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DNA.3. Comprehensive resistance
Sono quei meccanismi a valle del target, ovvero quando abbiamo mutazioni di oncosoppressori o espressioni alte di oncogeni quasi tutti gli agenti citotossici risultano inefficienti. Importante è anche tutte le tecniche laboratoristiche in vitro per determinare la citotossicità di un farmaco, per esempio mediante lo studio della vitalità cellulare in cui si usa il trypan blu. Le cellule che si colorano intensamente in azzurro scuro, visibile al microscopio, sono le cellule morte che hanno la membrana danneggiata che fa entrare il farmaco dentro le cellule. Altro mezzo che sfrutta la vitalità cellulare è anche la capacità di andare a contare e vedere il numero delle CFU ovvero le unità formanti colonie, quindi piantando un piccolo numero di cellule per esempio in terreno di agar, avendo in mente quello che può essere il risultato della citotossicità attesa è possibile creare una.
curva dose risposta rispetto a un trattamento con farmaco antitumorale che è stato dato da concentrazione 0 o molto bassa fino a concentrazioni alte creando quindi una relazione tra CFU e dose del farmaco. Altri due test spesso molto usati che sfruttano la vitalità cellulare sono due metodi metabolici, di cui uno osserva la conversione di Salidi tetrazolio dove è data tale conversione da ossidoreduttasi cellulari, quindi la possono fare soltanto cellule che agiscono in questo senso perché vive e questo è quindi un modo per vedere se la cellula è metabolicamente attiva o meno. Altro metodo di valutare il metabolismo è invece quello di vedere in una condizione di chemiluminescenza la quantità di ATP dentro la cellula, per cui se è piena di ATP allora è viva, ma se è scarsa e povera invece è perché è stata colpita dal citotossico. Ma il metodo usato più di tutti (che non è in| La colorazione delle colture post-esposizione con la sulforodamina B |
| La sulforodamina B è un ligando delle proteine colorato che ci dà una quantità nel pozzetto che coloriamo di proteine presenti. Quindi, dove le cellule crescono ci saranno molte più proteine, mentre dove le cellule non crescono o muoiono invece non ci saranno o ci saranno molto meno proteine. |
| Ora, tutto questo lo facciamo molto bene con linee cellulari murine e umane stabilizzate, ovvero immortalizzate e che crescono perennemente in vitro. Oppure possiamo farlo anche in cellule ottenute da espianti tumorali che chiamiamo colture primarie. |
| E spesso l'impianto di cellule tumorali umane espiantate dal paziente e impiantate nell'animale sperimentale ci fanno fare test di chemiosensibilità specifici per il tumore clinico del paziente specifico. |
| Facciamo allora adesso un esempio di resistenza acquisita in una linea cellulare tumorale di adenocarcinoma ovarico umano con esposizione |
In questo caso stiamo analizzando la sensibilità delle cellule tumorali al cisplatino. Confrontiamo due linee cellulari: una che ha una sensibilità di base al cisplatino (la linea nera) e l'altra che è stata ottenuta tramite esposizione continua al cisplatino (la linea rossa).
La linea nera ha una concentrazione minima inibente al 50% (MCI50) di 1,68µM, che indica una buona sensibilità al farmaco. D'altra parte, la linea rossa ha una concentrazione inibente al 50% di 20,6µM, un valore molto alto, indicativo di una resistenza al cisplatino. Quindi, c'è un rapporto di sensibilità-resistenza di circa 10 volte tra le due linee.
Tuttavia, è importante considerare quanto di questo screening di sensibilità-resistenza sia valido per lo screening clinico. Per rispondere a questa domanda, ci sono degli strumenti che possono aiutarci.
di tipofarmacologico e scegliendo il farmaco che da maggiore risultato questo viene impiegato poi anche nel singolo paziente. Questo tipo di test è di sicuropiù rapido del SRCA e permette nel giro di 2/3 settimane i risultati del test e usarlo anche nel trattamento del singolo paziente da cui derivano quellecellule. Altro test simile nell'ambito delle HTCA è quello in cui queste colture primarie di cellule ottenute come nella HTCA sono messi in microcapillariche sono a loro volta posti in un mezzo di coltura adatto alla crescita per quelle cellule che si stanno usando. Anche in questo caso poi si ha correlazionetra risultato del test sperimentale e utilizzo clinico. Altro test è il DiSC assay (Differential staining cytotoxicity assay) che si basa sulla colorazionedifferenziale della citotossicità, ovvero delle cellule tumorali esposte a citotossici, infatti abbiamo visto che ci sono coloranti come la sulforodamina Bche si lega alle proteine
Dando misura indiretta del numero di cellule contenute nel pozzetto, quindi più proteine più cellule e invece meno proteine meno cellule. Quindi posso misurare le cellule id base che non hanno mai visto un farmaco e poi misurare quelle cellule sottoposte invece al farmacocitotossico. Quindi sono cellule trattate in vitro in presenza di concentrazioni variabili al farmaco per un numero variabile di giorni (in tabella si fa riferimento a un trattamento di 6 giorni), dopodiché le cellule vengono a essere colorate e l'entità della colorazione si legge attraverso un lettore di intensità luminosa per individuare la quantità di colorazione residua post-trattamento e quantificando così l'azione citotossica. Con questa selezione quindi dei farmaci in vitro dal più citotossico al meno citotossico viene poi scelto quel farmaco col risultato migliore, somministrandolo al paziente e facendo le correlazioni con i test in vitro appena fatti.
- 10 - Altri metodi usati (tabella di sotto tra le due qua sopra) per valutare la citotossicità sono quelli basati sull’uso del metil tiazolil difenil tetrazoliobromidio, ovvero il MTT, che colora le cellule vitali e non quelle morte sfruttando infatti il metabolismo. Allo stesso modo in chemiluminescenza possomisurare e quantificare l’ATP misurando quante cellule sono rimaste vive. E questo è stato usato nel carcinoma ovarico con buoni iniziali risultati, tanto che sono stati valutati sulla base per cui il medico da una parte sceglie il farmaco migliore secondo la letteratura somministrandolo a una certacoorte di pazienti e poi a una seconda coorte il farmaco migliore secondo i test dell’ATP, ottenendo quindi un certo leggermente più favorevole nellariduzione di massa tumorale e sopravvivenza senza progressione per il farmaco scelto dal test e non dalla letteratura. Tuttavia non essendo stati poirisultati statisticamente significativi questo test
alla fine è fallito. Caso analogo è anche un altro test che invece è l'EDR assay (Extreme Drug Resistance assay) che è diverso da quelli appena visti, si basa infatti sull'andare a somministrare un precursore radiomarcato del DNA in colture primarie ottenute da pazienti e valutazioni dell'effetto che si ricava nell'usare la concentrazione plasmatica massima di vari farmaci, andando quindi a avere corrispondenza tra l'aspetto clinico, quindi la concentrazione massima plasmatica e la dose usata in vitro per cercare di stoppare l'incorporazione del radionuclide. Vedendo un esempio il precursore radiomarcato è l'uridina triziata (H -uridina) e la validità del test si esprime prendendo in considerazione la media dell'inibizione dell'incorporazione del precursore radiomarcato, e si vede che nelle ordinate si va da 0 in alto a 100 in basso come percentuale di inibizione di incorporazione. E si valutanovari tipi di tumore, dove i risultati sono disposti in funzione del risultato di inibizione dell'uridina triziata ottenuta. Quindi si va da 0 a valori vicini anche a 100, ma la cosa interessante nella ripartizione nei 4 rettangoli è il match clinico dato dalla linea in mezzo al grafico che divide a sinistra i casi che hanno avuto una progressione clinica, a destra quelli con remissione. Allora vediamo una cosa precisa, ovvero che è vero che l
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