

La creazione di topi knock in e knock out è diversa rispetto alla creazione di organismi transgenici: lo scopo, in questo caso, è di sfruttare le tecniche di ricombinazione omologa, che avviene come processo naturale ma viene effettuata tra una sequenza genica mutata (contenente un gene di interesse + un marcatore, solitamente un antibiotico) e una normale sequenza genica di un topo perché la sequenza mutata è inserita per elettroporazione (creazione pori nella membrana per far passare la sequenza mutata) in una cellula staminale.

Una volta ottenuta la staminale mutata questa viene inserita in una blastocisti ospite (di un organismo diverso rispetto quello da cui derivano le staminali) impiantata nell’utero di una topina gravida che darà origine a un topo chimerico.

Principi e meccanismi dello sviluppo embrionale

Lo sviluppo embrionale inizia e si organizza in 3 processi principali:

• Rapida serie di divisioni cellulari a partire da un primo gruppo di cellule
• Riprogrammazione genomica per esprimere i geni necessari per lo sviluppo dei diversi tessuti
• Ricerca delle fonti di energia per lo sviluppo embrionale

I primi elementi necessari per lo sviluppo (proteine e RNA) sono presenti nell’ovocito e solo dopo sono sintetizzati dal genoma embrionale. Le prime cellule, blastomeri, che compongono la morula (stadio a poche cellule) sono totipotenti e hanno molte capacità differenziative.

La morula esprime inizialmente dei geni che creano il trofoblasto, la struttura che permette l’adesione della morula all’endometrio (parete dell’utero materno): una volta creata questa struttura le cellule pluripotenti (esprimono tutto tranne cellule del trofoblasto) vengono dette massa cellulare interna (ICM) che viene spostata ad un polo della morula perché all’interno di essa vi entrano nutrienti e acqua per opera del trofoblasto. Questa struttura forma una cavità interna di nutrienti detta blastocele e la morula viene quindi rinominata blastocisti.

Nella blastocisti le cellule ICM si dispongono in due posizioni diverse: l’epiblasto si pone a contatto con il trofoblasto e l’ipoblasto si trova opposto all’epiblasto e a contatto con il liquido del blastocele. Tra l’epiblasto e il trofoblasto si forma la cavità dell’amnios (cavità proamniotica) all’interno della quale si svilupperà l’embrione. Nello stesso momento vengono segregate le cellule germinali primordiali che rispetto alle altre cellule contengono un genoma pressoché totipotente. In seguito si osserva la gastrulazione per la quale si formano i 3 foglietti embrionali e si determina l’organizzazione dell’asse antero-posteriore e della simmetria destra-sinistra. In seguito si osserva l’istogenesi e l’organogenesi. Tutti questi processi sono mediati da segnali embrionali ed extraembrionali che influenzano le cellule embrionali con contatto cellule-matrice extracellulare, interazioni dirette con altre cellule (juxtacrine) e segnalazione autocrina, paracrina ed endocrina.

Geni dello sviluppo embrionale

Quattro famiglie di geni importanti per lo sviluppo embrionale: fattori di trascrizione, fattori di crescita, rispettivi recettori e proteine adesive. Questi geni hanno più di un enhancer e legano, come proteine di regolazione genica, geni della famiglia di PCG (per attivazione trascrizionale) o TrxG (per disattivazione trascrizionale) che producono molecole importanti per la proliferazione o inibizione della proliferazione nelle cellule embrionali.

Nel corso delle prime divisioni mitotiche dello zigote in accrescimento non vi è trascrizione genica da parte della morula ma gli elementi sono preforniti dall’ovocito e non sono gli stessi del normale ciclo cellulare.

I differenziazione

I primi geni espressi direttamente dall’embrione, OCT4, SOX2 e Nanog, sono geni importanti per il differenziamento cellulare (riparazione DNA, programmazione della metilazione del genoma, e via dicendo) e la loro espressione è regolata da geni della famiglia WNT e TGF-β. In seguito a questo stadio si ha un primo contatto, detta fase di compattazione, tra blastomeri che darà origine allo sviluppo della I linea differenziativa: trofoblasto e cellule ICM (da cui si svilupperanno amnios e sacco vitellino) che rispettivamente inducono la presentazione di microvilli sul lato del trofoblasto e E-caderina a livello delle ICM.

A livello del trofoblasto, che permette l’adesione con l’endometrio, si osserva sintesi di selettine, integrine e CDX2 (oltre che BMP4 per la differenziazione stessa del trofoblasto) mentre nelle ICM permane la sintesi di OCT4, SOX2 e Nanog.

II differenziazione

Si osserva la formazione di ipoblasto ed epiblasto. Le cellule dell’ipoblasto si formano per espressione di FGF2 che è attivata dai fattori di trascrizione GATA6 e GATA4 che silenziano Nanog. Nell’epiblasto Nanog è espresso in contemporanea a FGF4.

Con la gastrulazione e la formazione dei 3 foglietti embrionali i segnali di influenza cellulare diventano complessi e, dopo lo sviluppo del sistema cardiocircolatorio, anche di tipo endocrino.

Analisi delle diverse molecole implicate nello sviluppo

Fattori di trascrizione (TF): Fattori che si legano a monte del promotore di un gene e regolano l’attività dell’RNA pol II responsabile della trascrizione. Questo è una modifica trascrizionale che segue la modifica epigenetica/strutturale della cromatina sulla base dell’interazione di varie molecole con proteine istoniche associate nel DNA dentro la cromatina. I TF si suddividono in due importanti sottogruppi di TF generici o geni-specifici, questi ultimi sono ulteriormente suddivisibili in TF sempre attivi o TF che richiedono attivazione. I TF sono anche suddivisibili in 5 classi sulla base della loro sequenza aminoacidica.

Fattore di crescita (GF): Polipeptidi che legandosi ai relativi recettori posti sulla membrana plasmatica della cellula innescano segnali intracellulari che inducono attivazione o inibizione di geni che regolano la proliferazione e il differenziamento cellulare. Esistono molti GF e ognuno può avere effetti diversi a seconda della cellula cui si lega e della durata all’esposizione.

• TGF-β: Dimeri secreti in forma inattiva con ponti S-S che perdendo il pro-dominio si attivano e si legano con recettori di tipo II che attivano i recettori di tipo I che a loro volta attivano le proteine della famiglia SMAD che modulano la trascrizione dei geni bersaglio. I dimeri possono essere inibiti da antagonisti.
• Hedgehog: Tre proteine note come Desert Hedgehog, Indian Hedgehog e Sonic Hedgehog che si legano ai recettori Patched che attiva il recettore Smoothened che induce la defosforilazione di proteine repressore a valle che, rese inattive, permettono la trascrizione.
• WNT: Famiglia di proteine molto importanti che regolano diversi meccanismi embrionali e si legano a recettori Frizzled e LRP. Quando si legano attivano la via di segnalazione WNT/β-caderina ed inducono un’inibizione della fosforilazione di questa proteina che non viene ubiquitinata (e quindi degradata) andando poi ad agire sui geni responsivi a WNT.
• Notch: Famiglia di recettori proteici che risponde ai ligandi Delta Like e Jagged che agiscono per segnalazione juxtacrina. Quando il recettore Notch lega il ligando si osserva un’endocitosi della porzione extracellulare del recettore che induce la separazione della γ-secretasi dalla parte interna del recettore (NICD) che quindi si dirige dentro al nucleo e agisce con il TF CSL che solitamente attiva proteine repressore. Questa famiglia è importante per l’inibizione laterale nello sviluppo dei neuroni perché chi possiede il recettore Notch diventerà cellula gliale (perché geni repressori indurranno questa differenziazione) mentre le cellule che producono i ligandi per Notch saranno neuroni.
• FGF: Molecole che, in associazione con l’eparina e l’eparan solfato, si legano ai recettori per FGF tirosin chinasici che inducono segnalazioni intracellulari che vanno ad agire su geni responsivi a FGF.

Molecole adesive: Molecole che regolano lo sviluppo embrionale per contatto omofilico (due proteine uguali) o eterofilico (due proteine diverse) e sono solitamente proteine transmembrana. Le molecole che garantiscono un’associazione cellula-cellula troviamo integrine, selettine, caderine, ICAM (fattori immunoglobulinici di adesione), claudine e occludine, mentre tra i contatti cellula-matrice sono importanti i VLA (very late antigen) della famiglia delle integrine.

Movimenti cellulari

Nel corso dello sviluppo embrionale le cellule si spostano singolarmente o in gruppo secondo alcuni tipi di movimento cellulare. Tra i movimenti più comuni troviamo:

• Chemiotassi: Delle citochine prodotte da alcune cellule si legano a recettori posti sulla membrana plasmatica di altre cellule e inducono lo spostamento di quest’ultima mediante protrusioni detti lamellipodi e filipodi che si legano e si dissociano dal substrato extracellulare.
• Estensione convergente e cerniera mediana: Allungamento a livello caudale e craniale e restringimento con formazione di un cuneo a livello mediale dell’asse maggiore del tubo neurale dovuti a modifiche citoscheletriche. Associato a questo fenomeno si osserva anche il processo di migrazione intercinetica dei nuclei in cui i nuclei di una cellula in divisione si spostano in regione apicale prima ancora della citodieresi.

Sviluppo embrionale

Lo sviluppo dell’embrione si suddivide in 3 momenti principali.

• Sviluppo pre-embrione: Si osserva intensa attività mitotica e crescita dello zigote che forma la blastocisti formata da ICM e trofoblasto.
• Sviluppo embrionale (3°-9° settimana): Nella prima fase si formano le cellule germinali primordiali e il primo sistema a formarsi è il cardio-vascolare che, insieme alla placenta primordiale, sopperisce alle funzioni nutritive del feto. In seguito inizia la formazione del sistema nervoso a partire dalla placca neurale che, una volta diventata tubo neurale, verrà inglobato dal capo e poi si osserverà la formazione di occhi e orecchie e l’abbozzo degli arti. Nel corso di questa fase si sviluppano i 3 annessi embrionali detti sacco amniotico, dove sarà racchiuso il feto, corion, che circonda l’amnios e il sacco vitellino. Il corion, quando perderà i villi, costituirà la placenta definitiva.
• Periodo fetale (9°-38° settimana): Si creano i centri di ossificazione primari, le dita e i genitali esterni prendono forma. Dal 3° mese si osserva la respirazione fetale, ovvero lo scambio di gas con il sangue materno attraverso la placenta. All’inizio l’epidermide risulta trasparente e si ispessisce al 5° mese dove si ricopre anche di una lanugine. Al 7° mese è rossa e ricoperta da una vernice caseosa composta da cellule epiteliali e secreti ghiandolari e nel corso degli ultimi 2° mesi si distende riempendosi di tessuto adiposo.

La descrizione dello sviluppo embrionale si effettua considerando il feto come se fosse a 4 zampe: la parte anteriore diventa craniale, quella inferiore caudale e si usano i riferimento ventrale (per la parte rivolta verso terra) e dorsale per la parte superiore. La gestazione in termini embrionali si suddivide in 38° settimane, a livello clinico la media è 40. Il calcolo nel corso dello sviluppo embriologico parte dalla fecondazione mentre nel caso della clinica si conta come se la fecondazione fosse avvenuta 14 giorni dopo il primo giorno dell’ultima mestruazione della donna (serve per ginecologia).

La lunghezza del feto nel periodo pre-embrionale è espressa in termini di lunghezza massima (LM), nel corso del periodo embrionale in termini di distanza cranio-coccige (tanto l’embrione è ripiegato!) CRL e nella fase fetale o in termine del n° di somiti o con la distanza vertice-tallone (CHL).

Cellule staminali

Cellule staminali sono cellule che conservano la capacità di proliferare senza limiti o con una durata limitata a seconda del livello in cui si trova la cellula staminale stessa. Esistono diversi tipi di staminali e sostanzialmente si dividono in staminali embrionali (totipotenti), fetali e adulte. A seconda del tipo cellulare cambia la durata e la possibilità proliferativa e anche la capacità differenziativa: più è precoce la cellula maggiore sarà la capacità di sviluppare tipi cellulari differenziati (questa capacità è dovuta alla plasticità del genoma).

Le cellule differenziate contengono sempre tutto il genoma ma ne esprimeranno solo una parte mentre le staminali hanno in qualche modo bloccato i fattori differenziativi e hanno un’espressione genica molto ampia. La differenziazione della cellula staminale dipende in particolar modo dal microambiente/nicchia in cui è inserito perché questo fornisce segnali che indicano i comportamenti effettuabili dalla cellula.

Le staminali sono state oggetto di profondi studi ed è stato individuato che alcune specie animali conservano cellule differenziate in grado di tornare a uno stato non differenziato, nel blastema, e ricreare un’intera popolazione cellulare differenziata (come la coda per la lucertola).

Tipi di divisione cellulare

Divisione simmetrica: Una cellula staminale si divide per mitosi e crea due cellule figlie entrambe staminali e in questo modo accresce la popolazione di staminali. Comportamento tipico di staminali embrionali e tumorali.

Divisione asimmetrica: Nella mitosi una cellula figlia diventa staminale l’altra segue una via differenziativa: questo è il maggior metodo di divisione delle staminali e permette di non osservare una diminuzione della popolazione staminali e di osservare cellule figlie anche differenziate. La divisione asimmetrica è regolata sia da fattori intrinseci che da fattori estrinseci: nel primo caso la polarità assunta dalla cellula madre o la segregazione di alcune molecole ad un polo del fuso mitotico nel corso della divisione cellulare inducono una cellula a restare staminali e l’altra a differenziare, nel secondo caso è la posizione di particolari regioni del microambiente a determinare la divisione asimmetrica.

Diversi esperimenti hanno chiarito che la mancata espressione...