Diagnostica Virologica, 4

Microbiologia e Virologia (Dott.ssa D’isanto)

Lezione 18

4 Dic 2014

DIAGNOSTICA VIROLOGICA

Finora è stata vista la patogenesi. Naturalmente ci troviamo di fronte a microrganismi che sono dei

parassiti endocellulari obbligati. Quindi nel caso dei microrganismi come i batteri, non essendo

endocellulari obbligati, era possibile mettere in atto una serie di tecniche per il rilevamento diretto,

molto più semplici, o comunque che permettevano una manipolazione meno legata all’esperienza,

e soprattutto meno pericolosa, quindi più facilmente gestibile. Nel caso dei virus, ci si trova di

fronte a microrganismi che richiedono approcci differenti, ed è possibile suddividerli in: metodi che

rientrano nella ricerca diretta, dove per ricerca diretta noi non andiamo soltanto a voler indicare

l’isolamento del virus in se, ma anche la ricerca suoi costituenti, e un approccio indiretto, diretto

alla ricerca degli anticorpi determinati dalla replicazione del virus stesso, quindi verso antigeni virus

specifici, o anticorpi presenti nel siero.

Naturalmente l’uno non esclude l’altro, e soprattutto l’uno può essere più o meno precoce all’altro a

seconda del tipo di virus, tenendo quindi conto che essendo endoparassiti obbligati, è chiaro che il

rilevamento diretto è particolarmente difficile, e non sempre può avvenire. Non tutti i virus sono

coltivabili in vitro.

Raccolta del campione

Devo avere una valutazione presunta di quella che può essere una diagnosi, quindi partendo da

un’anamnesi, e normalizzare la diagnosi nel tempo e nello spazio (perché bisogna tener conto

della stagione, ma anche dello spazio, e di conseguenza degli approcci che l’individuo ha avuto

con altri individui). Quindi il campione varierà a seconda del presunto virus da ricercare e la tecnica

che si utilizzerà varierà in base al tipo di infezione e di campione.

Le scelta del campione idoneo per l’isolamento è piuttosto difficile.

Il trasporto in ghiaccio è importante per preservare le strutture antigeniche, perché tali strutture

sono le stesse molecole che permettono al virus di interagire con i recettori cellulari. Quindi se tali

strutture sono distrutte il virus sarà deficiente nella capacità di interagire e di aderire. Per cui è

importante il campione, ma anche la temperatura. Infatti molto spesso, il virus al congelamento ed

allo scongelamento, possono presentare una perdita di attività, pertanto il virus diventa incapace di

aderire e penetrare. Si ha quindi un campione la cui carica può essere ridotta, ma soprattutto da

cui non è possibile isolare virus. È quindi importante partire da un obiettivo ben definito per poter

partire nel migliore dei modi già con la raccolta del campione, essendo i virus molto più labili dei

batteri (sono quindi più difficili da coltivare e da conservare).

Di seguito sono riportati i campioni e le specie virali da cui è possibile rilevare la loro presenza,

naturalmente variano in base alla patologia, e chiaramente al sistema di rilascio, di diffusione dei

virus nell’ambiente esterno, e specie specifica. Bisogna quindi tener conto qual è la patogenesi,

qual è la replicazione, e come viene rilasciato per poter, una volta associato il virus alla

sintomatologia o alla presunta situazione dell’individuo da cui raccogliamo il materiale, individuare

un campione adatto.

Coltivazione dei virus

Abbiamo già precedentemente suddiviso virus in virus animali, vegetali e batteriofagi; nel virus,

quindi, essendo un endocellulare obbligato, il sistema di rilevamento diretto del virus consiste nel

prendere il materiale, che si presume contenga il virus, e nell’inocularlo infettando una coltura

cellulare, o comunque delle cellule sensibili e permissive, che consentano la crescita del virus, e

andare poi a verificare se c’è stata crescita virale, valutando quindi una serie di caratteristiche

specifiche.

Per cui i farmaci avranno come coltura cellulare i batteri, i virus animali le cellule animali in coltura,

ma anche gli animali da laboratorio o le uova embrionale, i virus vegetali avranno le cellule

vegetaloi come substrato per la crescita.

Naturalmente quando si parla di isolamento virale, e si vuole appalesare la crescita virale (poi

ovviamente si deve procedere ad eventuali tipizzazioni del virus stesso), è chiaro che è

particolarmente difficile, perché riuscire a coltivare un virus, quando è possibile, può essere anche

impossibile per alcuni virus, ed inoltre i tempi sono particolarmente lunghi. Per cui è chiaro che le

situazioni di richiesta di diagnosi repentina è difficile usare questo sistema di rilevamento (impianto

e coltivazione su cellule sensibili e in animali sensibili) per poter fare diagnosi. Esistono pertanto

pro e contro nell’utilizzo di questa metodica:

Coltivazione di batteriofagi

Coltivare un batteriofago significa inoculare ad una certa concentrazione o un brodo contenente

microrganismi, batteri specifici o un agar su cui è presente il batterio, e quindi è stato fatto

crescere il batterio come patina, dopo di che si versa la sospensione virale agarizzata, per poter

vedere come la crescita virale possa creare delle aree chiare nella patina batterica su piastra, in

seguito a lisi cellulare. Nel caso invece di brodo contenente i batteri sarà un brodo torbido, e nel

momento in cui si inocula il virus, e questo inizia la replicazione, si avrà una chiarificazione della

torbidità della coltura stessa.

L’esame citologico di campioni prelevati, perm