Ecologia del microbiota umano, parte 1, prof. Diego Mora

Quando ottengo il prodotto di interesse, successivamente mando la provetta ad aziende che fanno

analisi di sequenza, che restituiscono un file strumentale, e il file di testo con la sequenza.

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Nel grafico ogni picco corrisponde a una base azotata. Le parti iniziali e terminali della sequenza non

sono facilmente interpretabili e per tale motivo vengono scartate (si leggono circa 600-700 nucleotidi

poi decade il segnale).

Dal file di testo posso estrapolare un frammento di sequenza, ed interrogare la banca dati. La banca

dati che si utilizza per fare la comparazione di sequenza è un software disponibile in rete; incollo la

sequenza nella finestra apposita del software, dopodiché il software interroga la banca dati di

sequenze nucleotidiche. I database sono universali, si ottiene un output grafico, dove c’è tracciata in

alto la lunghezza del frammento e le sequenze simili a quella che ho sottoposto ad analisi (righe

colorate), che sono colorate in modo diverso a seconda della corrispondenza del mio filamento con

quello in banca dati. Ogni riga colorata è una sequenza, che corrisponde a un microrganismo. Le

sequenze simili sono messe in ordine decrescente di somiglianza. Per ogni sequenza vedo il nome,

qual è la porzione di DNA che ho isolato, e la frazione di identità (percentuale di somiglianza). La

percentuale sale a valori più alti una volta che tolgo dalla sequenza la prima parte del frammento,

che di solito contiene degli errori. In banca dati non c’è una sola sequenza di ogni specie per ogni

singolo gene, ma ho diverse sequenze. Posso trovare anche corrispondenza con diverse specie,

perché esse solo filogeneticamente affini, perché hanno un gene 16S molto simile, per cui devo

utilizzare delle altre analisi per discriminare tra queste specie.

N.B. con questo metodo indentifico bene il genere, in alcuni casi anche la specie.

Identificazione di batteri senza isolamento

Quando invece lavoro con dei sistemi complessi in cui non riesco a coltivare tutto quello che c’è

dentro, la strategia che mi consente di operare in maniera più completa per ottenere tutto quello

che ho nella miscela, è un’altra. Dal campione biologico estraggo il DNA totale presente, senza

coltivare. A questo punto mi concentro sulla componente batterica (non vedo l’eventuale presenza

di DNA eucariota o virale), faccio la PCR in cui ottengo diversi frammenti di lunghezza uguale, ma

diversi. Da qui poi devo richiedere un servizio più complesso, che distingue, separandole, tutte le

sequenze diverse della miscela. Faccio poi un’analisi comparativa nel software (interrogazione

multipla) e ottengo le risposte per tutte le specie microbiche. Questo approccio si chiama NGS (Next

Generation Sequency). © Laila Pansera - 15

Prima di questo approccio, che ha preso piede negli ultimi anni, si doveva trovare un modo per

separare le varie sequenze microbiche del gene 16S. Ci sono 2 approcci fondamentali:

1. Clonare la miscela amplificata: si inseriscono tali frammenti in plasmidi (clonaggio), che a loro

E. coli

volta vengono inseriti in (trasformazione) in modo che ciascuna cellula contenga un singolo

plasmide con un unico frammento (graficamente con un solo colore). Queste cellule a questo

punto si possono coltivare, ciascuna genererà una colonia che sarà arricchita del gene inserito.

A questo punto si può generare da ciascuna cellula tramite PCR una grande quantità di quel

gene, per poi andare a sequenziarlo. Tuttavia è un lavoro enorme, perché per arrivare a

caratterizzare un ecosistema costituito da migliaia di specie si devono andare a clonare e studiare

E. coli

migliaia di colonie di . L’informazione ottenuta è di tipo quantitativo perché stabilisco

un’abbondanza relativa: si riesce a stabilire la specie più rappresentata e di cui si trovano più cloni

in percentuale rispetto al totale.

2. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis): quando ottengo una miscela di frammenti di

DNA la cui lunghezza è uguale, ma la differenza sta nella sequenza, non posso trovare

un’indicazione dall’elettroforesi. Si sono inventati un trucco per poter utilizzare l’elettroforesi per

separare tali frammenti. Se ho 2 frammenti di DNA, A e B, lunghi uguali ma con delle differenze

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nella sequenza, è diversa anche la quantità di legami H presenti. Se applico ai 2 frammenti di

DNA un trattamento di denaturazione, può succedere che uno dei 2 frammenti si apra

parzialmente (perché ha più legami H), mentre l’altro si apra completamente (perché ha meno

legami H). Dal momento che non so la temperatura esatta per ottenere una denaturazione

parziale e una totale, utilizzo l’elettroforesi in una matrice di poliacrilammide (che ha una maglia

più fine) e lavora in verticale, poi creo un gradiente di temperatura dal polo negativo a quello

positivo (tramite serpentine, in cui al polo positivo la temperatura è più alta), poi aggiungo delle

sostanze che facilitino la denaturazione (gradiente di denaturazione). Il DNA entra come se fosse

un unico frammento, ma mentre migra verso il polo positivo va incontro a condizioni favorevoli

di denaturazione. I frammenti con una bassa percentuale di GC si aprono con più facilità, mentre

quelli con più alta percentuale di GC rimangono intatti. Il risultato finale di questa analisi sono

diverse bande, nel caso dei frammenti A e B ottengo 2 bande: una che si ferma prima, che è

quella con più bassa percentuale di GC, e una che si ferma dopo, con concentrazione di GC

maggiore. Infatti le molecole denaturate hanno un ingombro maggiore e si spostano con più

fatica nella maglia di poliacrilammide. In generale ottengo una banda per ogni tipologia di

microrganismo che ho nell’ecosistema.

Poi recido i frammenti di gel e li mando a sequenziare. Questa metodica è ancora abbastanza

utilizzata perché dà subito un’indicazione di quanto un sistema è diverso da un altro, o posso

utilizzarla come analisi preliminare per vedere se le popolazioni microbiche di un sistema

cambiano nel tempo.

Le metodiche utilizzate oggi si basano su tecniche più raffinate, che sono già in grado di separare le

informazioni contenute nella miscela. L’analisi quindi mi dice quante sequenze sono presenti e i

rapporti di abbondanza delle sequenze (abbondanza relativa). Se poi interrogo la banca dati, posso

anche capire quali sono i microrganismi.

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Confronto tra campioni

Uno dei concetti fondamentali quando si confrontano i microbiomi è la richness o eveness. La

ricchezza in specie (special richness): numero delle differenti specie presenti in un habitat.

Un’informazione in più è la eveness, o rappresentanza di ciascuna specie sul totale delle specie

presenti.

Supponendo di avere due campioni e in entrambi la ricchezza abbia lo stesso valore, ad esempio 2,

ciò che cambia è l’abbondanza relativa, quindi la loro evenness: il maggior valore di evenness

possibile è del 50% dal momento che sono presenti solamente due specie; se le specie fossero 3

avremmo un valore massimo del 33% circa. Nel secondo campione la richness è sempre 2 ma

l’abbondanza relativa è diversa: se avessimo una evenness del 30% e 70% ad esempio, avremmo una

bassa rappresentanza. Tendenzialmente quando succede qualcosa di negativo al microbiota si ha

una perdita di evenness oltre che di richness, ma non sempre le due cose sono collegate

direttamente.

Questo tipo di analisi si dice metatassonomica, poiché è basata sulla comparazione di miscele di

sequenze di DNA. Leggendo separatamente ogni sequenza scopro quanti sono i generi presenti nel

sistema. Usiamo la parola genere, sarebbe meglio usare il termine OTU (Operational Taxonomic Unit).

La OTU più rappresentata avrà una quantità di sequenze più alta delle altre.

Quando si applicano queste tecniche ad un ecosistema complesso come il microbiota umano:

1. Se si sfrutta un approccio che passa per la coltivabilità, difficilmente si conosce l’abbondanza

relativa

2. Se non si sfrutta l’approccio della coltivabilità si riesce ad estrarre tutto il DNA, si sottopone

alla PCR che essendo esponenziale alla sua generazione di frammenti rispecchia anche la

quantità di stampo iniziale genera quantità di DNA diverse in proporzione allo stampo che

→

ho all’inizio, quindi ottengo l’informazione dell’abbondanza relativa. Successivamente

avviene l’analisi che abbiamo visto precedentemente. Il difetto qui consiste proprio nella

tecnica dell’estrazione del DNA totale in sé, poiché non viene tenuto conto se le componenti

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biologiche siano vive o morte. Se si vuole evitare questo margine di errore bisognerebbe

estrarre l’RNA.

Quando comparo campioni diversi, posso aggiungere anche altri parametri: alpha e beta diversity.

L’alpha diversity è la diversità (ricchezza in specie) all’interno di un singolo campione, ossia il

numero di specie all’interno del campione. Questo parametro non confronta i campioni fra di loro.

La beta diversity è la comparazione fra le specie presenti in un campione e quelle presenti in un

altro, quindi mette in evidenza l’eventuale presenza in entrambi i campioni della stessa specie. Questi

2 parametri vengono misurati spesso.

Quando confronto 2 microbioti è molto facile fare queste comparazioni, ed è molto utile andare a

vedere i risultati. Posso anche mettere in relazione le specie che trovo nel microbiota e costruire

l’albero filogenetico.

L’analisi di sequenza può essere più o meno efficiente. Io posso prendere un campione di 50 individui

di un sistema e scopro che ho 2 specie presenti, se analizzo 250 individui scopro che le specie sono

4, più uso un campione grande, più specie posso individuare. Più è potente il sistema di

sequenziamento, più ho una descrizione dettagliata del sistema. Questo lo vedo dalle curve di

refrazione, che dicono che più sequenze vengono lette e più ci si avvicina al valore reale delle specie

presenti, identificato con il livello di plateau nel grafico sull’asse y. Metto a grafico il numero degli

individui (o delle sequenze) in funzione al numero di specie. Più sequenze leggo, più ho un numero

di individui valido. © Laila Pansera - 19

Analisi del microbiota: coltivo. Analisi del microbioma: sequenzio DNA, intero o in parte.

Io ho un campione microbiologico da cui estraggo DNA, che può seguire 2 strade:

1. Amplificazione del gene 16S, da cui ottengo una miscela di frammenti lunghi uguali ma con

sequenza diversa. Poi una macchina raggruppa le OTU. Le OTU poi possono essere associate a

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