Domande aperte del Paniere di Biochimica clinica

Domande chiuse di biochimica clinica

Concetti generali

1. Di cosa si occupa la medicina di laboratorio?

La medicina di laboratorio contribuisce nel determinare la diagnosi, la prognosi, lo screening, e il monitoraggio della terapia applicando metodologie laboratoriali tecnico-scientifiche. La medicina di laboratorio è una disciplina complessa che si occupa di vari settori come la chimica clinica, l’ematologia, l’immunologia, la biologia molecolare e necessita di varie figure professionali, tra cui il medico, il biologo, il biotecnologo e il tecnico di laboratorio.

2. Il processo diagnostico: fasi ed errori?

Il processo diagnostico viene diviso in cinque fasi: pre-pre analitica, pre analitica, analitica, post analitica, post-post analitica. La fase pre-pre analitica comprende le attività che si svolgono all’esterno del laboratorio di analisi partendo dalla richiesta del test fino al trasporto del campione al laboratorio. La fase pre analitica avviene in laboratorio e comprende quelle attività che precedono la vera e propria analisi come l’etichettatura, l’aliquota e la centrifugazione. La fase di analitica è quella in cui avviene il vero e proprio dosaggio dell’analita. La fase post analitica si esegue in laboratorio e comprende le attività di validazione dati e la composizione del referto. Infine, la fase post-post analitica avviene all’esterno del laboratorio e comprende l’interpretazione dei dati da parte del medico al fine di formulare una diagnosi e una terapia appropriata.

Metrologia

3. Quali sono le differenze tra metodi diretti e metodi indiretti?

Nei metodi di misura diretti i valori misurati vengono ottenuti direttamente senza misurare grandezze associate quindi si ottiene una misura in termini di grandezza fisica del misurando; invece, nei metodi indiretti viene misurata una grandezza associata funzionalmente alla grandezza fisica del misurando.

4. Che cosa descrive la legge di Lambert Beer?

La legge Lambert-Beer descrive la proporzionalità tra la concentrazione di un soluto e l’assorbanza della soluzione ad una determinata lunghezza d’onda. È la legge su cui si basano le tecniche analitiche di spettrofotometria, in medicina di laboratorio può essere utilizzata per esempio nella determinazione del livello di glucosio nel sangue. La legge di Lambert-Beer enuncia che l’assorbanza è uguale al prodotto tra: la costante di assorbimento molare (caratteristica della soluzione) in L/mol*cm, la concentrazione della specie chimica in mol/L e il cammino ottico della cuvetta in cm. A = e*c*l

Variabilità

5. Che cos'è la variabilità biologica?

La variabilità biologica è la naturale fluttuazione, dovuta alla fisiologia dell’individuo e dai suoi ritmi biologici, di ogni analita attorno al proprio punto omeostatico.

Errori di misura

6. Quali sono gli errori di misura?

Gli errori di misura si suddividono in errori grossolani, errori casuali ed errori sistematici. Gli errori grossolani sono generalmente identificabili e sono dovuti ad una scorretta applicazione delle procedure analitiche, essendo identificabili sono anche risolvibili. Gli errori casuali sono dovuti a tutte le piccole variazioni nella misurazione che non sono eliminabili. Gli errori sistematici hanno cause definite e possono dipendere da molteplici elementi come i reagenti, la strumentazione tarata male o mal funzionante e possono essere eliminati.

Immunochimica

7. Gli anticorpi nelle relazioni immunochimiche.

L’immunochimica è una tecnica che può determinare la concentrazione o la presenza di una molecola di interesse sfruttando la capacità degli anticorpi di legare in maniera specifica gli antigeni che ne hanno stimolata la produzione. Possono essere usati sia anticorpi monoclonali che policlonali. Gli anticorpi policlonali sono diversi anticorpi che derivano da cloni plasmacellulari diversi e che presentano eterogeneità nelle regioni variabili e nelle regioni costanti; mentre gli anticorpi monoclonali derivano da un singolo clone di cellule B e sono specifici contro un solo tipo di epitopo. In entrambi i casi gli anticorpi usati sono le immunoglobuline IgG.

8. Cosa sono i traccianti nelle reazioni immunochimiche?

I traccianti sono dei marcatori, coniugati agli Ab, o agli Ag, utilizzati per rendere visibile l’interazione Ag-Ab senza alterarne il legame e il comportamento immunologico. Un tracciante ideale dovrebbe essere il più piccolo possibile, dovrebbe emettere un segnale analitico ad alta intensità per unità di massa, avere un basso rumore di fondo ed essere altamente specifico. I traccianti possono essere marcatori radioattivi, enzimatici, fluorescenti o chemiluminescenti. Nel caso dei marcatori enzimatici, non emettendo un segnale proprio che può essere quantizzato direttamente, la quantificazione avviene mediante l’aggiunta di un substrato metabolizzato dall’enzima in un prodotto colorato che può essere misurato, quindi, l’intensità del segnale emesso è proporzionale all’attività enzimatica e quindi alla sua concentrazione.

9. Quali sono le caratteristiche dei metodi in fase omogenea e non omogenea?

I metodi in fase omogenea sono metodi immunochimici che non richiedono una separazione tra antigene e anticorpo legati ed antigeni liberi e anticorpi liberi. I metodi in fase non omogenea invece richiedono tale separazione in quanto le parti non legate interferiscono con i sistemi di rivelazione analitica o semplicemente il tracciante non fa distinzione tra il complesso legato e antigeni e anticorpi liberi; in questo caso è quindi necessario ottenere il complesso antigene-anticorpo lavando via le molecole non legate al complesso prima di procedere alla rivelazione.

10. Quali sono le caratteristiche dei metodi competitivi e non competitivi?

I metodi competitivi sono basati sulla competizione tra un ag non marcato e un ag marcato per gli ab che sono in concentrazione costante. Nei metodi competitivi l’ag da analizzare viene aggiunto in quantità variabili mentre l’ag marcato viene aggiunto costantemente così facendo il segnale misurato, che è direttamente proporzionale alla quantità di ag marcato, diminuirà all’aumentare del ag analita; questo metodo ha il vantaggio di poter essere utilizzato anche per ag molto piccoli e apteni con un solo epitopo. I metodi non competitivi chiamati anche metodi ELISA sono caratterizzati da una proporzionalità diretta tra il segnale e la concentrazione di analita; l’analisi necessita di un eccesso di ab che riconoscano almeno due diversi epitopi del ag, per cui questi metodi non sono adatti all’analisi di ag molto piccoli. Le concentrazioni di analita non devono essere eccessivamente elevate altrimenti andrebbero a saturare il sistema ottenendo basse quantità di segnale che andrebbe a sottostimare la reale concentrazione di analita; e tra i vantaggi dei metodi non competitivi si ha una maggiore specificità e sensibilità.

Diagnostica enzimatica

11. Che cosa sono gli isoenzimi?

Gli isoenzimi sono differenti isoforme di un enzima, specifici di uno o più tessuti e che presentano strutture diverse. Un esempio è la LDH: un enzima tetramerico, dove possono ricombinarsi due catene polipeptidiche diverse, H e M da cui si formano 5 isoenzimi diversi: LDH1 (HHHH), LDH2 (HHHM), LDH3 (HHMM), LDH4 (HMMM), LDH5 (MMMM).

12. Quali sono i principali marcatori di danni epatici?

I principali marcatori di danno epatico sono le transaminasi: alanina aminotransferasi (ALT) e la AST. Altri marcatori di danno epatico che aumentano in caso di colestasi sono la gammaglutammiltransferasi e la fosfatasi alcalina (ALP).

13. Caratteristiche e significato diagnostico della creatin chinasi?

La creatina chinasi (CK) è un enzima che catalizza la conversione della creatina in fosfocreatina con consumo di ATP. La CK è espressa maggiormente nei tessuti che richiedono energia come il tessuto muscolare, quello cardiaco e quello cerebrale. Il significato diagnostico della CK nel siero è il sospetto di un danno al tessuto muscolare come infiammazione o la necrosi del tessuto stesso; tempo fa, prima di venir sostituita con l’analisi di marcatori cardio specifici veniva anche utilizzata per indagare i danni al tessuto cardiaco come l’infarto del miocardio.

Elettroforesi

14. Descrivere l’elettroforesi SDS-PAGE

L’elettroforesi su gel di poliacrilamide è una metodica utilizzata per separare le diverse proteine di una miscela e determinarne il peso molecolare. Si usa per l’analisi di proteine con PM compreso tra 7 kDa e 200 kDa. La poliacrilamide è trasparente alle fonti luminose sia nel visibile che negli UV e la porosità del gel può essere controllata a seconda del peso molecolare delle proteine analita. SDS sta per sodio dodecil solfato ed ha la funzione di denaturare le proteine e di conferire loro una carica negativa netta omogenea permettendo la separazione in base alle dimensioni delle proteine e non della loro carica. Si utilizza un gel discontinuo composto da una parte superiore composta da un gel di impaccamento e una parte inferiore composta da gel di separazione; il primo (che ha uguale composizione ma in concentrazione molto minore) permette di comprimere tutte le proteine in una zona sottile sopra al gel di impaccamento. Per proteine a basso peso molecolare si usano alte concentrazioni di acrilamide e bis-acrilamide in modo da creare un “setaccio” a maglia più fine, mentre per proteine ad alto peso molecolare si usano basse concentrazioni di acrilamide e bis-acrilamide.

15. Descrivere l’elettroforesi capillare.

L’elettroforesi capillare è una tecnica analitica automatizzata, rapida e con alta risoluzione che combina le tecniche analitiche dell’elettroforesi e della cromatografia a liquido ad alta precisione HPLC. L’analisi si svolge all’interno di un capillare di silice molto sottile per cui le quantità di campione richieste per l’analisi possono essere anche molto piccole. Generalmente i rilevatori utilizzati nell’elettroforesi capillare sono rivelatori UV, di fluorescenza o di massa. Questa tecnica viene utilizzata per analizzare un’ampia gamma di molecole, tra cui farmaci, proteine, aminoacidi, vitamine e anche virus.

16. Descrivere brevemente la tecnica Western blot.

La tecnica western blot è una tecnica immunochimica con lo scopo di separare le singole proteine contenute in una miscela ed esaminare la presenza di proteina specifiche e la loro espressione. Inizialmente si devono ottenere le proteine separate in base al loro peso molecolare su di un gel di poliacrilamide tramite SDS-PAGE; a questo punto si devono trasferire le proteine su di un foglio di nitrocellulosa (blotting proteico) utilizzando un “sandwich” formato da un supporto in plastica, un tessuto spugnoso, un foglio di carta da filtro, il gel con le proteine separate in base al loro peso molecolare della SDS-PAGE, il foglio di nitrocellulosa, un altro foglio di carta da filtro, un altro strato di tessuto spugnoso ed un ultimo supporto di plastica. A questo punto si trasferiscono le proteine dal gel al foglio di nitrocellulosa mediante elettroforesi e dato che le proteine nel gel sono cariche negativamente la parte del gel va rivolta verso l’anodo mentre quella del foglio di nitrocellulosa verso il catodo. Eseguito il blotting proteico, le proteine presenti nel foglio vengono incubate con un anticorpo specifico e successivamente con un anticorpo secondario che si legherà a quello specifico e fungerà da tracciante; infine, analizzando il tracciante si può risalire alla presenza e ai livelli di espressione della proteina di interesse.

17. Come funziona l’elettroforesi 2D?

L’elettroforesi 2D è una tecnica elettroforetica in cui le proteine vengono separate sia in base al loro peso molecolare che al loro punto isoelettrico così da poter separare ogni singola proteina. Inizialmente le proteine vengono separate in base al loro punto isoelettrico mediante isoelettrofocalizzazione su una striscia di poliacrilamide; poi la striscia viene posizionata su di un gel di poliacrilamide sul quale utilizzando la tecnica SDS-PAGE si separano le proteine in base al loro peso molecolare. Una volta colorate le proteine all’interno del gel con blu di Comassi e nitrato d’argento si ottengono, sul gel, una serie di puntini che corrispondono alle specifiche proteine su cui si possono effettuare ulteriori analisi.

Sangue

18. Sangue intero, plasma e siero: quali le differenze?

Il sangue è composto da due fasi: una matrice fluida (il plasma) e una matrice corpuscolata formata da eritrociti (globuli rossi), leucociti (globuli bianchi) e piastrine. Il plasma differisce dal siero per la presenza di fibrinogeno e della presenza dei fattori di coagulazione. Per ottenere il siero si deve prelevare il sangue in una provetta priva di anticoagulante ed attendere 1-2 ore a 37°C per la coagulazione, a questo punto si procede alla centrifugazione a 2000-3000 RPM per 15-20 minuti ottenendo il siero come surnatante. Per ottenere il plasma invece si deve prelevare il sangue in una provetta contenente un anticoagulante e procedere poi alla centrifugazione a 2000-3000 RPM per 15-20 minuti ottenendo il plasma come surnatante.

19. Il prelievo di sangue.

I prelievi di sangue si distinguono in: prelievo venoso, prelievo arterioso e prelievo capillare. Per il prelievo venoso vengono utilizzate vene superficiali come quelle presenti nella piega interna del gomito ed il sangue viene prelevato con aghi di circa 20 gauge. Il prelievo arterioso presenta maggiori difficoltà e rischi, per questo motivo viene eseguito solo per necessità di emogasanalisi e solitamente il sangue viene prelevato dall’arteria radiale mediante aghi più lunghi e utilizzando siringhe e provette di vetro per mantenere inalterati i livelli di gas disciolti. Il prelievo capillare è meno invasivo e il sangue viene prelevato generalmente facendo un piccolo foro sul polpastrello di un dito della mano e viene utilizzato per emogasanalisi o misurazione per mezzo di strumenti istantanei di vari livelli sanguigni, ad esempio, la misurazione glicemica per individui affetti da diabete.

Diagnostica proteica

20. L’alfa1 antitripsina: caratteristiche e significato diagnostico

L’a1-antitripsina è una glicoproteina monomerica che funge da inibitore dell’elastasi neutrofila, un enzima rilasciato dai neutrofili che causa danni agli alveoli polmonari. Bassi livelli di a1-antitripsina determinano la predisposizione di un soggetto a contrarre danni polmonari; spesso bassi livelli di a1-antitripsina sono causati da mutazioni del gene che codifica per la glicoproteina quindi i soggetti che presentano tale mutazione devono evitare rischi alle vie polmonari come il fumo.

21. Che cosa sono le gammopatie monoclonali?

Le gammopatie monoclonali sono elevate concentrazioni di una gammaglobulina specifica prodotta da un clone plasmacellulare che prolifera in modo incontrollato. L’anticorpo prodotto dalla plasmacellula viene chiamato componente monoclonale e in alcuni casi la gammopatia monoclonale non provoca altro che una presenza anomala di componente monoclonale, mentre in altri casi può scatenare sintomi come il mieloma. L’esame che si esegue per rilevare la presenza di una gammopatia è l’elettroforesi capillare o su gel di agarosio dalla quale si ottiene una netta banda verso la zona gamma che corrisponde all’anomala quantità di gammaglobuline prodotte dal clone plasmacellulare.

22. La proteina C reattiva: caratteristiche e significato diagnostico.

La Proteina C Reattiva è un’alfaglobulina che indica la presenza di infiammazione. È molto simile alle IgG ma non è in grado di riconoscere uno specifico antigene; si lega ad una sostanza poi il complesso viene eliminato dai linfociti. L’analisi della proteina C reattiva non essendo un marker specifico non può essere utilizzata per risalire alla causa dell’infiammazione ma può essere utile per monitorare lo stato di infiammazione.

23. L’aptoglobina: caratteristiche e significato diagnostico.

L’aptoglobina è una proteina formata da due catene pesanti e due catene leggere, si trova nel sangue ed è un antiossidante che si lega alle molecole di emoglobina libere. Bassi livelli di aptoglobina nel sangue sono causati dall’emolisi che causa il rilascio di emoglobina libera a cui si lega l’aptoglobina che verrà smaltita dal fegato recuperando il ferro, generalmente indica la presenza di infiammazioni.

Dislipidemie

24. Quali sono le caratteristiche delle lipoproteine HDL e LDL?

Il compito delle lipoproteine LDL e HDL è quello di trasportare il colesterolo ai vari tessuti. Le LDL immagazzinano il colesterolo e vengono trasportate ai tessuti dove vengono assorbite dalle cellule provviste del recettore specifico per le LDL; se questo recettore è difettoso le LDL in circolo rischiano di accumularsi provocando ipercolesterolemia o finendo intrappolate nelle giunzioni cellulari dove vengono attaccate dai macrofagi formando le placche arteriosclerotiche. Le HDL, invece, immagazzinano il colesterolo libero esterificandolo e lo trasportano al fegato dove viene smaltito il colesterolo e rilasciate le HDL pronte ad immagazzinare altro colesterolo; per questo le HDL vengono definite spazzini del colesterolo.

25. Quali sono le caratteristiche dei chilomicroni delle VLDL?

I chilomicroni sono le lipoproteine più grandi e vengono sintetizzate nell’intestino dove catturano i lipidi provenienti dall’alimentazione per trasportarli ai vari tessuti.