Diagnostica Molecolare - introduzione

La Diagnostica Molecolare in Medicina

La diagnostica molecolare in medicina è concentrata molto sull'aspetto delle analisi mutazionali, cioè della ricerca di mutazioni in geni che causano una malattia (malattie monogeniche) e in geni che predispongono ad alcune malattie (malattie multigeniche e multifattoriali). Per questo oggi parleremo dell'approccio allo screening mutazionale più usato al momento.

Premessa. Quando parliamo di diagnosi molecolare a livello di acidi nucleici è necessario precisare che per poterla eseguire bisogna conoscere tutta la sequenza (a livello genomico e/o di mRNA) del gene che si vuole analizzare.

La ricerca di mutazioni si può eseguire sia sul DNA genomico estratto da cellule nucleate che in genere sono i globuli bianchi ottenuti da un prelievo di sangue periferico in anticoagulante quali EDTA e ACD sia sull'RNA messaggero (singola elica) dopo trattamento con trascrittasi inversa, l'enzima che permette di formare il

struttura del DNA/cDNA da amplificare e la progettazione di specifici primer che si legano alle estremità del tratto di interesse. La PCR viene eseguita in cicli termici ripetuti, durante i quali il DNA/cDNA viene denaturato, annealato ai primer e allungato dalla DNA polimerasi. Questo processo permette di ottenere una quantità sufficiente di DNA/cDNA amplificato per l'analisi successiva. c) Analisi di eteroduplex sui singoli frammenti amplificati L'analisi di eteroduplex viene utilizzata per identificare eventuali mutazioni o variazioni nella sequenza del DNA/cDNA amplificato. Questa tecnica si basa sulla formazione di strutture a doppia elica tra il DNA/cDNA amplificato e un filamento complementare marcato con una sonda fluorescente. La presenza di mutazioni o variazioni nella sequenza del DNA/cDNA può essere rilevata tramite l'analisi dei pattern di fluorescenza. d) Sequenziamento diretto dei frammenti eteroduplex Il sequenziamento diretto dei frammenti eteroduplex permette di determinare la sequenza nucleotidica del DNA/cDNA amplificato. Questa tecnica si basa sulla sintesi del DNA in presenza di dNTPs marcati con fluorofori e di un terminatore di catena. Durante la sintesi del DNA, il terminatore di catena viene incorporato in modo casuale, generando frammenti di diverse lunghezze. L'analisi dei frammenti generati permette di determinare la sequenza nucleotidica del DNA/cDNA amplificato. In conclusione, l'approccio tecnico-diagnostico per l'analisi del cDNA comprende l'estrazione del DNA/cDNA, l'amplificazione mediante PCR, l'analisi di eteroduplex e il sequenziamento diretto dei frammenti eteroduplex. Queste tecniche permettono di ottenere informazioni dettagliate sulla sequenza nucleotidica del cDNA e di identificare eventuali mutazioni o variazioni nella sequenza.

sequenza del gene o del cDNA: A partire dalla sequenza nota si scelgono coppie di oligonucleotidi della lunghezza di 18-20 nts. Un oligo sarà complementare all'elica 5'->3' e l'altro all'elica 3'->5', fiancheggianti il tratto di DNA/cDNA che si vuole amplificare. In una provetta vengono posti ng di DNA/cDNA, la coppia di oligonucleotidi selezionata, i 4 dNTPs, l'enzima Taq polimerasi che permette, a partire da una singola elica appaiata all'oligonucleotide complementare, di aggiungere i vari nucleotidi complementari a quelli posizionati sull'elica stampo fino a formare una doppia elica. La tecnica si suddivide in tre tempi.

a) Denaturazione della doppia elica ad una temperatura tra i 94°C ed i 98°C.

b) Appaiamento dei due oligonucleotidi alle singole eliche complementari ad una temperatura variabile tra i 50°C ed i 68°C.

c) Allungamento e formazione dell'elica complementare a partire dall'oligonucleotide.

Appaiato che fa da punto di innesco ad una temperatura tra i 70°C ed i 72°C. Questo ciclo costituito di 3 tempi viene ripetuto un numero di volte variabile tra le 30 e le 40 e ad ogni ciclo il numero di molecole aumenta in maniera esponenziale. Alla fine dei cicli le molecole rappresentanti quel tratto di DNA saranno visibili mediante colorazione con etidio bromuro, un colorante che si lega al DNA e ne permette la visualizzazione mediante esposizione a raggi U,V.