Ecologia del microbiota umano, parte 3, prof. Simone Guglielmetti

Corso di qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Mod. ecologia del microbiota umano

Prof. Diego Mora, Simone Guglielmetti

Parte 3: Simone Guglielmetti

Dall’interazione tra diete, uomo e microbiota intestinale, agli effetti della vitamina D sul microbiota intestinale

© Laila Pansera - 1

Sommario

• Interazioni tra dieta, essere umano e microbiota intestinale ............................................................................... 4
• Caso studio 3: l’assunzione di fibra con la dieta previene lo sviluppo di polipi intestinali e cancro del colon-retto con un meccanismo mediato dal microbiota intestinale .................................................. 5
• Caso studio 4: la dieta può promuovere l’aterosclerosi con un meccanismo mediato dal microbiota intestinale ........................................................................................................................................................................... 8
• La formazione di TMAO dalla carnitina ingerita nei vegani è molto ridotta ..................................... 13
• Enterotipi ..................................................................................................................................................................... 13
• Caso studio 5: effetti dei dolcificanti artificiali sull'intolleranza al glucosio ............................................ 15
• Caso studio 6: come i grassi del latte inducono infiammazione intestinale ........................................... 25
• Conclusioni....................................................................................................................................................................... 31
• Asse microbiota-intestino-cervello .............................................................................................................................. 31
• Asse intestino-cervello ................................................................................................................................................ 31
• Asse microbiota-intestino-cervello ......................................................................................................................... 32
• Esperimento 1 ............................................................................................................................................................ 36
• Esperimento 2 ............................................................................................................................................................ 37
• Esperimento 3 ............................................................................................................................................................ 38
• Ricerca sui probiotici di nuova generazione .................................................................................................. 41
• Effetti della vitamina D della dieta sul microbiota intestinale e sull’osso ..................................................... 42
• Asse microbiota – osso................................................................................................................................................ 42
• Studio: la salute del microbiota intestinale può influenzare la salute delle ossa ............................. 45
• Studio: prebiotici e uptake di calcio .................................................................................................................. 47
• Studi: probiotici ......................................................................................................................................................... 47
• Studi epidemiologici: l’esposizione alla vitamina D nei primi anni di vita ha un influenza sulla salute dell’osso .......................................................................................................................................................... 49
• Studi preclinici: la vitamina D assunta con la dieta modula il microbiota intestinale .................... 51
• Studio clinico: ............................................................................................................................................................. 52
• Studio: effetti della vitamina D nella dieta sull’osso su topi sani e topi obesi ....................................... 53
• Primo studio: topi sani ............................................................................................................................................ 53
• Secondo studio: topi obesi ................................................................................................................................... 54
• © Laila Pansera - 2
• Bacteroides PrevotellaStudio: effetti della vitamina D su e .......................................................................... 57
• © Laila Pansera - 3

Interazioni tra dieta, essere umano e microbiota intestinale

È già stato detto più volte che esiste una stretta connessione tra la dieta, il microbiota intestinale e l’ospite. Vediamo ora più in dettaglio come si può declinare questa relazione a tre elementi. L’interazione più scontata è tra dieta ed essere umano: se mangio qualcosa, questo mi fa bene. È anche chiara l’interazione tra microbiota intestinale ed essere umano, oltre al fatto che l’essere umano influisce sul microbiota: produce ad esempio sali biliari, mucine, defensine (peptidi antimicrobici); quindi l’ospite influisce sui microrganismi intestinali.

Ora dobbiamo vedere come la dieta influisce sul microbiota intestinale. Abbiamo già visto 2 studi:

• Dieta ricca in grassi (HFD) induce il tumore epatico
• Il sale influisce sul microbiota intestinale che causa ipertensione.

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Caso studio 3: l’assunzione di fibra con la dieta previene lo sviluppo di polipi intestinali e cancro del colon-retto con un meccanismo mediato dal microbiota intestinale

Il primo esperimento nasce da un gruppo di ricerca che studiava tutte le possibili mutazioni dei topi. Topi con mutazioni dette Niacr1 sono particolarmente sensibili allo sviluppo di polipi intestinali, stadi precedenti allo sviluppo di tumori maligni. Nell’immagine si vedono i topi di controllo (wild type) e si vedono polipi nei topi knock out per il recettore Niacr1.

Convenzionalmente, si fanno modelli di topo di infiammazione, che prevedono il seguente design: dopo 3 settimane di vita si fa somministrazione di AOM (azossimetano, sostanza mutagena), dopodiché si produce infiammazione nell’animale mediante DSS (sodio solfato destrano). Il gene Niacr1 codifica per la proteina Gpr109a, che è un recettore nelle cellule epiteliali intestinali, e si trova nei macrofagi e nelle cellule dendritiche. La presenza di un gene attivo Niacr1 determina protezione nei confronti di polipi intestinali, mentre l’assenza del recettore che viene codificato dal gene causa la formazione dei polipi. L’assenza di questo gene (e quindi la mancanza del recettore) comporta una differenza importante anche di tipo immunitario: nel colon (ma non nella milza) dei topi Niacr1 vi era un eccesso di linfociti Th17 ed una riduzione di Treg, quindi anche una riduzione della citochina antinfiammatoria IL-10.

Il Grp109a è il recettore intestinale del butirrato e della niacina (o vitamina PP, ossia la pellagra preventing), che sono prodotti del metabolismo microbico. Questi sono i substrati del recettore, perciò appare plausibile che il microbiota sia coinvolto: la mancanza del recettore determina lo sviluppo del polipo intestinale e squilibrio immunologico. È stata eseguita una PCR quantitativa: si nota come la mancanza del recettore determina l’espansione di batteri appartenenti alla famiglia delle Prevotellaceae, e di batteri appartenenti alla divisione dei batteri Gram+ non coltivabili detti TM7.

Effettivamente si assiste ad una disbiosi: la presenza della mutazione determina uno squilibrio immunologico, la formazione di polipi ed un’espansione di certi batteri, che potrebbero essere coinvolti in questo processo patogenico. Questi 2 batteri sono dei potenziali patobionti, ossia microrganismi intestinali coinvolti nella infiammazione intestinale. Per vedere se il microbiota era davvero coinvolto nella patologia, è stato eseguito un trattamento con 4 antibiotici diversi e si è osservato che il trattamento con antibiotici riusciva a dimezzare il numero di polipi nell’intestino dei mutanti e al tempo stesso aumentare i tumori nei topi di controllo (wild-type, WT).

La conclusione che si può trarre è: i microrganismi sono coinvolti (perché se eliminati c’è una conseguenza sulla patogenesi), l’esperimento suggerisce che nell’intestino co-esistono inevitabilmente microrganismi cancer promoting e cancer protecting. Essi sono in equilibrio in base all’ospite e alla dieta. L’assenza del recettore porta a un microbiota intestinale cancer-promoting.

Quindi finora le differenze rilevate sono fondate su una differenza genetica, che determina anche una differenza del microbiota. Per quanto riguarda il coinvolgimento della dieta, gli autori hanno fatto un ragionamento semplice, ossia: niacina e butirrato sono formati da processi di fermentazione della fibra, quindi, la fibra è un punto di partenza da cui possono derivare questi prodotti.

Piccola precisazione: gli autori hanno voluto utilizzare il modello di topo Apc^min/+, ossia topo che ha mutazione nel gene Apc (adenomatosis polyposis coli) che nel topo predispone alla formazione di polipi a livello intestinale.

I topi Apc^min/+ sottoposti a dieta FC (dieta convenzionale) non manifestavano i polipi, al contrario nei topi Apc^min/+ Niacr1^-/- (con la doppia mutazione, ossia sprovvisti anche del recettore per butirrato e niacina) determinava un aumento di polipi. Successivamente è stato studiato l’effetto della dieta priva di fibre FF: il topo Apc^min iniziava a sviluppare polipi e il topo doppio mutante continuava a sviluppare polipi. Infine, accanto alla dieta senza fibre è stata somministrata la niacina: è stata osservata una riduzione dei polipi in topi Apc^min, mentre nei topi Apc^min/+ Niacr1^-/- non c’erano differenze.

Conclusioni: la somministrazione di niacina è sufficiente per controbilanciare l’effetto della dieta FF. Quindi è stato ipotizzato che la fibra sia fondamentale come elemento protettivo contro polipi in animali predisposti a svilupparli. La dieta senza fibre promuove la formazione di polipi in quanto impedisce la produzione di butirrato e niacina. Introducendo la niacina, la mancata formazione dei polipi in Apc^min è la dimostrazione che un singolo prodotto del microbiota, ossia la niacina, è sufficiente per spingere verso la capacità di non sviluppare polipi. La mutazione Apc^min/+ anche nell’uomo predispone alla formazione di polipi: la presenza o meno di fibra potrebbe far sviluppare o meno i polipi anche nell’uomo.

La fibra introdotta con l’alimentazione raggiunge il colon dove il microbiota la trasforma e produce una serie di metaboliti (butirrato e niacina). Per questi, esistono dei recettori a livello intestinale che sono sulle cellule epiteliali e sulle cellule del sistema immunitario (le APC, Antigen Preventing Cells: macrofagi e cellule dendritiche, ossia quelle coinvolte nello skewing linfocitario). Butirrato e niacina quando attivano il signaling (ossia la cascata di reazione del recettore Gpr109a) hanno come effetto la produzione di IL-18 da parte delle cellule epiteliali, che ha capacità di spegnere l’infiammazione. I macrofagi e le cellule dendritiche sono indotte a produrre IL-10 e dirigono lo skewing linfocitario nella direzione Treg, ossia antinfiammatoria (i linfociti quindi non vanno nella direzione Th17).

Per cui l’assenza di fibra causa mancanza di butirrato e niacina, perciò non scatta il signaling di Grp109a e quindi mancano le risposte immunitarie antinfiammatorie protettive nei confronti dell’infiammazione, e quindi comporta lo sviluppo di tumore. In questo lavoro non sono riusciti a trovare a determinare l’abbondanza dei microrganismi, l’obiettivo del lavoro era prettamente immunitario. Quindi non si sono coltivati i microrganismi che si supponeva fossero patobionti, per cui non ci sono ulteriori informazioni a riguardo.

Riassumendo:

Caso studio 4: la dieta può promuovere l’aterosclerosi con un meccanismo mediato dal microbiota intestinale

Questo lavoro sembra spiegare perché in soggetti che hanno assunzione di colesterolo alta non hanno aterosclerosi, così come persone che non introducono molto colesterolo hanno alta suscettibilità ad aterosclerosi. Il punto di partenza alimentare è l’assunzione di acetil-carnitina (o carnitina) e di fosfatidil-colina (o colina). Queste molecole si trovano in fonti animali, specialmente carne, pesce, formaggi. In particolare la carnitina ha come fonte primaria la bistecca di manzo (1 etto ne contiene 150 mg), la colina ha invece come fonte primaria l’uovo (1 etto di uovo ne contiene circa 800 mg). La carnitina funziona da carrier degli acidi grassi permettendone l’utilizzo da parte dei mitocondri per generare ATP. La colina è essenziale per la costituzione delle membrane cellulari e dei neurotrasmettitori aminici (per es. acetilcolina). Spesso ne introduciamo molto di più perché sono spesso presenti negli integratori.

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Una volta introdotte queste molecole, nel colon avviene la loro metabolizzazione batterica:

• Il pathway della ossigenasi detta rieske-type (proteina Fe-S non eme-dipendente) converte la carnitina in trimetilammina (TMA).
• La colina presenta una parte carboniosa usata dal batterio e quella di ammonio che usa per formare la TMA. La colina è convertita in TMA dal glycyl radical enzyme colina-TMA liasicut (codificata dal cluster genico cut).

La TMA rappresenta una parte della molecola (carnitina o colina) che il batterio non metabolizza, non rappresenta una fonte di azoto utile e viene scartata. Si tratta di uno scarto, si forma anche sul pesce per attività microbica. Questa molecola viene assorbita efficientemente dalla mucosa intestinale, e una volta assorbita va nella vena porta che la manda nel fegato. Piccola precisazione: queste attività enzimatiche (di metabolizzazione di carnitina e colina) sono distribuite in modo non tassonomico, ossia in un certo gruppo tassonomico posso trovare batteri che ce l’hanno e batteri che non ce l’hanno (sono capacità enzimatiche ceppo-specifiche; i Bacteroidetes non hanno questa capacità).

Nel fegato, la TMA viene trasformata in ossido di trimetilammina (TMAO) grazie alle flavin-monossigenasi (FMO). Il TMAO è molto solubile e viene eliminato nelle urine, dove lo si può misurare (così come nella circolazione periferica). È stato fatto un challenge test per spiegare il nesso tra microbiota e TMAO.

Lo schema del challenge test è il seguente (A):

• Visita 1: dopo 12 ore di digiuno, sono stati forniti ai soggetti 250mg di d³-carnitina da sola, oppure 230g di bistecca (contenente 180 mg di carnitina); sono stati raccolti campioni di sangue e delle urine delle 24h per le analisi TMA e TMAO
• Sono stati dati degli antibiotici, con lo scopo di sopprimere il microbiota intestinale (fase di gut flora suppression)
• Visita 2: i soggetti hanno interrotto l’assunzione di antibiotici, hanno riassunto la carnitina
• Si sono aspettate 3 settimane per riconsentire il ripopolamento del microbiota intestinale
• Visita 3: i volontari hanno riassunto la carnitina.

NB: La carnitina è denominata d³-carnitina perché è deuterata, ossia marcata con deuterio (si tratta di un atomo di idrogeno pesante perché possiede un protone e un neutrone nel nucleo dell’atomo, con peso atomico maggiore che rende il deuterio distinguibile in spettrometria di massa), in questo modo la molecola è più facilmente identificabile.

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Gli autori hanno misurato il TMAO nel sangue periferico. È stata vista la presenza di TMAO dopo la prima visita, però quando è stato tolto il microbiota con antibiotici, dopo la prima visita è sparita la TMAO. Dopo il periodo di riacquisizione del microbiota, è ricomparsa la TMAO (B). Per essere certi che fosse proprio la carnitina la fonte di TMAO, è stato misurato il TMAO deuterato: se c’è TMAO deuterato, significa che deriva dalla d³-carnitina. Effettivamente nella prima visita c’è TMAO marcato, nella seconda sparisce e poi ricompare (C).

Conclusione: TMA-TMAO-carnitina sono correlati.

L’immagine D rappresenta la misura della cinetica di produzione di TMAO marcato e contemporaneo metabolismo della carnitina marcata, nelle ore dopo l’assunzione della carnitina deuterata: in ascissa c’è il tempo in ore e sulle ordinate la concentrazione delle molecole. Gli autori hanno voluto determinare se c’è un nesso tra TMAO nel sangue e la carnitina, ossia che la carnitina fa aumentare la TMAO perché sono i batteri intestinali che producono TMA.

Risultato: all’inizio c’è un picco della carnitina perché viene assorbita, col passare delle ore però la carnitina non assorbita va nelle parti distali del tenue e del colon, dove ci sono microrganismi che la trasformano in TMAO che viene assorbito. Questo processo ha una cinetica che nel corso delle ore aumenta progressivamente.

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Questo esperimento dimostra che la carnitina è una delle fonti di TMA, e che il microbiota è fondamentale in questo passaggio. Se mangio carnitina ho dei picchi di presenza di ossido di trimetilammina che dipende dalla microflora intestinale: nei soggetti con microbiota ridotto, la TMAO non si forma.

Perché viene anche fornita la bistecca? Se si fornisce solo carnitina alimentare, non c’è dimostrazione forte del nesso causa-effetto. Se si fosse eseguito un esperimento solo con bistecca, si poteva pensare che la TMAO provenisse da altre fonti alimentari, in luogo della carnitina.