Diagnostica Molecolare - introduzione

La diagnostica molecolare in medicina

La diagnostica molecolare in medicina è concentrata molto sull'aspetto delle analisi mutazionali, cioè della ricerca di mutazioni in geni che causano una malattia (malattie monogeniche) e in geni che predispongono ad alcune malattie (malattie multigeniche e multifattoriali). Per questo oggi parleremo dell'approccio allo screening mutazionale più usato al momento.

Premessa

Quando parliamo di diagnosi molecolare a livello di acidi nucleici è necessario precisare che per poterla eseguire bisogna conoscere tutta la sequenza (a livello genomico e/o di mRNA) del gene che si vuole analizzare.

La ricerca di mutazioni si può eseguire sia sul DNA genomico estratto da cellule nucleate che in genere sono i globuli bianchi ottenuti da un prelievo di sangue periferico in anticoagulanti quali EDTA e ACD sia sull'RNA messaggero (singola elica) dopo trattamento con trascrittasi inversa, l'enzima che permette di formare il cDNA (mRNA a doppia elica). L'RNA messaggero bisogna però che venga estratto dalle cellule o dai tessuti che lo esprimono in quantità sufficientemente elevata.

Approccio tecnico-diagnostico

L'approccio tecnico-diagnostico consiste nella:

• Estrazione del DNA o RNA
• Amplificazione di tratti di DNA o cDNA mediante tecnica PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Analisi di eteroduplex sui singoli frammenti amplificati
• Sequenziamento diretto dei frammenti eteroduplex

Estrazione del DNA o dell'RNA

L'estrazione del DNA o dell'RNA si esegue ormai con kit già preconfezionati che permettono di eseguire l'estrazione in poche ore sia su grandi volumi (10-20 ml) sia su piccoli volumi (100-1000 µl).

Amplificazione di tratti di DNA o cDNA mediante tecnica PCR

Questa tecnica permette di amplificare il numero di molecole corrispondenti al tratto di DNA/cDNA che si vuole analizzare fino a un milione di volte. Per poter essere usata richiede la conoscenza della sequenza del gene o del cDNA.

A partire dalla sequenza nota si scelgono coppie di oligonucleotidi della lunghezza di 18-20 nts, un oligo sarà complementare all'elica 5'->3' e l'altro all'elica 3'->5', fiancheggianti il tratto di DNA/cDNA che si vuole amplificare. In una provetta vengono posti ng di DNA/cDNA, la coppia di oligonucleotidi selezionata, i 4 dNTPs, l'enzima Taq polimerasi che permette, a partire da una singola elica appaiata all'oligonucleotide complementare, di aggiungere i vari nucleotidi complementari a quelli posizionati sull'elica stampo fino a formare una doppia elica.

La tecnica si suddivide in tre tempi:

• Denaturazione della doppia elica ad una temperatura tra i 94°C ed i 98°C