Ecologia del microbiota umano, parte 1, prof. Diego Mora

Corso di qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Mod. ecologia del microbiota umano

Prof. Diego Mora, Simone Guglielmetti

Parte 1: prof. Diego Mora

© Laila Pansera - 1

Sommario

• Introduzione ........................................................................................................................................................................... 3
• Microbiota umano ................................................................................................................................................................ 3
• Microbiota e microbioma ............................................................................................................................................. 4
• PCR ............................................................................................................................................................................................. 8
• Isolamento ed identificazione dei batteri ............................................................................................................. 12
• Identificazione di batteri senza isolamento ......................................................................................................... 15
• Confronto tra campioni ............................................................................................................................................... 18
• Microbiota della cavità orale .......................................................................................................................................... 24
• Microbiota della pelle ....................................................................................................................................................... 32
• Meccanismi di scambio genico ..................................................................................................................................... 37
• Trasformazione ............................................................................................................................................................... 39
• Coniugazione .................................................................................................................................................................. 40
• Trasduzione ...................................................................................................................................................................... 41
• Resistenza agli antibiotici ................................................................................................................................................ 44
• Cosa succede a livello intestinale riguardo la resistenza agli antibiotici .................................................. 46

© Laila Pansera - 2

Introduzione

Per quanto riguarda i microrganismi ci sono due visioni opposte:

• Koch è il primo che fa notare che dove ci sono i problemi di infezione, c’è sempre una carica microbica, quindi da lì in poi si pensa ai microrganismi come a qualcosa di negativo.
• Metchnikoff nota che l’assunzione di latti fermentati può prolungare la vita impedendo la putrefazione dell’intestino.

I microrganismi patogeni non hanno nessun effetto positivo; essi sono poche specie, che rappresentano una percentuale infinitesimale delle specie microbiche del nostro pianeta. Il fatto che siano negativi è dovuto a una visione antropocentrica (fa male all’uomo). Tutto il resto del mondo microbico non è solo dannoso, ma potenzialmente utile, in dipendenza dal substrato; in certi casi può però alterare il substrato. Infatti, dove c’è una componente biologica, la componente microbica è fondamentale nell’ecosistema, quindi ovunque convivono microrganismi e altre specie.

Microbiota umano

Clostridium difficile è un esempio di come alcuni microrganismi possono creare problemi in alcune parti del corpo. È un Gram positivo sporigeno che può causare enterocoliti pericolose e anche mortali. È dannoso solo nell’ambiente anaerobio dell’intestino: l’ambiente seleziona i microrganismi.

Per quanto riguarda la cavità orale, ad esempio, c’è una ricca diversità di specie microbiche e un’ampia variabilità: in funzione della diversità degli ambienti ho una diversa colonizzazione da parte dei microrganismi. Passiamo da un’abbondante presenza di Gram + del genere Streptococcus, adattinomiceti, che sono più associati alle zone dei denti e svolgono delle funzioni metaboliche importanti per la salute del dente stesso. Questi microrganismi possono aderire alle superfici e suddividersi in base alla loro capacità di colonizzazione: alcuni streptococchi aderiscono al dente e a loro volta diventano substrato di adesione per altri microrganismi.

Parliamo di sistema ecologico: le sue componenti interagiscono fra di loro, creando una catena metabolica che stabilizza il sistema; l’ospite produce delle sostanze utilizzate da alcuni microrganismi, che a loro volta producono dei secreti che possono essere utili ad altri microrganismi. I sistemi sono molto complessi, sia per la diversità delle specie che per la funzione metabolica.

Microbiota e microbioma

Il microbiota è l’insieme delle specie presenti; prevede la coltura di tutte le specie insieme, perciò è molto complesso e difficile da sviluppare. Il microbioma è invece l’insieme dei genomi dei microrganismi (potenzialità genetica del sistema nel complesso, senza distinguere cosa fa ogni specie); buona parte dei lavori condotti si basa sull’analisi del microbioma.

Il microbiota è costituito da batteri, ma anche da virus ed eucarioti. Molte volte si parla solo di batteri, perché sono i più numerosi e i più facili da studiare. Ci sono infatti pochi studi sul viroma (genoma dei virus) e sugli eucarioti. Guardando i microrganismi che possono essere presenti nei vari distretti corporei, dalla trachea ai polmoni, abbiamo un microbiota molto modesto (numero cellule/g coltivare il lab di tessuto), a meno che ci siano fenomeni di infezione. Buona parte degli studi sul microbiota è fatta descrivendo ciò che succede nel tratto gastro-intestinale.

Lo stomaco è stato per molto tempo considerato una zona dove avveniva un processo di sterilizzazione, a causa del pH e della presenza di enzimi proteolitici. Questo finché non si è notato che nello stomaco può trovarsi Helicobacter pylori; da qui in poi si è capito che lo stomaco non è sterile, ma scarsamente popolato: troviamo lactobacilli, Helicobacter pylori; tutti gli altri microrganismi che passano attraverso lo stomaco subiscono una riduzione della carica vitale, ma non una sterilizzazione. Dal duodeno inizia ad esserci una colonizzazione più consistente, che diventa palese nel colon dove abbiamo concentrazioni microbiche altissime. Molti studi sul microbiota vengono effettuati sui microrganismi delle feci, che si pensa rappresentino la microflora del colon.

L’essere umano è un olobionte: convive e si è co-evoluto con i microrganismi. I microrganismi sono stati selezionati per l’ambiente in cui si trovavano, ed esiste uno scambio di informazioni tra i microrganismi e l’uomo, e viceversa. Dai primi studi sul microbioma è emerso che la quantità di informazione genetica contenuta nel nostro genoma è 200 volte inferiore rispetto alla quantità di informazione genetica contenuta nel nostro microbiota. Inoltre si stima che i microbioti umani siano costituiti da almeno 10¹⁴ cellule batteriche, ovvero 10 volte di più del numero totale di cellule umane nel nostro corpo.

Tutti i nostri distretti corporei sono colonizzati da microrganismi: mucose, tratto gastro-intestinale. Ogni regione seleziona una composizione di phylum diversi. Nell’epidermide cambia molto anche la zona, che in base alla situazione ambientale viene colonizzata da diversi microrganismi. Difficilmente si riesce ad arrivare alle specie quando si parla di microbiota.

La riproduzione sessuata è alla base della definizione di specie per gli organismi superiori, ma i microrganismi non hanno riproduzione sessuata. Si è partiti con piante e animali, hanno iniziato a usare il microscopio, quindi aggiunto i protisti. Guardando le cellule si è notata l’esistenza di 2 tipi diversi: procarioti ed eucarioti (cellule compartimentate). Guardando meglio la fisiologia dei microrganismi si sono fatte ulteriori divisioni: batteri, alghe e protozoi, funghi, piante, animali. La grande rivoluzione avviene grazie a Woese nel 1990, che suddivide gli organismi viventi in base all’analisi e comparazione di alcune regioni del cromosoma (geni che codificano per il ribosoma 16S RNA); approccio affidabile perché oggettivo; abbiamo batteri, archei ed eucarioti.

Gli studi sul microbioma arrivano a identificare i generi e le proporzioni tra i generi. Il ceppo è un’ulteriore suddivisione che tiene conto della variabilità individuale all’interno della stessa specie.

Gli studi sul genoma ci permettono di costruire gli alberi filogenetici, in cui la distanza tra un microrganismo e un altro si percorre attraverso le linee. Questa distanza deriva da un calcolo che dipende da quanto sono diverse le sequenze genetiche tra i gruppi microbici. Questa distanza ha un peso evolutivo: maggiore è la distanza tra i batteri nell’albero filogenetico, maggiore è la loro distanza evolutiva. Infatti il 16S RNA è anche detto orologio evolutivo.

Tra gli organismi distanti evolutivamente succede qualcosa che li avvicina, fenomeni di trasferimento di materiale genetico che fanno acquisire informazioni che diventano comuni tra chi li manda e chi li riceve andando a confondere il percorso evolutivo di questi organismi. Alcuni di questi trasferimenti hanno determinato la formazione delle cellule complesse: la cellula eucariota deriva da un processo di simbiosi tra due cellule procariote che si sono fuse insieme per dare origine a una cellula compartimentata. I trasferimenti di materiale genetico sono quindi alla base dell’evoluzione.

Nella microbiologia classica (prima dello studio del microbioma) si deduceva la composizione del microbiota coltivando le specie microbiche prelevate da vari distretti corporei (facendo le conte). Coltivare un microrganismo significa conoscere le sue caratteristiche, fondamentale per capire come si comporta. Attualmente è molto difficile coltivare in laboratorio le specie microbiche del microbiota, anche se sarebbe utile, per ottenere più informazioni riguardo alle specie definite ad oggi incoltivabili. Grazie allo studio del microbioma però possiamo vedere molti più microrganismi.

La tassonomia moderna si basa sulla comparazione delle sequenze dei geni che codificano per operoni ribosomiali. Il ribosoma è la macchina molecolare formata da RNA e proteine, che provvede alla sintesi delle proteine. Il gene è invece una porzione di DNA che codifica per una proteina, quindi è una sequenza di nucleotidi che viene trascritta in RNA e tradotta in proteine. Gli unici geni che non codificano proteine sono quelli che codificano RNA ribosomale (gene solo trascritto, non tradotto), e quelli che codificano tRNA.

Nei batteri i geni sono organizzati in una struttura definita operone ribosomiale, che è un’unità trascrizionale: più geni codificati insieme, es. per metabolizzare il lattosio ho bisogno di un gene che codifica per il trasportatore, un gene che codifica per la lattasi, un gene che codifica per la chinasi, etc., quindi devo aver pronti almeno 3 enzimi, quindi accendo tutti e 3 i geni per effettuare tutte le operazioni metaboliche sul lattosio. L’operone è una questione di efficienza. Nel caso del RNA ho un operone che codifica tutte le regioni dell’RNA.

Il ribosoma assume una struttura secondaria particolare; essendo un unico filamento forma legami H tra C-G e A-U andando a creare una struttura particolare, che se viene persa il ribosoma non funziona. Ogni mutazione su geni del RNA che comporta una variazione della struttura secondaria del ribosoma, porta alla morte della cellula.

Se consideriamo il DNA, per capire meglio prendiamo in considerazione l’enzima lattasi: esso può venire prodotto sia dall’uomo che da batteri lattici. Il sito catalitico dell’enzima prodotto dall’uomo e dai batteri è pressoché identico, mentre il resto della sequenza amminoacidica può essere diverso. Infatti due geni che codificano per una stessa proteina in due specie diverse possono avere sequenza nucleotidica molto diversa, a causa del codice genetico degenerato, più triplette danno uno stesso amminoacido.

Se parliamo di RNA, tutta questa libertà viene meno, perché non abbiamo la codifica degli amminoacidi, per cui le sequenze anche tra organismi molto diversi sono simili, per garantire la struttura del ribosoma, che è simile per tutti. Le regioni che cambiano tra specie e specie sono i LOOP, dove non si formano legami H tra le basi complementari (non vi è appaiamento della sequenza), dove può avvenire una mutazione senza che succeda nulla. Due specie microbiche si definiscono diverse se hanno analogia genetica <97% della sequenza genetica del ribosoma 16S.

Quindi le caratteristiche che fanno sì che il gene 16S ribosomiale sia quello scelto per lo studio del microbioma, sono:

• Dimensioni: non è molto grande (1500 bp) quindi può essere analizzato facilmente e accessibilmente.
• Non codifica per proteine: è altamente conservato in tutti gli organismi (è raro e poco probabile che siano avvenute mutazioni).
• Oltre a regioni estremamente conservate, contiene regioni ipervariabili che possono rappresentare delle sequenze di riconoscimento di tipo specie specifico, utili per l’identificazione dei batteri.
• Avendo zone variabili e conservate, è utilizzabile per la PCR.
• È considerato un ottimale “molecular clock”, un orologio molecolare, cioè è adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici.

PCR

Gli approcci metodologici sono approcci che si posso utilizzare per fare caratterizzazioni del microbioma. Si basano su metodi strutturali che hanno come bersaglio (target) delle sequenze nucleotidiche. Lo scopo è quello di descrivere le unità tassonomiche che sono presenti in un complesso ecosistema (come quello intestinale umano o quello della pelle) e quindi riuscire ad arrivare a una identificazione il più precisa possibile. Normalmente le tecniche moderne che vengono utilizzate consentono di arrivare ad una descrizione del genere.

Gli approcci molecolari che si possono usare per determinare nome e cognome di microrganismi che sono anche coltivabili, quindi di cui noi possiamo disporre di culture pure o di biomasse sulla quale possiamo lavorare, si basano per buona parte su sviluppi della reazione a catena della polimerasi (PCR). La PCR è una reazione enzimatica che ha come bersaglio delle sequenze geniche. In funzione del tipo di sequenze geniche che ho come bersaglio, si possono ottenere informazioni tassonomiche diverse. Molti geni (es. 16S rRNA) sono un misto di zone ipervariabili e zone conservate, per cui studiando zone diverse dello stesso gene, si possono ottenere informazioni a diverso livello tassonomico. Bersagli possibili:

• Geni molto conservati (gene 16S rRNA): informazioni a livello di genere principalmente;
• Zone ipervariabili (del gene 16S): informazioni sulle specie, oltre che del genere;
• Regione spaziatrice (del gene 16S): informazioni sulla sottospecie, oltre che specie e genere.
• Zone random del genoma: informazioni che sono ancora più definite e che consentono di arrivare al ceppo. Si abbandonano questi geni che sono altamente conservati, e ci si muove verso informazioni diverse nel genoma.

La tecnica di sequenziamento di tutto il genoma è l’unica che mi dà un’informazione il più completa possibile. Si possono ottenere tutte le informazioni per quel microrganismo e si può arrivare fino al singolo ceppo/individuo e distinguerlo, per esempio, da altri che provengono dalla stessa specie. In microbiologia è fondamentale arrivare all’identificazione dei ceppi.

Esempio: non basta dire solo che c’è stato un problema di intossicazione alimentare genericamente dato dalla Listeria monocytogenes. Bisogna arrivare anche a definire quale ceppo di Listeria monocytogenes ha creato quel problema, in modo tale da poter risalire fino alla fonte dell’origine della contaminazione e capire poi la cura antibiotica più opportuna da utilizzare.

Ci sono tecniche che hanno discriminazioni maggiori di altre. Quelle che discriminano sotto il livello di specie sono le ultime che consentono di campionare e di indagare più regioni del genoma diverse contemporaneamente, quindi aggiungono più informazioni alle analisi. La singola analisi del gene mi fornisce solo quell’informazione, invece da più sequenze di geni diversi ottengo più informazioni. Per queste metodiche il bersaglio è il gene ribosomiale. La regione spaziatrice (compresa tra gene 16S e 23S) è quella in cui si va ad indagare. Quindi l’analisi procede in questo modo: isolo il microrganismo, ottengo i singoli ceppi, faccio la PCR amplificando i geni della regione spaziatrice.

Da qui otteniamo dei fingerprinting (profili elettroforetici) di frammenti di DNA che sono uguali tra i ceppi appartenenti ad una specie e diversi da quelli che appartengono ad un’altra specie. Ottengo quindi profili omogenei che sono diversi tra loro in funzione della specie di appartenenza. Se ho bisogno di studiare delle regioni del cromosoma microbico o umano, si hanno principalmente due problemi:

1. Ottenere quantità maneggiabili di queste regioni del DNA