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Separazione e purificazione degli acidi nucleici
Dopo la centrifugazione si ottengono tre fasi:
- La fase superiore contiene la soluzione di acidi nucleici
- La fase di interfase contiene proteine denaturate
- La fase inferiore fenolica contiene lipidi e proteine ricche di amminoacidi idrofobici
È possibile fare una seconda centrifugazione a pH acido (etanolo + acetato di sodio) per separare il DNA dall'RNA. In questo caso, il DNA forma un pellet nella fase inferiore che può essere prelevato e rimesso in soluzione.
Per il recupero degli acidi nucleici dalla fase idrofilica, si procede con la purificazione degli stessi.
Per capire la purezza del campione, si utilizza il metodo spettrofotometrico:
- È necessario 1 ml di soluzione
- Gli acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo alla lunghezza d'onda di 260 nm
- Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, ed è caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell'RNA
- Se il picco di assorbimento è sul 260 nm, allora il campione è puro
picco è spostato il campione non è puro (es. 280 nm = proteine / 230 nm = zuccheri e metaboliti secondari)- Ovviamente qualche contaminazione ci potrà essere quindi :
i. Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della preparazione degli acidi nucleici. Preparazioni pure di DNA hanno valori di A260/A280 uguali a 1,8
b. Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali a 2
ii. Assorbanza a 230 nm contaminazione del campione dovuta a carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici. Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere di circa 2,2
Il metodo sopra serve a rappresentare la purezza del campione, per sapere la quantità di acidi nucleici presenti bisogna fare l'integrale della curva
Dopo aver estratto il DNA, quello del virus sarà circa l'1% del DNA della pianta è necessario amplificarlo
4. Le PCR
La reazione a catena della DNA polimerasi / PCR "polymerase chain reaction"
“amplificazione genica”
La tecnica consiste in un’amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi del DNA estratto
Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica eo medicina forense (legale)
Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale)
“Riconoscimento della regione genica specifica del patogeno con definizione della sequenza d’innesco (primer) e amplificazione esponenziale di un frammento di DNA (o RNA) bersaglio grazie all’enzima taq polimerasi Amplificazione: copiatura/riproduzione di frammento di DNA target”
La DNA polimerasi utilizzata è la DNA polimerasi di “Thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi)
Come sintetizza la polimerasi?
Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione
5’ 3’ a partire da un innesco 3’ libero suo un templato.Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono antiparallele, la sintesi avvieneo sempre nella stessa direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognunadi esse, ma sempre 5’ 3’
La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrerà sulla elica di DNA templato ino direzione 3’ 5
La DNA polimerasi di cosa ha bisogno?
- Taq polimerasio
- Ogni tanto la taq polimerasi sbaglia, esistono delle taq chiamate taq proof-reading che sono più affidabilidel templato denaturato a singolo filamentoo ottenuto in precedenza
- circa 50/100 ng di DNA
- dei primers (inneschi)
- forward e revers
- lunghi circa 18/24 basi
- sono degli oligonucleotidi (sequenze corte)
- non devono avere struttura secondaria
- i primer legano il target e la taq inizia a lavorare, è fondamentale che non ci siano strutture complementari
ciclo di sintesi.
Avvertenze
- Numero di cicli: solitamente inferiore a 40. Un elevato numero di cicli aumenta l'accumulo di prodotti non specifici
Domanda: chi dice alla taq polimerasi di fermarsi? Tecnicamente dopo il frammento da copiare la sequenza continua e la taq polimerasi non si ferma arrivando a copiare l'intero DNA, tuttavia al ciclo successivo il primer inverso parte dal lato opposto su quella stessa elica, ma una volta copiato il frammento d'interesse non trova altre basi in quanto il primer precedente era partito da quello stesso punto e quindi si ferma. Si può dire che dal secondo ciclo in poi effettivamente venga trascritto solo il frammento d'interesse.
5. Elettroforesi su gel
È il metodo usato per controllare che la PCR abbia funzionato
Viene fatta su gel di agarosio
- Consente la separazione di molecole di grandezza diversa
Etidio bromuro (EtBr)
È un intercalante che viene aggiunto al gel in quanto riesce a intercalarsi
Tra le eliche del DNA, se eccitato con raggi UV, emette fluorescenza. Questo è utile sia per visualizzare sia per quantificare il campione, poiché l'intensità della fluorescenza è direttamente proporzionale alla quantità del campione.
Il gel viene poi immerso in un tampone salino e collegato ad un catodo e ad un anodo. Il DNA si muove verso il catodo. I frammenti più piccoli sono più veloci. Se si vedono molte bande, significa che il DNA si è frammentato.
Preparazione pozzetti:
- W = water = è un controllo in cui si mette tutto ciò che viene messo in PCR tranne il DNA (non dovrebbe comparire nessuna banda a meno che il materiale non sia contaminato)
- C- = controllo negativo = DNA di pianta sana
- C+ = controllo positivo = con DNA del virus appena preparato
Varianti PCR:
La PCR ha dei limiti per alcuni patogeni (amplifica ma non abbastanza problema di "sensibilità"). Bisogna innanzitutto suddividere le varie...
PCR in "end-point" e "real-time", praticamente tutte le tecniche che vedremo sono del primo tipo in quanto offrono il risultato finale senza il percorso intermedio. a. NESTED-PCR: fitoplasmi, virusi. Il prodotto della prima PCR viene usato come templato per una seconda PCR. b. Bisogna usare dei primers che riconoscano il prodotto della prima PCR. c. SEMINESTED-PCR: Uguale a sopra ma viene variato solo uno dei due primers (può essere difficile variare entrambi). d. RT-PCR: virus a RNA, viroidi, funghi, batterii. È usata nel caso in cui bisogna individuare l'RNA e non il DNA (l'80% dei virus fitopatogeni è a RNA). e. In realtà può essere usata anche per i patogeni a DNA un patogeno vivo tra le sue normali funzioni vitali riproduce il suo DNA (trascrizione), sarà quindi anche presente dell'RNA in questo caso potrebbe essere utile per valutare l'esito di un trattamento. f. Per farla non si può.Usare le taq polimerasi iv. Esiste una reazione, chiamata "retrotrascrizione", che dal RNA sintetizza DNA. Cosa serve?
- Enzima = retrotrascrittasi
- RNA del virus
- Basi
- Primers
Esistono due metodi:
-
Si utilizzano tanti primer corti aspecifici "random-primer":
- È molto probabile che becchino un punto complementare convertendo tutto l'RNA in DNA
- Spesso si usano le code di timina oligonucleotide con code "TTT" (RNA code AAA) = retrotrascrizione completa
-
Uso di primer specifici per il virus in questione:
- Non si fa quasi mai in quanto è molto più conveniente avere molto DNA completo per poter poi successivamente fare diversi tipi di test specifici
- Questo metodo serve solo a convertire l'RNA in DNA poi PCR:
- Nel primo ciclo avrò un DNA e un RNA (si amplifica solo uno) poi dal secondo solo DNA
- Si può fare in due modi:
- One step = tutte e due le reazioni vengono fatte in una sola provetta (modificando la
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