Modulo Ecologia del microbiota umano

Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Modulo: ecologia del microbiota umano

Prof: Simone Guglielmetti

Principi di ecologia

L'ecologia è lo studio scientifico delle interazioni tra gli organismi e il loro ambiente (include le interazioni che gli organismi hanno tra loro e con il loro ambiente abiotico). L'ecosistema è l'unità funzionale fondamentale in ecologia. È l'insieme degli organismi viventi e delle sostanze non viventi con le quali i primi stabiliscono uno scambio di materiale ed energia.

Il biota è il complesso degli organismi viventi che occupano un determinato spazio. Quindi solo alla parte biologica dell'ecosistema. L'habitat è l'ambiente in cui vive una specie animale o vegetale. In un ecosistema ci sono habitat diversi (nel bosco vi sono, ad esempio, gli habitat del sottobosco e degli alberi e, all'interno di questo, l'habitat delle fronde, del tronco, delle radici). È l'ambiente associato ad un determinato vivente. (esempio ambiente intestino, particolare tratto di intestino habitat).

La nicchia ecologica è lo spazio occupato da una specie o da una popolazione all'interno del suo habitat, inteso non come spazio fisico, ma come ruolo e funzioni che gli individui svolgono in un ecosistema, o anche come una specie utilizza le risorse dell'habitat in cui vive. In altre parole, la nicchia ecologica descrive come un organismo risponde alla distribuzione delle risorse e degli organismi competitori (ad esempio, aumentando quando le risorse sono abbondanti e quando predatori, parassiti e agenti patogeni sono scarsi) e come a sua volta altera quegli stessi fattori (ad esempio, limitando l'accesso a risorse di altri organismi, fungendo da fonte di cibo per predatori e consumatori di prede). NB: il termine nicchia è fuorviante perché ha propriamente un significato di spazio fisico mentre la nicchia ecologica non è lo spazio (habitat) occupato da un organismo bensì il ruolo che esso ha.

Ecologia microbica

L'ecologia microbica (microbial ecology) è lo studio del comportamento e delle attività dei microrganismi nei loro ambienti naturali. Il termine ecologia microbica viene utilizzato in modo generale anche per descrivere la presenza e le distribuzioni di microrganismi nei vari ecosistemi.

La microbiologia ambientale si riferisce principalmente all'insieme dei processi microbici che si verificano in un ambiente (il suolo, l'acqua di un lago, un alimento, l'intestino umano) ed ha perciò un significato sovrapponibile a quello di ecologia microbica. La microbiologia ambientale, però, si occupa più nello specifico degli effetti su più ampia scala della presenza e delle attività microbiche.

In un ecosistema microbico le singole cellule crescono per formare popolazioni. Le popolazioni metabolicamente correlate costituiscono raggruppamenti chiamati corporazioni o gilde (guilds). I set di corporazioni che conducono processi fisiologici complementari interagiscono per formare comunità microbiche. Le comunità microbiche interagiscono quindi con le comunità di macrorganismi per definire l'intero ecosistema. La distribuzione dei microrganismi nell'ecosistema naturale dipende dalle risorse (nutrienti) disponibili e dalle condizioni di crescita. Temperatura, pH, disponibilità di acqua, luce, ossigeno di un habitat definiscono la nicchia per ciascun microrganismo particolare.

NB: è importante ricordare che una comunità è costituita da tanti individui appartenenti a specie diverse; l'insieme di tutti gli individui della stessa specie che vivono in un ecosistema viene invece chiamato popolazione. La comunità può quindi essere definita come popolazioni che vivono nello stesso ecosistema.

La classificazione dei viventi

I microrganismi stanno in monera, protisti e fungi; si chiamano così perché non sono visibili da noi. L'occhio umano non può distinguere due punti come separati se sono più vicini di 0,2mm. Un batterio generalmente è su 1micron di diametro... i virus sono sì microrganismi ma sono al di fuori di questa classificazione perché sono borderline tra viventi e non viventi.

Interazioni tra organismi viventi in un ecosistema

• Neutralismo: compresenza di diverse specie senza che vi sia per esse beneficio o danno
• Commensalismo: interazione non obbligatoria fra due esseri viventi in cui uno approfitta del nutrimento o degli scarti dell'altro senza procurare danno o beneficio
• Sinergismo (protocooperazione): interazione non obbligatoria in cui entrambe le popolazioni traggono beneficio. Entrambe le popolazioni sono in grado di sopravvivere indipendentemente (es: due diversi batteri nello yogurt, in cui presi da soli non fanno niente insieme producono lo yogurt).
• Mutualismo (simbiosi): interrelazione obbligatoria tra due popolazioni che determina beneficio per entrambe (tra un fungo e un'alga nei licheni). NB: le forme di interazione biologica (cioè tra diversi organismi viventi) appena descritte vengono tutte considerate forme di simbiosi (per es: simbiosi mutualistica, simbiosi parassitaria...) in accordo con la letteratura scientifica più recente. Tuttavia, la parola simbiosi tradizionalmente, è stata usata come sinonimo di mutualismo.
• Antagonismo: interazione tra specie nella quale una o ambedue le specie in relazione subiscono un danno. Le principali relazioni antagonistiche sono antibiosi, parassitismo, predazione e competizione.
  • Antibiosi: inibizione della crescita e della riproduzione di un microrganismo da parte di un altro
  • Parassitismo: interazione fra due specie, generalmente di natura trofica, in cui una (il parassita) trae un vantaggio a spese dell'altra (ospite), creandogli un danno biologico.
  • Predazione: interazione in cui un organismo (predatore) usa come fonte di cibo un altro organismo solitamente di specie differente (preda).
  • Competizione: interazione che si verifica quando due popolazioni stanno cercando la stessa risorsa di nutrienti o habitat (per es. competizione per nutrienti o per siti di adesione).

Come si denominano i microrganismi?

Terminologia:

• Classificazione: è la sistemazione degli organismi viventi all'interno di gruppi tassonomici (TAXA, TAXON se detto al singolare) sulla base di similarità o relazioni
• Tassonomia: è la scienza dell'ordinare gli organismi in un sistema di classificazione composto da una gerarchia di Taxa
• Nomenclatura: è l'assegnazione di nomi ai gruppi tassonomici nel rispetto di specifiche regole
• Identificazione: è il processo che permette di stabilire a quale Taxon appartiene un nuovo isolato microbico.
• Filogenesi o filogenia: è il processo evolutivo degli organismi viventi dalla loro comparsa ad oggi.

Nomenclatura

La nomenclatura binomiale: fu ideata da Carlo Linneo nel XVIII secolo (1753). È basata sul concetto di specie (unità tassonomica fondamentale), intesa come l'insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e di somiglianze a livello anatomo-morfologico e, più in generale, fisiologico: tali caratteristiche differenziano gli individui di una specie da quelli di tutte le altre.

Questa nomenclatura prevede l'utilizzo di due termini latini o latinizzati: il primo è l'epiteto generico (in corsivo, maiuscolo; spesso abbreviato alla prima lettera), il secondo è l'epiteto specifico (corsivo, minuscolo). Esempio: Homo sapiens, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli. Gli organismi viventi vengono classificati e raggruppati in una sorta di gioco a matrioska, in cui abbiamo contenitori sempre più piccoli.

Bifidobacterium bifidus vive nell'intestino e solo qua, ha la sua nicchia e riesce a vivere solo lì. NB: I livelli tassonomici superiori (famiglia, ordine...) vanno in maiuscolo e possono essere scritti in corsivo o non in corsivo a seconda di scelte editoriali o dell'autore (spesso in microbiologia si scrivono in corsivo solo i nomi di genere e specie, ma non famiglie, ordine, divisioni...).

Ceppo

Noi con la tassonomia ci fermiamo a dei contenitori. Parlare di specie e di subspecie non da informazioni precisissime sull'elemento in analisi. In microbiologia, per descrivere questo concetto c'è il termine di ceppo che è un insieme di cellule microbiche teoreticamente originate da un'unica cellula progenitrice e quindi idealmente aventi un identico patrimonio genetico.

Il livello tassonomico della divisione o Phylum è molto importante soprattutto a livello di ecologia microbica queste sono le principali divisioni batteriche. Questo schema parte dal basso col primo microrganismo che ha invaso la terra e verso l'altro descrive lo sviluppo dei batteri: infatti, come possiamo osservare, si sono sviluppati prima i Gram+ e poi i -. Dendrogramma con radice perché descrive le diverse cose con un punto comune.

Identificazione batterica

Avendo detto che l'unità tassonomica di base è la specie si definisce quella batterica: nell'ambito della microbiologia è definito come una collezione di ceppi simili che differiscono sufficientemente da altri gruppi di ceppi da giustificare il riconoscimento come unità tassonomica a sé stante. NB: ogni specie batterica possiede un ceppo type, cioè un ceppo di riferimento che riassume in sé tutte le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi della specie che rappresenta. Dove posso trovare il ceppo type di ogni specie? I ceppi type si trovano nelle "ceppoteche" cioè nelle collezioni di colture cellulari. Le collezioni di colture di riferimento, in Europa e negli Stati Uniti sono le seguenti: nei batteri la specie è definita come un insieme di ceppi isolati in habitat diversi ed in tempi diversi che posseggono:

• Un'elevata similarità fenotipica con almeno una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie
• Un'elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA>70%):
• Un'elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza del gene codificante il 16S rRNA maggiore del 98%)

Per quanto riguarda la riassociazione molecolare: la riassociazione molecolare DNA/DNA (detta anche omologia DNA/DNA o ibridazione DNA/DNA è una prova di laboratorio che prevede i seguenti passaggi: isolamento del DNA totale del ceppo batterico allo studio; isolamento del DNA totale estratto da un ceppo di riferimento (solitamente il ceppo type di una specie); rottura meccanica dei due DNA; miscela dei due DNA; denaturazione termica del campione con misura della densità ottica (a 260nm); lento raffreddamento del campione con misura della densità ottica. La percentuale di omologia si stabilisce analizzando la curva di riassociazione che avviene durante il raffreddamento, fase in cui i DNA dei due ceppi riassociano fra di loro. Tale curva varia a seconda di quanto le sequenze di DNA sono simili tra loro.

Avendo due ceppi type e bisogna capire se sono della stessa specie: estraggo DNA e lo rompo e faccio la curva di ipercromicità di entrambi separati. Successivamente li unisco; se i due ceppi sono completamente diversi tra loro la curva sarà più in alto nella fase di raffreddamento perché no si potranno riappaiare bene, quindi il riappaiamento sarà peggiore rispetto a quella dell'ibridazione con sé stesso. Se, invece, ho due ceppi della stessa specie, la curva di raffreddamento sarà più bassa a seconda di quanto sono simili. Il confine del 70% è un limite posto per il confine di specie. Poiché si lavora con tante specie microbiche, non è una tecnica molto utilizzata ma viene usata di più l'omologia del 16S.

Omologia di sequenza del gene codificante il 16S rRNA: i ribosomi sono la sede della sintesi proteica, i ribosomi batterici sono composti da due macromolecole proteine e RNA che si uniscono tra di loro. Questi sono formati da diverse subunità che posso distinguere tramite dei protocolli con trattamenti chimici e meccanici che prevedono la loro separazione:

• Aggiungendo agente chelante del magnesio e centrifugo comincio ad osservare le subunità proteiche e ottengo una subunità large e una small (50S e 30S) le S sono definite come quanti giri devo assumere per far precipitare una subunità. Se a questo aggiungo un agente denaturante (es. urea) permette di separare l'RNA e proteine, quindi dalla subunità large riesco ad ottenere una serie di proteine (L1, L2…) e due tipi di RNA: 5S RNA e un altro più grande che è la 23S. Anche con la subunità 30S si può fare questa cosa e si ottengono delle proteine chiamate S1, S2… e un RNA definito 16S. l'RNA 16S svolge già il suo ruolo biologico senza la traduzione in proteine. Questo 16S RNA è un gene lungo circa 1542 nt, che dopo la trascrizione assume una particolare struttura secondaria. Codifica per la subunità piccola del ribosoma procariota (negli eucarioti è 18S RNA. È l'orologio molecolare più usato per studiare la filogenesi e identificare i batteri. Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere la sua funzione, quindi ha un basso tasso di mutazione (la maggior parte delle mutazioni producono ribosomi non funzionanti e non vengono trasmesse alla progenie). (i geni conservati sono quelli che accettano nel corso dell'evoluzione con molta difficoltà le mutazioni, per questo motivo il gene 16S è molto conservato).

Quindi, al fine di identificare un ceppo batterico a livello di specie si utilizzano geni conservati dei procarioti che possono essere usati come orologi molecolari in grado di esprimere la filogenesi dei batteri, il più noto di questi è appunto il 16S. Esso è un gene appartenente all'operone ribosomiale batterico. I geni 16S, 23S e 5S rRNA codificano per le subunità di RNA costituenti i ribosomi batterici; l'operone ribosomiale è posseduto da tutti gli organismi viventi.

Il gene che codifica per il 16S rRNA è una regione altamente conservata tra le differenti specie di procarioti (cioè che subisce mutazioni di sequenza molto lentamente nel corso dell'evoluzione, poiché è fondamentale per la vita della cellula). È considerato un ottimale molecular clock, ovvero un orologio molecolare, cioè adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici, questo è possibile perché ha delle regioni molto conservate e altrettante molto variabili.

Il gene 16S rRNA nell'identificazione batterica

La cosa importante di questo gene è che ha delle regioni molto conservate ma non è tutto, in realtà contiene diverse regioni: (frequenza alta gene conservato, vuol dire che più del 95% dei batteri hanno quella regione lì, al contrario i picchi in giù del grafico identifica le regioni V ovvero regioni molto variabili).

• Regioni conservate, dette universali o panbatteriche che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri
• Regioni semiconservate, che hanno sequenza uguale tra batteri di uno stesso taxon (esempio i batteri di uno stesso genere)
• Regioni variabili, che hanno la stessa sequenza solo tra batteri appartenenti alla stessa specie.

Se due 16S rRNA sono diversi per più del 98% si possono identificare come specie diverse.

Come si identifica un batterio?

L'identificazione tassonomica di un ceppo batterico consiste nell'assegnazione di genere e specie e si basa sulla valutazione di caratteristiche fenotipiche e genotipiche e sul confronto di queste caratteristiche con quelle dei ceppi type.

Lo studio delle caratteristiche fenotipiche per l'identificazione di un batterio è la via tradizionale seguita da decenni da quella che è definita microbiologia classica. Ad essa, ora, si è aggiunta (e in molti casi sostituita) la microbiologia basata sulle tecniche di biologia molecolare, che prevede lo studio di DNA e RNA.

• La caratterizzazione fenotipica: le prime caratteristiche da considerare sono le più generali, al fine di ridurre subito il numero delle possibilità tra cui ricercare:
• Caratteristiche morfologiche:
  • Micromorfologia: forma, dimensione, disposizione delle cellule, presenza di endospore
  • Macromorfologia: aspetto della colonia
  • Reazione di Gram
  • Mobilità
• Metabolismo energetico: opera respirazione aerobia, oppure fermentazione; è anaerobio facoltativo...
• Caratteristiche colturali e nutritive: primariamente viene considerata la tipologia di fonte di carbonio. È importante ottenere un profilo di utilizzazione del carbonio. A tal fine, si prepara un terreno colturale di base, cioè un terreno in cui è stata completamente tolta la fonte dell'elemento in esame (carbonio in questo caso). Trasferisco questo terreno di coltura in alcune provette e in ciascuna aggiungo una fonte di carbonio diversa (glucosio, ribosio, mannosio…). Quindi inoculo ogni provetta con lo stesso numero di cellule del ceppo in esame e metto ad incubare. Se il batterio cresce significa che ha saputo usare quella specifica fonte di carbonio.

NB: se, ad esempio, sto studiando un batterio lattico, posso valutare la capacità di utilizzare la fonte di carbonio da parte del ceppo in esame aggiungendo al terreno di coltura un indicatore di pH. Se il ceppo utilizza la fonte di carbonio produce acido e quindi il colore dell'indicatore di pH cambia.

NB: esistono in commercio kit per poter testare rapidamente numerose fonti di carbonio in contemporanea, come ad esempio il sistema di gallerie API (Analytical Profile Index). Nello specifico, le gallerie API consistono in una serie di microtubi contenenti substrati disidratati per evidenziare attività.