Diagnostica fitopatologica

Metodi diagnostici tradizionali

Funghi

Isolamento su terreni di crescita, morfologia delle spore e dei conidi.

Batteri

Isolamento su terreni di crescita, osservazioni morfologiche, test biochimici, capacità di crescere su substrati selettivi.

Virus

Sintomi osservati su piante indicatrici suscettibili, dimensioni e forma al microscopio elettronico.

Fitoplasmi

Sintomi osservati su piante indicatrici suscettibili, spettro piante ospiti e insetti vettori. Tecniche di microscopia come DAPI (microscopio ottico) per la colorazione del DNA batterico e FISH (microscopio confocale) per la colorazione specifica del DNA fitoplasmatico.

Limiti dei metodi diagnostici tradizionali

• Tempi di diagnosi troppo lunghi
• Richiesta di spazi (serre) e attrezzature
• Scarsa specificità
• Scarsa sensibilità
• Scarsa riproducibilità
• Metodi sierologici e molecolari

Sierologia

Molto utile in virologia. La sierologia sfrutta la reazione antigene-anticorpo. Le proteine di alcuni virus hanno un potere antigeno, ovvero stimolano la produzione di anticorpi (che negli animali vengono prodotti nei linfociti).

Antigene

Sostanza estranea che è in grado di stimolare una risposta immunitaria specifica (produzione di anticorpi) quando introdotta in un organismo animale. Estraneo: sostanza che possiede alla sua superficie una disposizione di atomi differente dalla configurazione della superficie di qualsiasi componente dell'ospite. Macromolecola o costituito da macromolecole (es. particelle virali). Piccole molecole raramente inducono da sole produzione di Ac, anche se di per sé sono antigeniche. Quando legate a proteine di trasporto acquisiscono proprietà antigeniche (Apteni). Dose di somministrazione: sotto certe dosi molte proteine non sono in grado di provocare una risposta immunitaria.

Epitopi

Zone del capside di un microrganismo che determinano la formazione di un antisiero, presenti sull'antigene e responsabili del riconoscimento da parte dell'anticorpo.

Anticorpi

Sono delle proteine (immunoglobuline) che combattono l'antigene fermandolo. IgG sono globuline con due coppie di catene polipeptidiche (a forma di Y) legate da ponti disolfuro, i siti di confinazione sono gli estremi delle braccia della Y che agganciano l'antigene e lo inattivano. L'importanza degli anticorpi in diagnostica sierologica deriva dalla loro specificità. I domini variabili (VL e VH) hanno la funzione di unione con l'epitopo dell'antigene e quindi, sono i responsabili della specificità dell'immunoglobulina, mentre i domini costanti permettono la differenziazione dei cinque isotipi di catene pesanti (m,g,e,a,d) che formano le immunoglobuline (IgM, IgG, IgE, IgA e IgD), e dei due tipi di catene leggere: K e l. Un antigene singolo può promuovere la sintesi di parecchi anticorpi differenti. Infatti, gruppi specifici di atomi, denominati “determinante antigenico o epitopo”, costituiti da 5-8 AA, presenti sulla superficie della molecola elicitano ciascuno la produzione di uno specifico anticorpo.

Produzione di anticorpi con virus delle piante

È possibile ottenere anticorpi se:

• Virus purificabile in quantità sufficiente in modo che sia presente solo un virus o pochi virus che permettano di ottenere gli anticorpi necessari partendo dal trito di pianta, centrifugandolo (ultracentrifuga = separazione in base al peso molecolare) il virus è visibile in quanto viene precedentemente marchiato con una sostanza che emette fluorescenza e si può quindi prelevare.
• Virus stabile. Altrimenti potrebbe dare variabilità genetica e quindi anticorpi non specifici.
• Virus immunogenico.
• Virus di cui si conosce la sequenza che codifica per la CP (code protein). Iniettando il DNA del virus in Escherichia coli si può ottenere la CP, una sorta di clone usabile come virus.

Purificazione antigene (virus)

Scopo:

• Ottenere sospensioni di particelle virali prive di altri componenti.
• Concentrare in piccoli volumi le particelle virali.

Tre fasi principali:

• Estrazione del succo infetto da piante con sintomi.
• Filtrazione del succo ed eliminazione dei costituenti più grossolani.
• Concentrazione del virus e separazione dai costituenti della cellula mediante l’impiego di uno o più cicli di centrifugazione.

Purificazione anticorpi

• Eliminazione degli Ab aspecifici mediante assorbimento: l'antisiero ottenuto viene fatto reagire con un estratto di pianta sana e ciò provoca la precipitazione degli Ab aspecifici.
• Si inietta il virus nella cavia in modo che produca anticorpi.
• Si estrae il sangue della cavia e si separa il sangue dal siero (anticorpi).
• Si fa passare il siero attraverso una resina impregnata della CP del virus.
• Gli anticorpi legano il virus target sulla resina rimanendo attaccati, gli altri cadono (gli anticorpi non sono tutti uguali ma sono specifici agli epitopi del virus).
• Si utilizza un eluente per staccare gli anticorpi dalla resina.
• L’anticorpo purificato è ora pronto per i saggi diagnostici!

Antisiero

Siero prodotto dall’ospite contenente gli anticorpi, può essere:

• Policlonale: contiene anticorpi per tutti gli epitopi dell’antigene. Attenzione! Gli anticorpi si possono legare sia agli epitopi del nostro virus, sia a quelli di un altro virus che ha degli epitopi in comune e questo può sfalsare il risultato (utilizzo di saggi specifici).
• Monoclonale: contiene gli anticorpi contro uno solo degli epitopi dell’antigene (alta specificità). Si estraggono le cellule che producono anticorpi e si mettono in coltura con delle cellule tumorali e andranno a formare un ibridoma. Questo ibridoma formerà anticorpi specifici che potrò prelevare e estrarre utilizzando la resina come sopra.

Gli anticorpi hanno specificità con l’antigene e quindi si definiscono omologhi.

Metodi sierologici (diagnostica virologica)

1. Precipitazione in tubo: È il metodo più antico e richiede molto antisiero. Si inizia con la preparazione di una serie di provette con diluizioni recenti dell’antisiero, per ogni antisiero scelto. In ogni provetta si aggiunge una diluizione fissa di virus da identificare, si agita poi brevemente. Si posizionano le provette in un termostato a 37-38 °C e dopo qualche ora si osserva in quante provette il virus da origine al precipitato legame virus-anticorpo; se precipita è il virus giusto, altrimenti è quello sbagliato. Per specificità dell’anticorpo si determina l’antigene.
2. Doppia diffusione in gel di agar (0,8 – 1%): Piastra petri con sospensione Agar (3-5 mm), si fanno dei pozzetti a distanza regolare tra di loro. In un pozzetto si posiziona il virus, negli altri i diversi antigeni di prova (si può fare anche al contrario per saggiare l’antisiero con i diversi antigeni). Gli antigeni e gli anticorpi diffondono radialmente nell’Agar e formano delle bande biancastre di precipitato (se omologhi). Usato anche per stabilire parentela virale.
3. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA): “saggio immunologico con anticorpi legati all’enzima”. Può essere impiegato su materiale vegetativo direttamente dal campo, elevata sensibilità. Utile per accertare la frequenza di un virus in una o più coltivazioni e la sanità del materiale propagativo. Combinazione vistosa per reazione colorata (gialla) catalizzata da un enzima (fosfatasi alcalina) legato agli anticorpi. Svolta in piccoli pezzetti (es.96) di una piastra apposita in cui vengono aggiunti:
   • Anticorpi purificati e coniugati con l’enzima
   • Estratto dei tessuti in esame
   • Substrato che si colorerà
   Passaggi:
   1. Si aggiungono gli anticorpi e si scalda la piastra a 37 °C per permettere agli anticorpi di legarsi. Ad ogni passaggio si fa un lavaggio che fa scivolare gli anticorpi non legati.