Ecologia del microbiota umano

Appunti di lezione di Raffaele Petitti

Ecologia del microbiota umano (Prof. Guglielmetti)

Lezione 1: Principi di ecologia

L'ecologia è lo studio scientifico delle interazioni tra gli organismi e il loro ambiente (include le interazioni che gli organismi hanno tra loro e con il loro ambiente abiotico).

L'ecosistema è l'unità funzionale fondamentale in ecologia. È l'insieme di tutti gli organismi viventi e delle sostanze non viventi con le quali i primi stabiliscono uno scambio di materiali e di energia.

Il biota è il complesso degli organismi viventi che occupano un determinato spazio.

L'habitat è l'ambiente in cui vive una specie animale o vegetale. In un ecosistema ci sono habitat diversi (nel bosco vi sono, ad esempio, gli habitat del sottobosco o degli alberi e all'interno di questo, l'habitat delle fronde, del tronco e delle radici).

La nicchia ecologica è la posizione occupata da una specie o da una popolazione all'interno del suo habitat, inteso non come spazio fisico, ma come ruolo e funzione che gli individui svolgono in un ecosistema, o anche come una specie utilizza le risorse dell'habitat in cui vive. Non è uno spazio fisico occupato da un organismo bensì il suo modo di vivere, è il ruolo che svolge un determinato microrganismo all'interno di uno specifico ambiente (habitat), il suo modo di vivere che ne permettono l'esistenza in quel determinato ambiente.

L'ecologia microbica è lo studio del comportamento e delle attività dei microrganismi nei loro ambienti naturali, e come reagiscono tra di loro. Sovrapponibile con la microbiologia ambientale, ma ci si riferisce all'insieme dei processi che si verificano in un ambiente. Il termine ecologia microbica viene utilizzato in modo generale anche per descrivere la presenza e le distribuzioni di microrganismi in vari ecosistemi (per esempio, per rispondere alla domanda: quali microrganismi ci sono nell'intestino umano o sulla superficie cutanea?).

I microrganismi sono organismi viventi che si classificano in 5 regni (Whittaker, 1978). I microrganismi si trovano all'interno dei regni dei Archea, Protisti e Funghi. Il diametro di una cellula di Escherichia coli è di 1 micro.

N.B. sono considerati microrganismi anche i virus, che sono un'entità che possiede uno stato di esistenza biologica come parassita obbligato di cellule e uno stato non-vivente (stato cristallino) quando sono liberi nell'ambiente (sono al di fuori di questa classificazione).

Classificazione a 3 domini (imperi) e 6 regni

Archea e Bacteria = dominio dei Procarioti. La microbiologia ambientale si riferisce principalmente all'insieme dei processi microbici che si verificano in un ambiente (il suolo, l'acqua di un lago, un alimento, l'intestino umano) ed ha perciò un significato sovrapponibile a quello di ecologia microbica. La microbiologia ambientale si occupa più nello specifico degli effetti su più ampia scala della presenza e delle attività microbiche.

In un ecosistema microbico le singole cellule crescono per formare popolazioni. Le popolazioni metabolicamente correlate costituiscono raggruppamenti chiamati corporazioni o glide (guilds). Set di corporazioni che conducono processi fisiologici complementari interagiscono per formare comunità microbiche. Ad esempio, se parliamo di intestino, facciamo riferimento ad una comunità microbica. Le comunità microbiche interagiscono quindi con le comunità di macrorganismi per definire l'interno ecosistema.

La distribuzione dei microrganismi nell'ecosistema naturale dipende dalle risorse (nutrienti) disponibili e dalle condizioni di crescita. Temperatura, pH, disponibilità di acqua, luce, ossigeno di un habitat definiscono la nicchia per ciascun microrganismo particolare.

(All'esame non ci saranno domande sulle definizioni di questo tipo)

Interazioni tra organismi viventi in un ecosistema

• Neutralismo = competenza di diverse specie senza che vi sia per esse danno o beneficio.
• Commensalismo = interazione non obbligatoria fra due esseri viventi in cui uno approfitta del nutrimento o degli scarti dell'altro senza procurare danno o beneficio (es. storno e il nido abbandonato del piccione).
• Sinergismo = interazione non obbligatoria in cui entrambe le popolazioni traggono beneficio. Entrambe le popolazioni sono in grado di sopravvivere indipendentemente (es. yogurt).
• Mutualismo = interazioni obbligatoria, dove i due elementi delle interazioni sono obbligati ad interagire, e entrambi traggono beneficio. Veniva chiamata simbiosi, ed è un termine qualsiasi tipo di rapporto tra organismi viventi.
• Antagonismo = interazione tra specie nella quale una o ambedue le specie in relazione subiscono un danno. Le principali relazioni antagonistiche sono antibiosi, parassitismo, predazione e competizione.

N.B. Le forme di interazione biologica (cioè tra i diversi viventi) appena descritte vengono tutte considerate forme di simbiosi (per es. simbiosi mutualistica, simbiosi parassitaria, etc.), in accordo con la letteratura scientifica più recente. Tuttavia, la parola simbiosi, tradizionalmente, è stata usata come sinonimo di mutualismo.

Classificazione delle interazioni tra organismi

(per es. tra popolazioni microbiche) in base al danno (-) o beneficio (+) che ne ricevono (0 = assenza di danno o beneficio).

Come di denominano i microrganismi?

Terminologia:

• Classificazione è la sistemazione degli organismi all'interno di gruppi tassonomici.
• Taxa (taxon al singolare) = raggruppamenti dei microrganismi viventi a qualsiasi livello sulla base di similarità o relazioni. L'attività di dare nomi ai taxa, seguono delle regole della lingua latina.
• Tassonomia è la scienza dell'ordinare gli organismi in un sistema di classificazione composto da una gerarchia di taxa.
• Nomenclatura è l'assegnazione di nomi ai gruppi tassonomici nel rispetto di specifiche regole.
• Identificazione è il processo che permette di stabilire a quale taxon appartiene un nuovo isolato microbico.
• Filogenesi o Filogenia è il processo evolutivo degli organismi viventi dalla loro comparsa ad oggi.

La nomenclatura binomiale è proposta da Linneo nel 1753, basata sul concetto di specie (unità tassonomica fondamentale), intesa come l'insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e di somiglianze a livello anatomo-morfologico e, più generale, fisiologico: tali caratteristiche differenziano gli individui di una specie da quelli di tutte le altre.

Prevede l'utilizzo di due termini latini o latinizzati, il primo è l'epiteto generico (in corsivo, maiuscolo, spesso abbreviato alla prima lettera), il secondo è l'epiteto specifico (corsivo, minuscolo). Per esempio: Homo sapiens, Saccharomyce cerevisiae, Escherichia coli.

I gruppi tassonomici principali (gruppo tassonomico o unità tassonomica = raggruppamento di organismi viventi = taxon pl. taxa)

Ceppo = non è un livello tassonomico, è un insieme di cellule microbiche (popolazione di cellule) teoricamente originate da un'unica cellula progenitrice, che sono identiche fra loro, come patrimonio genetico, metaboliche, morfologiche ecc. Da ceppi di una stessa specie possiamo avere realtà differente.

Filogenesi delle divisioni batteriche

L'identificazione batterica (la specie è l'unità tassonomica di base). La specie in un ambito batterico è definita come una collezione di ceppi simili che differiscono sufficientemente dagli altri gruppi di ceppi da giustificare il riconoscimento come unità tassonomica a sé stante.

N.B. ogni specie batterica possiede un ceppo type, cioè un ceppo di riferimento che riassume in sé tutte le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi della specie che rappresenta. Dove posso trovare il ceppo type di ogni specie? I ceppi type si trovano nelle ceppoteche, cioè nelle collezioni di colture cellulari. Le collezioni di colture di riferimento, in Europa e negli Stati Uniti, sono le seguenti:

Come si identifica un batterio

L'identificazione tassonomica di un ceppo batterico consiste nell'assegnazione di genere e specie e si basa sulla valutazione di caratteristiche fenotipiche e genotipiche e sul confronto di queste caratteristiche con quelle dei ceppi type.

Lo studio delle caratteristiche fenotipiche per l'identificazione di un batterio è la via tradizionale seguita da decenni da quella che è definita microbiologia classica. Ad essa si è ora aggiunta (e in molti casi sostituita) la microbiologia basata sulle tecniche di biologia molecolare, che prevede lo studio di DNA e RNA.

(Ripasso) La caratterizzazione fenotipica

Le prime caratteristiche da considerare sono le più generali, al fine di ridurre subito il numero delle possibilità tra cui ricercare.

• Caratteristiche morfologiche
• Micromorfologia: forma, dimensione, disposizione delle cellule (catenelli, aggregati), presenza di endospore;
• Macromorfologia: aspetto della colonia;
• Reazione di Gram;
• Mobilità.
• Metabolismo energetico
• Opera respirazione aerobia, oppure fermentazione; è anaerobio facoltativo.
• Caratteristiche culturali nutritive
• N.B. se, ad esempio, sto studiando un batterio lattico, posso valutare la capacità di utilizzare la fonte di carbonio da parte del ceppo in esame aggiungendo al terreno di coltura un indicatore di pH. Se il ceppo utilizza la fonte di carbonio produce acido e quindi il colore dell'indicatore di pH cambia.

Dopo avere definito tutte le caratteristiche fenotipiche, si avrebbero già molte informazioni per determinare la specie del ceppo batterico allo studio; spesso, però, non si riesce a ottenere un risultato definitivo (non si riesce ad avere la certezza); si passa allo studio del genotipo = lo studio del genotipo mi può dare la massima sicurezza possibile in merito all'identificazione tassonomica della specie di appartenenza di un ceppo batterico.

Memorizzare questa definizione di specie (impararla bene)

Il concetto di specie per gli organismi superiori è diverso rispetto al concetto di specie applicabile per i batteri. Nei batteri la specie è definita come un insieme di ceppi isolati in habitat diversi e tempi diversi che possiedono delle regole pratiche:

• Elevata similarità fenotipica, con almeno una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie.
• Una elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA almeno 70%).
• Una elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza del gene codificante il 16S rRNA maggiore del 98%).

Lezione 2

La riassociazione molecolare DNA/DNA (detta anche omologia DNA/DNA o ibridazione DNA/DNA) è una prova di laboratorio che prevede i seguenti passaggi:

• Isolamento del DNA totale del ceppo batterico allo studio;
• Isolamento del DNA totale estratto da un ceppo di riferimento (solitamente il ceppo type di una specie);
• Rottura meccanica dei due DNA;
• Miscela dei due DNA;
• Denaturazione termica del campione con misura della densità ottica (a 260 nm);
• Lento raffreddamento del campione con misura della densità ottica (in questa fase avviene l'ibridazione, cioè il DNA dei due campioni si riassociano fra di loro).

La composizione del ribosoma batterico

I ribosomi batterici hanno un coefficiente di sedimentazione (è una misura di quanti cicli di centrifugazione affinché la subunità precipiti) pari a 70s e le due subunità ribosomiali hanno un coefficiente di 50s (subunità maggiore) e 30s (subunità minore). Il ribosoma degli eucarioti ha un coefficiente pari a 80s, formato anch'esso dalle due subunità: 60s e 40s.

Il 16S rRNA

• Svolge il suo ruolo biologico grazie alla sua conformazione della sua struttura e il suo grado di riavvolgersi.
• È un gene lungo ca 1542 nt, dopo la trascrizione assume una particolare struttura secondaria.
• Codifica per la subunità piccola del ribosoma procariota (negli eucarioti 18S rRNA).
• È l'orologio molecolare più usato per studiare la filogenesi ed identificare i batteri.
• Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere la sua funzione, quindi, ha un basso tasso di mutazione (la maggior parte delle mutazioni producono ribosomi non funzionanti e non vengono trasmesse alla progenie).
• Le regioni in oro sono quelle in cui le mutazioni possono avvenire molto più facilmente.
• Il gene 16S rRNA è un gene conservato in alcune sue parti.

Le regioni grigie sono le regioni non codificanti. Subisce mutazioni di sequenza molto lentamente. Al fine di identificare un ceppo batterico a livello di specie si utilizzano geni conservati dei procarioti che possono essere usati come orologi molecolari in grado di esprimere la filogenesi dei batteri, il più noto di questi geni è il:

Gene codificante la subunità ribosomiale 16S (16S rRNA)

Esso è un gene appartenente all'operone ribosomiale batterico. I geni 16S, 23S e 5 rRNA codificano per le subunità di RNA costituenti i ribosomi batterici; l'operone ribosomiale è posseduto da tutti gli organismi viventi.

Il gene che codifica per il 16S rRNA è una regione altamente conservata tra le differenti specie di procarioti (cioè subisce mutazioni di sequenza molto lentamente nel corso dell'evoluzione, poiché è fondamentale per la vita della cellula). È considerato un ottimale "molecular clock", un orologio molecolare, cioè adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici.

Il gene del 16S rRNA nell'identificazione batterica

Il gene del 16S, oltre a regioni estremamente conservate, il gene codificante i 16S rRNA contiene regioni variabili che possono rappresentare delle sequenze di riconoscimento di tipo specie-specifico, utili per l'identificazione dei batteri.

Sulla base delle sequenze note del gene codificante il 16S rRNA, sono stati preparati degli oligonucleotidi definiti primer universali (o meglio panbatterici), che permettono di amplificare via PCR questo gene virtualmente da tutti i batteri.

Affinché il legame fosfodiestere possa essere formato dall'enzima DNA polimerasi, sono indispensabili un ossidrile (-OH) libero in posizione 3’ e un nucleotide trifosfato (cioè in forma energizzata). La formazione di un filamento di DNA avviene in direzione 5’ → 3’.

La reazione a catena della polimerasi

• Kary Mullis ideò e mise a punto la PCR (Polymerase Chain Reaction) tra il 1983 ed il 1985.
• Riproduce in vitro la reazione di replicazione del DNA.
• Permette di replicare (riprodurre) indefinitamente una specifica regione di DNA.

Affinché la PCR avvenga sono necessari:

Taq Polimerasi

È l'enzima DNA-polimerasi utilizzato per le reazioni di PCR. Si chiama in questo modo perché è stato originariamente isolato dal batterio termofilo Thermus aquaticus.

Negli eucarioti ha un gene 18S, no 16S. Noi utilizziamo il gene 16S rRNA nell'identificazione batterica, perché:

• Ha delle regioni molto conservate, non tutte sono fondamentali perché quella struttura non partecipa direttamente alla sintesi proteica, quelle fondamentali sono dette universali o panbatteriche, che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri.
• Grazie al fatto che unisce regioni molto conservate a regioni molto variabili.
• Regioni semiconservate, che hanno sequenza uguale tra batteri di uno stesso taxon (ad esempio in batteri di uno stesso genere).
• Regioni variabili, che hanno la stessa sequenza solo tra i batteri appartenenti alla stessa specie.

N.B. Le regioni conservate sono quelle che codificano per un tradotto molto importante per la vita di una cellula.

N.B. La PCR è una riproduzione in vitro della replicazione del DNA che avviene in una cellula. La replicazione del DNA può essere fatta anche in vitro, con l'utilizzo di termociclatore (detto anche ciclatore termico) per PCR. È stato scoperto da Mullis.

Le tre fasi della PCR

I cicli della PCR

Da una singola molecola di templato, sono prodotti circa 1 miliardo di frammenti copia di DNA in 30 cicli:

PCR = reazione a catena della polimerasi, riprodurre una regione di DNA milioni, e milioni di volte. 31 cicli = 2 000 000 di copie.

Le applicazioni della PCR

• Nelle biotecnologie: semplificazione del processo di clonaggio di geni singoli per le più dettagliate analisi biochimiche.
• In medicina: per una rapida diagnosi di infezioni virali o per la diagnosi prenatale di malattie congenite.
• In microbiologia: di fondamentale importanza per la tassonomia e la tipizzazione molecolare di isolati microbici.

Ricapitolando: La replicazione in vitro: Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma.

→ PCR Polymerase chain reaction

La verifica dell'avvenuta amplificazione avviene solitamente con elettroforesi in gel di agarosio (una tecnica che permette di visualizzare il DNA).

Nella sequenza del gene codificante il 16S rRNA si riconoscono diverse regioni:

• Regioni conservate, dette universali o panbatteriche, che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri.
• Regioni semiconservate, che hanno sequenza uguale tra batteri di uno stesso taxon (ad esempio i batteri di uno stesso genere).
• Regioni variabili, che hanno la stessa sequenza solo tra batteri appartenenti alla stessa specie.

Lo studio della filogenesi batterica

Confrontando la sequenza del gene codificante il 16S rRNA dei diversi batteri è possibile quantificare la distanza filogenetica, cioè determinare a che punto dell'evoluzione due specie batteriche si sono differenziate. Algoritmi matematici allineano le sequenze dei geni codificanti il 16S rRNA e ne determinano il...