Diagnostica Virologica, 4

Altro sistema molto importante è il rilevamento tramite microscopia elettronica, sia di campioni

citologici che permettono di rilevare in situ il virus stesso, ma anche la visualizzazione dei

campioni. Se questo non contiene una quantità sufficiente di virus, è necessario andare ad

aggiungere anticorpi marcati particolarmente per poter aumentare e verificare l’aggregazione delle

particelle virali, e aumentare quindi la voluminosità delle particelle virali, affinché siano visibili alla

microscopia elettronica. È infatti il sistema di rilevamento degli enterovirus, che vengono rilevati in

grandi quantità a livello della mucosa enterica.

Il colorante va a precipitare intorno al virus stesso

Svantaggi

Prox virus colorato negativamente: Virus della cellula zoster:

Virus dell’influenza marcato con anticorpi:

Possiamo effettuare mediante microscopia elettronica il conteggio delle particelle virali, utilizzando

delle sferette di latex, a concentrazione nota, e quindi per campo andare a contare il numero delle

particelle di latex, e risalire al titolo del virus nel nostro clone. Naturalmente il conteggio è soggetto

ad errore, e può di conseguenza esserci una sovrastima della titolazione titolo virale rispetto alle

particelle virali.

Citologia

La microscopia elettronica può essere utile anche in citologia utilizzando campioni istologici inclusi

in resina e colorati con l’osmio, che risulta essere elettrondenso, per cui avremo le fettine colorate

depositate su griglie per essere attraversate dai fasci di elettroni, e successivamente visualizzate

al microscopio elettronico. Per cui è possibile verificare in situ la presenza di corpi inclusi o

eventualmente particele virli.

Cellule vive

Non tutte possono essere coltivate in uova embrionate di pollo, non tutte possono avere una

sintomatologia chiara visualizzabile negli animali di laboratorio, per cui si tende a verificare, oltre

che la manifestazione della sintomatologia clinica, anche gli eventi di mortalità che si possono

indurre negli animali da laboratorio in base dose infettante.

Naturalmente anche in questo caso, come la visualizzazione mediante microscopia elettronica,

non è una metodica di routine, sia per la difficoltà e il costo della gestione degli animali, ma anche

per l’incapacità ad enumerare e ad indicare le caratteristiche letali dell’animali da laboratorio

proprio per errori nel dosaggio del la quantità di virus, per la virulenza elevata. È quindi un tipo di

sistema per la diagnosi diretta poco utile proprio perché poco pratico.

Un tempo alcuni virus, come il virus del vaiolo, il virus vaccinico, l’herpes, venivano coltivati e

visualizzati sulla membrana corion-allantoidea, oppure nella cavità amniotica per il virus influenzale

e il virus pariotitico, e nella cavità corion allantoidea sempre il virus dell’influenza, e questo per le

preparazione del vaccino, per cui si avevano poi le reazioni di shock anafilattico dovute alle

proprietà immunologiche dovute alle proteine provenienti dal pollo, oppure la Chlamydia e

Rickettsia che vengono coltivate nel sacco vitellino. Di seguito sono riportate le varie vie di

inoculazione: Si utilizzano uova

embrionate di pollo,

relativamente fresche, di

10-12 giorni, quindi uova

presentanti comunque

l’embrione. Si utilizza

questo sistema perché le

uova sembrano essere un

sistema completamente

sterile. Poi in base al tipo di

virus, quindi in base al tipo

di localizzazione, possiamo

avere l’intorbidamento o la

formazione d placche di emolisi, o la formazione di aeree di lisi sulle membrana corion-allantoidea.

Spesso l’isolamento virale si avvale delle colture cellulari in vitro.

Generalmente oggi si lavora su colture di linee continua, perché sono molte le colture e le specie

cellulari da cui sono state prelevate, sia umane che non, quindi di mammifero in generale, che

sono presenti in commercio, e che possono essere facilmente utilizzate e mantenute per sempre

congelate in azoto liquido.

Terreni per colture cellulari

La coltivazione delle cellule si avvale di particolari terreni specie specifici, cioè dipendono dal tipo

di cellule. La costituzione può essere variamente modificata dal tipo di cellula che si desidera

coltivare. Se hanno bisogno di particolari integrazioni, come le vitamine, e generalmente nei terreni

di crescita si mettono antifungini e antibatterici che per mettono alla coltura di persistere nel tempo

e di non essere inquinata nonostante si lavori in condizioni di sterilità. È il caso del DMEM che

viene utilizzato per cellule di origine umana di tipo monocita rio, mentre per quelle della linee del

sangue si utilizza l’RPMI 1640. Generalmente gli antifungini e antibatterici vengono aggiunti

successivamente, cioè all’atto della preparazione e quindi dell’utilizzazione nel processo di

coltivazione, così come il siero fetale bovino, perché quest’ultimo ha un periodo di scadenza più

breve rispetto ai costituendi del terreno base (RPMI 1640, MEM, DMEM). L’antibiotico che ha

un’emivita più breve così come l’antifungino e il siero fetale sono aggiunti successivamente.

Nel terreno vi è anche un indicatore di pH, infatti è possibile vedere come l’indicatore di pH per

l’acidificazione del terreno, in base al metabolismo cellulare, diventa da rosso arancio color giallo.

Gli incubatori devono avere dal 5 al 10% di anidride carbonica, quindi sono incubatori che

presentano un’atmosfera condizionata, proprio per ridurre la concentrazione di ossigeno. Questo è

chiaro perché, seppur si utilizzano cellule in linea continua (che significa immortalizzate), sono

comunque cellule espiantate da organo, dove la tensione di ossigeno è ridotta o completamente

assente. Le cellule generalmente vengono coltivate in terreni liquidi ad una temperatura di 37°C,

soltanto in situazioni occasionali, è possibili addensare i terreni, rallentando in questo modo

l’escape del virus e quindi la diffusione alle cellule contigue, determinando, in base alle esigenze,

l’evento di diffusione, la crescita virale. Gli incubatori, per questo motivo devono presentare

condizioni particolari, e sono presenti anche delle vaschette contenenti acqua distillata, e filtrata, la

cui evaporazione mantiene l’ambiente più o meno umido.

Per i saggi che si desiderano fare, come saggi di diagnosi, o per la conta, si utilizzano piastre che

possono contenere 6 o 12x3 pozzetti, possono avere un numero di pozzetti vario. Le linee cellulari

non sempre, siano esse linee immortalizzate, o primo o di secondo espianto, aderiscono alla

superficie cellulare, cioè che crescono in monostrato, ma possono essere cellule che crescono

crescere nel surnatante, per cui quando la cellula aderisce al fondo e aderiscono tra loro creando il

monostrato si ha un aspetto, quando invece si hanno cellule che normalmente vivono nel

surnatante e non aderiscono, ma precipitano, al microscopio (con un 40x) appaiono molto

rifrangenti, cioè molto luminose e in sospensione, visione che si ha nel momento in cui si va ad

inoculare la flac o il pozzetto quando si vogliono coltivare le cellule che andranno a formare il

monostrato (si immettono separate, dopo di che precipiteranno sul fondo del pozzetto, andranno a

formare uno strato riproducendosi, e aderendo strettamente alla superficie, per quanto riguarda

quelle in monostrato; per quelle in sospensione si moltiplicheranno semplicemente nel surnatante).

Per cui è chiaro che nel momento in cui le cellule avranno ricoperto l’intera superficie, tenderanno

poi a morire non avendo più superficie su cui aderire, perché non sono cellule che formano più

strati, ma solo un monostrato. Le cellule in sospensione invece creeranno una torbidità tale e poi

osservando al microscopio si osserva che se il terreno è insufficiente, e quindi c’è un aumento

eccessivo del numero di cellule, inizieranno a creare lisati, ovvero tutta una serie di degradazioni

soprattutto di monociti, che son tutte caratteristiche di un sovraffollamento.

Ha ripreso la slide 24

Chiaramente in seguito all’utilizzo di una serie di materiali e attrezzature che devono essere

necessariamente presenti in un laboratorio quando si lavora con colture cellulari, perché

nonostante si utilizzano antibiotici e antifungini, la manualità deve essere svolta in condizioni di

sterilità. A tal proposito è quindi necessarie lavorare in cappe a flusso laminare. È importante

anche che la cappa a flusso laminare utilizzata per il passaggio delle cellule sia completamente

sterile indipendentemente dal tipo di patogeno, sia esso virale che batterico, e quindi dedicato

essenzialmente alle cellule, perché questo significherebbe altrimenti, per qualsiasi motivo, per

quanto l’operatore sia esperto, per quanto possa lavorare in maniera corretta, ci potrebbero

essere inquinamenti, e ritrovarsi di conseguenza in situazioni indefinibili. È inoltre necessario in un

laboratorio di virologia, che la cappa per i passaggi virali sia unica, ed anche l’ambiente debba

essere esclusivamente dedicato (così come nel laboratorio di virologia), oltre che poi individuare

laboratori in base alla patogenicità del virus.

Si ha prima la digestione, quindi rottura meccanica del prelievo effettuato, e poi la separazione

mediante tripsinizzazione delle cellule del terreno. Le cellule vengono sospese in terreno liquido e

inserite in una fiasca, dove poi andranno ad aderire in quanto il materiale delle piastre stimola

l’adesione delle cellule. Questo quando le cellule in vivo sono capaci di crescere in monostrato.

Le cellule così separate saranno utilizzate per formare l coltura pimaria.

Le cellule sono isolate da espianti tumorali, di organo con tumore, m in realtà oggi le cellule sono

tutte manipolate geneticamente, e persistono immortalizzate se congelate per periodi vari, e poi si

scongelano i vari stock. Dall’apcc si ordina un clone cellulare, o una certa concentrazione di

cellule, il clone si scongela lentamente (da -90 a 37°C). la cellula dopo congelamento è una cellula

molto delicata, per questo si scongela molto lentamente, per evitare di lisare la cellula.

DMSO serve per bloccare la cellula stessa nello stato di quiescenza.

Lo scongelamento lento serve anche per evitare l’effetto tossico.

Queste sono le cellule Vero, estratte da scimmie. Sono le prime cellule che dopo inoculazione

hanno aderito alla superficie del pozzetto. Poi man mano che si replicano tendono a riempire tutta

la superficie.

Le cellule HeLa sono invece cellule più grandi. La sigla deriva da nome e cognome di

un’americana che nel 1920 (?) ha presentato il tumore alla cervice uterina. Nell’espianto del

tumore il chirurgo conservò una porzione d