Diagnostica molecolare

Diagnostica molecolare

La diagnostica molecolare costituisce un metodo altamente specifico, largamente impiegato nel laboratorio di microbiologia clinica, per il riconoscimento dell’agente patogeno e implica l’identificazione del DNA o RNA microbico in un campione di materiale del paziente. La strategia di base consiste nell’individuare una sequenza relativamente breve di basi nucleotidiche del DNA o dell’RNA (sequenza bersaglio) contenente sequenze uniche, specifiche, di quell’agente patogeno. Ciò si ottiene tramite ibridazione con una sequenza di basi complementare, usata come sonda.

Nei batteri le sequenze di DNA che codificano per le sequenze dell’RNA ribosomiale 16S (rRNA) sono comunemente utilizzate come bersaglio, in quanto ogni microrganismo contiene molteplici copie del proprio specifico gene per l’rRNA, e ciò incrementa la sensibilità del saggio. I metodi per l’individuazione del DNA o dell’RNA microbici sono classificati in due categorie: l’ibridazione diretta e i metodi di amplificazione che usano la reazione a catena della polimerasi (PCR), o una delle sue varianti.

Metodi di ibridazione diretta

Questi metodi usano prevalentemente sonde geniche, ovvero frammenti di DNA a catena singola, in genere marcati con un enzima, oppure con una molecola fluorescente o un marcatore radioattivo. La sequenza nucleotidica della sonda è complementare al DNA (o RNA) bersaglio; per ottenere il DNA bersaglio, si coltiva in coltura un idoneo campione infetto del paziente al fine di incrementare il numero dei microrganismi che si presume siano gli agenti causali della malattia.

Successivamente la coltura viene trattata in modo che i microrganismi subiscano una lisi che consente il rilascio del DNA bersaglio. Il DNA a filamento singolo, prodotto dalla denaturazione alcalina del DNA a doppio filamento, in primo luogo viene fissato a un supporto solido come una membrana di nitrocellulosa. In tal modo i filamenti immobilizzati del DNA sono disponibili per l’ibridazione alla sonda marcata, specifica per il microrganismo. La sonda non legata è rimossa mediante lavaggio del filtro, quindi si procede a misurare l’entità dell’ibridazione mediante la sonda marcata trattenuta sul filtro.

Va ricordato che sono disponibili anche sonde proteiche (di anticorpi monoclonali).