Diagnostica Virologica, 4

Microbiologia e virologia (Dott.ssa D’Isanto) lezione 184

4 Dicembre 2014

Diagnostica virologica

Finora è stata vista la patogenesi. Naturalmente ci troviamo di fronte a microrganismi che sono dei parassiti endocellulari obbligati. Quindi nel caso dei microrganismi come i batteri, non essendo endocellulari obbligati, era possibile mettere in atto una serie di tecniche per il rilevamento diretto, molto più semplici, o comunque che permettevano una manipolazione meno legata all’esperienza, e soprattutto meno pericolosa, quindi più facilmente gestibile.

Nel caso dei virus, ci si trova di fronte a microrganismi che richiedono approcci differenti, ed è possibile suddividerli in: metodi che rientrano nella ricerca diretta, dove per ricerca diretta noi non andiamo soltanto a voler indicare l’isolamento del virus in sé, ma anche la ricerca suoi costituenti, e un approccio indiretto, diretto alla ricerca degli anticorpi determinati dalla replicazione del virus stesso, quindi verso antigeni virus specifici, o anticorpi presenti nel siero.

Naturalmente l’uno non esclude l’altro, e soprattutto l’uno può essere più o meno precoce all’altro a seconda del tipo di virus, tenendo quindi conto che essendo endoparassiti obbligati, è chiaro che il rilevamento diretto è particolarmente difficile, e non sempre può avvenire. Non tutti i virus sono coltivabili in vitro.

Raccolta del campione

Devo avere una valutazione presunta di quella che può essere una diagnosi, quindi partendo da un’anamnesi, e normalizzare la diagnosi nel tempo e nello spazio (perché bisogna tener conto della stagione, ma anche dello spazio, e di conseguenza degli approcci che l’individuo ha avuto con altri individui). Quindi il campione varierà a seconda del presunto virus da ricercare e la tecnica che si utilizzerà varierà in base al tipo di infezione e di campione.

Le scelta del campione idoneo per l’isolamento è piuttosto difficile. Il trasporto in ghiaccio è importante per preservare le strutture antigeniche, perché tali strutture sono le stesse molecole che permettono al virus di interagire con i recettori cellulari. Quindi se tali strutture sono distrutte il virus sarà deficiente nella capacità di interagire e di aderire. Per cui è importante il campione, ma anche la temperatura.

Infatti molto spesso, il virus al congelamento e allo scongelamento, possono presentare una perdita di attività, pertanto il virus diventa incapace di aderire e penetrare. Si ha quindi un campione la cui carica può essere ridotta, ma soprattutto da cui non è possibile isolare virus. È quindi importante partire da un obiettivo ben definito per poter partire nel migliore dei modi già con la raccolta del campione, essendo i virus molto più labili dei batteri (sono quindi più difficili da coltivare e da conservare).

Di seguito sono riportati i campioni e le specie virali da cui è possibile rilevare la loro presenza, naturalmente variano in base alla patologia, e chiaramente al sistema di rilascio, di diffusione dei virus nell’ambiente esterno, e specie specifica. Bisogna quindi tener conto qual è la patogenesi, qual è la replicazione, e come viene rilasciato per poter, una volta associato il virus alla sintomatologia o alla presunta situazione dell’individuo da cui raccogliamo il materiale, individuare un campione adatto.

Coltivazione dei virus

Abbiamo già precedentemente suddiviso virus in virus animali, vegetali e batteriofagi; nel virus, quindi, essendo un endocellulare obbligato, il sistema di rilevamento diretto del virus consiste nel prendere il materiale, che si presume contenga il virus, e nell’inocularlo infettando una cultura cellulare, o comunque delle cellule sensibili e permissive, che consentano la crescita del virus, e andare poi a verificare se c’è stata crescita virale, valutando quindi una serie di caratteristiche specifiche.

Per cui i farmaci avranno come coltura cellulare i batteri, i virus animali le cellule animali in coltura, ma anche gli animali da laboratorio o le uova embrionale, i virus vegetali avranno le cellule vegetali come substrato per la crescita.

Naturalmente quando si parla di isolamento virale, e si vuole appalesare la crescita virale (poi ovviamente si deve procedere ad eventuali tipizzazioni del virus stesso), è chiaro che è particolarmente difficile, perché riuscire a coltivare un virus, quando è possibile, può essere anche impossibile per alcuni virus, ed inoltre i tempi sono particolarmente lunghi. Per cui è chiaro che le situazioni di richiesta di diagnosi repentina è difficile usare questo sistema di rilevamento (impianto e coltivazione su cellule sensibili e in animali sensibili) per poter fare diagnosi.

Esistono pertanto pro e contro nell’utilizzo di questa metodica:

Coltivazione di batteriofagi

Coltivare un batteriofago significa inoculare ad una certa concentrazione o un brodo contenente microrganismi, batteri specifici o un agar su cui è presente il batterio, e quindi è stato fatto crescere il batterio come patina, dopo di che si versa la sospensione virale agarizzata, per poter vedere come la crescita virale possa creare delle aree chiare nella patina batterica su piastra, in seguito a lisi cellulare. Nel caso invece di brodo contenente i batteri sarà un brodo torbido, e nel momento in cui si inocula il virus, e questo inizia la replicazione, si avrà una chiarificazione della torbidità della coltura stessa.

L’esame citologico di campioni prelevati, permet...