Domande e risposte esame Biochimica 2

Il mio viaggio in Giappone

QUALITÀ.Ê-->ÊLIMITEÊDIÊLEGGEÊPERÊLATTEÊCRUDO/PASTORIZZATOÊÊEÊFORMAGGIOÊFRESCO.BASSAÊTEMPETURAÊESSICAZIONEÊPASTA-->ÊBASSEÊQUANTITÀÊDIÊFUROSINAÊNELLAÊPASTA5)

IlÊfenomenoÊdiÊreticolazioneÊtramiteÊlegamiÊcovalentiÊdipendeÊsiaÊdallaÊtemperaturaÊcheÊdallaÊconcentrazioneÊdellaÊproteina.ÊL'altaÊtemperaturaÊÊl'esposizioneÊdelleÊregioniÊidrofobicheÊeÊdeiÊtioliÊliberiÊcheÊnelÊcasoÊdellaÊBLGÊèÊlaÊÊcysÊ121ÊeÊnellaÊformaÊnativaÊèÊnascostaÊsottoÊlaÊregioneÊalfaÊelicaÊSeÊlaÊconcentrazioneÊproteicaÊaumenta,ÊèÊpiùÊfacileÊcheÊquesteÊmolecoleÊconÊtioliÊespostiÊeÊÊpartiÊidrofobicheÊesterne,ÊsiÊincontrinoÊÊtraÊloroÊformandoÊaggregatiÊinsolubiliÊinÊquantoÊmotiÊbrownianiÊnonÊsonoÊinÊgradoÊdiÊtenerliÊinÊsoluzione.ÊQuestoÊfenomenoÊhaÊconseguenzeÊrilevantiÊinÊambitoÊtecnologicoÊalimentare.ÊAdÊesempioÊseÊscaldiamoÊilÊlatteÊaÊtemperatureÊalteÊlaÊKÊcaseinaÊinteragisceÊconÊBLGÊconÊscambioÊdiÊdisolfuriÊinterÊproteina.ÊIlÊcomplessoÊformato,ÊimpedisceÊilÊtaglioÊdaÊparteÊdellaÊmisceleÊcoagulantiÊ(Êchimosina+pepsina)ÊÊconÊcuiÊvieneÊrimossaÊlaÊporzioneÊidrofilicaÊ(Ê-CÊterminale)ÊdallaÊKÊcaseina.ÊEccoÊperchéÊconÊilÊlatteÊUHTÊnonÊsiÊpuòÊfareÊilÊformaggioÊaÊmenoÊcheÊnonÊsiÊusinoÊcoagulantiÊartificialiÊcomeÊl'enzimaÊtransglutaminasi.ÊUnÊaltroÊesempioÊdiÊreticolazioneÊidrofobicaÊÊindottaÊdaÊaltaÊtemperaturaÊèÊnellaÊpreparazioneÊdellaÊricotta.ÊLeÊsieroproteineÊvengonoÊdenaturateÊconÊlaÊtemperaturaÊaÊ90ÊCÊÊinÊcondizioniÊdiÊphÊbasseÊeÊsiÊformaÊunÊgelÊstabilizzatoÊdaÊinterazioniÊidrofobicheÊcheÊtrattieneÊacqua.ÊIÊfattoriÊÊcheÊinfluenzanoÊlaÊformazioneÊdiÊaggregatiÊsonoÊleÊcondizioniÊambientaliÊcomeÊpHÊeÊpresenzaÊdiÊspecieÊaccessorieÊ(ÊCa++ÊcheÊfaÊdaÊponteÊeÊÊrallentaÊlaÊdenaturazioneÊdell'ÊalfaÊlattoÊalbumina)7)

UnÊmodoÊsempliceÊperÊverificareÊlaÊreversibilitàÊdiÊunaÊreazioneÊèÊmisurareÊl'attivitàÊenzimatica

diÊenzimaÊprimaÊeÊdopoÊtrattamentoÊtermico.ÊÊRipristinandoÊlaÊtemperaturaÊaÊvaloriÊnormali,ÊseÊl'enzimaÊsmetteÊdiÊfunzionare,ÊalloraÊsiamoÊdiÊfronteÊadÊunaÊmodificazioneÊirreversibileÊeÊl'enzimaÊèÊstatoÊinibitoÊdalleÊalteÊtemperature.ÊNelÊcasoÊdiÊproteineÊalimentariÊcheÊnonÊhannoÊattivitàÊenzimatiche,ÊperÊverificareÊseÊlaÊmodificazioneÊèÊreversibileÊoÊno,ÊrimuovoÊl'agenteÊmodificanteÊeÊÊvadoÊaÊmisurareÊseÊleÊcaratteristicheÊbiofisicheÊdellaÊproteinaÊadÊesempioÊl'idrofobicitàÊsuperficiale.temperaturaÊeÊosservoÊseÊlaÊfluorescenzaÊintrinsecaÊrimaneÊintatta.ÊSeÊlaÊfluorescenzaÊsiÊripristina,ÊalloraÊlaÊmodificazioneÊèÊreversibile.ÊSeÊèÊrimastaÊmodificata,ÊancheÊseÊhoÊriportatoÊÊlaÊproteinaÊaÊtemperaturaÊambiente,ÊmodificazioneÊstrutturaleÊirreversibile.

temperatura è poi raffreddo. Se lo spettro torna a quello di prima vuol dire che era reversibile, altrimenti vuol dire che è irreversibile. La fluorescenza del TRP rappresenta uno strumento potente per andare a vedere quanto una proteina è denaturata e a quale T avviene il passaggio da nativa a denaturata. Analizzando lo spettro di fluorescenza della BLG, si è visto che la temperatura di soglia per una modificazione reversibile è T=65°C dettata dal fatto che prima dei 65°C non si ha l'esposizione del TRP verso la superficie polare. Infatti fino ai 65°C non vedo nessun spostamento nel max d'emissione. In conclusione il cambiamento che porta a smorzare la fluorescenza del triptofano fino ai 65°C (diminuzione intensità fluorescenza), è reversibile. Passando da T=65°C a T=75°C, si espone il TRP al solvente ed è una modificazione irreversibile. Una volta che portiamo fuori il TRP dal suo ambiente idrofobico, escono anche altri AA idrofobici. Questi interagiscono tra di loro impedendo alla proteina di tornare nella conformazione originale. 8) Indice di idrofobicità

Il superficiale delle proteine è dato da Fmax/Kd. I parametri sono 2: - Numero dei siti accessibili sulla proteina al marcatore che sto adoperando per vedere se ci sono siti idrofobici.Quanto è affini sono i siti per il marcatore. Più siti ci sono e più sono affini, cioè bravi nel legare il marcatore, più è alta l'idrofobicità della proteina. Se ho pochi siti e non sono affini, allora la superficie della proteina non è tanto idrofobica. Ammesso di avere concentrazioni saturanti di marcatore, se la fluorescenza che misuro è alta significa che ho tanti siti che hanno legato il marcatore. La fluorescenza in base alla quantità di proteina, mi dice quanti siti di legame ci sono. L'affinità si esprime attraverso il legame proteina-ligando ovvero il concetto di costante di dissociazione. Più è Kd è basso, maggiore sarà l'affinità dei siti nei confronti del marcatore e PSH aumenta. Per calcolarlo, uso il principio dell'enzimologia: al 50% di Fmax avrò 1/2 proteina con siti occupati e la concentrazione di marcatore libero è pari a Kd apparente. Quanto più è alto PSH, tanto più il sistema proteico in quell'alimento è ricco in superfici idrofobiche affini. 9) La sensibilità della BLG ad agenti denaturanti può venir modulata dalla presenza di liganti al suo sito attivo. Ad esempio, la presenza di palmitato legato alla cavità centrale del beta-barrel rende la struttura più stabile nei confronti di un agente caotropo come l'urea (e interferisce con il meccanismo di denaturazione). Nel senso che se riempio una struttura cava con una sostanza, il prodotto finale sarà più resistente alle sollecitazioni. Se si pensa all'alfa-lattoalbumina, quando in essa è presente un legame con la molecola di Ca2+, assume una struttura maggiormente stabile, poiché costretta in una data posizione dal legame con lo ione. In questo modo risulta essere anche maggiormente stabile alle variazioni delle condizioni ambientali.