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Diagnostica Molecolare - introduzione Appunti scolastici Premium

Appunti introduttivi di Metodologia Clinica del prof. Nassi sulla Diagnostica Molecolare: analisi mutazionali, malattie monogeniche, malattie multigeniche e multifattoriali, diagnosi molecolare, ricerca di mutazioni, DNA genomico, RNA messaggero, Analisi di eteroduplex.

Esame di Metodologia Clinica docente Prof. A. Nassi

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La Diagnostica Molecolare in Medicina

La diagnostica molecolare in medicina e' concentrata molto sull'aspetto delle analisi mutazionali,

cioè della ricerca di mutazioni in geni che causano una malattia (malattie monogeniche) e in geni

che predispongono ad alcune malattie (malattie multigeniche e multifattoriali). Per questo oggi

parleremo dell'approccio allo screening mutazionale più usato al momento.

Premessa. Quando parliamo di diagnosi molecolare a livello di acidi nucleici e' necessario precisare

che per poterla eseguire bisogna conoscere tutta la sequenza (a livello genomico e/o di mRNA) del

gene che si vuole analizzare.

La ricerca di mutazioni si può eseguire sia sul DNA genomico estratto da cellule nucleate che in

genere sono i globuli bianchi ottenuti da un prelievo di sangue periferico in anticoagulante quali

EDTA e ACD sia sull'RNA messaggero (singola elica) dopo trattamento con trascrittasi inversa,

l'enzima che permette di formare il cDNA (mRNA a doppia elica). L'RNA messaggero bisogna

pero' che venga estratto dalle cellule o dai tessuti che lo esprimono in quantita' sufficientemente

elevata.

L'approccio tecnico-diagnostico consiste nella

a) Estrazione del DNA o RNA

b) Amplificazione di tratti di DNA o cDNA mediante tecnica PCR (Polymerase Chain Reaction)

c) Analisi di eteroduplex sui singoli frammenti amplificati

d) Sequenziamento diretto dei frammenti eteroduplex

a) Estrazione del DNA o dell'RNA

L'estrazione dl DNA o dell'RNA si esegue ormai con kit gia' preconfezionati che permettono di

eseguire l'estrazione in poche ore sia su grandi volumi (10-20 ml) sia su piccoli volumi (100-1000

l)

b) Amplificazione di tratti di DNA o cDNA mediante tecnica PCR (Polymerase Chain Reaction)

Questa tecnica permette di amplificare il numero di molecole corrispondenti al tratto di

DNA/cDNA che si vuole analizzare fino ad un milione di volte. Per poter essere usata richiede la

conoscenza della sequenza del gene o del cDNA

A partire dalla sequenza nota si scelgono coppie di oligonucleotidi della lunghezza di 18-20 nts, un

oligo sara' complementare all'elica 5'->3' e l'altro all'elica 3'->5', fiancheggianti il tratto di

DNA/cDNA che si vuole amplificare. In una provetta vengono posti ng di DNA/cDNA, la coppia di

oligonucleotidi selezionata, i 4 dNTPs, l'enzima Taq polimerasi che permette, a partire da una

singola elica appaiata all'oligonucleotide complementare, di aggiungere i vari nucleotidi

complementari a quelli posizionati sull'elica stampo fino a formare una doppia elica.

La tecnica si suddivide in tre tempi.

a) Denaturazione della doppia elica ad una temperatura tra i 94°C ed i 98°C.

b) Appaiamento dei due oligonucleotidi alle singole eliche complementari ad una temperatura

variabile tra i 50°C ed i 68°C.

c) Allungamento e formazione dell'elica complementare a partire dall'oligonucleotide appaiato che

fa da punto di innesco ad una temperatura tra i 70°C ed i 72°C.

Questo ciclo costituito di 3 tempi viene ripetuto un numero di volte variabile tra le 30 e le 40 e ad

ogni ciclo il numero di molecole aumenta in maniera esponenziale. Alla fine dei cicli le molecole

rappresentanti quel tratto di DNA saranno visibili mediante colorazione con etidio bromuro, un

colorante che si lega al DNA e ne permette la visualizzazione mediante esposizione a raggi U,V,.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico - durata 6 anni)
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher valeria0186 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodologia Clinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Nassi Antonio.

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