Cromatografia ed altri metodi separativi

Metodi separativi

Nella pratica di laboratorio è raro analizzare il campione puro; solitamente questo si trova in una matrice complessa. È quindi necessario utilizzare dei metodi separativi. La prima fase dell'analisi consiste in un'estrazione o separazione importante per eliminare le interferenze e per concentrare il campione se questo è presente in tracce; si prosegue con l'identificazione del campione e la successiva quantificazione (analisi qualitativa e quantitativa).

Principali metodi estrattivi

I principali metodi estrattivi sono: precipitazione, distillazione, estrazione con fluido supercritico, dialisi ed elettroforesi (questi ultimi due utilizzati generalmente per la separazione di proteine).

Estrazione con fluido supercritico

L'estrazione con il fluido supercritico è una tecnica di separazione molto impiegata. Utilizza la CO₂ che alla temperatura di 23°C e alla pressione di 73 atm si trova nella regione supercritica. Nella fase supercritica una sostanza ha proprietà intermedie tra quelle del liquido e quelle di un gas: bassa densità e alto potere solvatante. Il vantaggio dell'uso della CO₂ è che essa non è infiammabile, ha un basso costo ed è facilmente purificabile. Gli svantaggi sono dovuti al fatto che la CO₂ nella fase supercritica è molto apolare e talvolta per avere una buona estrazione è necessario aggiungere un modificatore organico come l'EtOH.

Apparecchio per l'estrazione con fluido supercritico

• Una pompa che porta la CO₂ alla pressione di 73 atm.
• Una camera di estrazione: un cilindro di acciaio riempito con materiale inerte su cui viene messa la miscela da estrarre. Questa si trova in una camera termostatata a 31°C per far sì che a quei valori di pressione e temperatura la CO₂ si trovi nella fase supercritica.
• Una pompa per il modificatore (EtOH).

La CO₂ passa attraverso la camera di estrazione ed estrae il campione. È poi necessario recuperare la sostanza in esame dalla CO₂. Nella camera di intrappolamento la pressione torna ai valori della pressione ambiente, la CO₂ diventa gas e si allontana. In questa camera è presente un solvente generalmente polare (ma dipende dalla natura degli analiti). Per evitare che la sostanza venga portata via dalla CO₂ gassosa è presente una cartuccia SPE.

SPE

Il metodo di estrazione più utilizzato e propedeutico alla HPLC è la SPE. La cartuccia SPE è una siringa su cui si ha un cm di materiale adsorbente di varia natura (es gel di silice, silice derivatizzata ecc.) compreso tra due setti di vetro porosi.

La prima operazione da effettuare è il condizionamento con un determinato solvente (per esempio MeOH se operiamo su gel di silice). Si prosegue con il caricamento del campione disciolto nello stesso solvente con cui si è fatto il condizionamento; si passa poi alla fase di lavaggio utilizzando un opportuno solvente per portare via il materiale interferente. Sulla cartuccia rimane l'analita d'interesse. Nella fase eluente si utilizza un opportuno solvente per portare via l'analita dalla cartuccia.

Si potrebbe anche utilizzare una strategia opposta eluendo inizialmente l'analita e intrappolando nella cartuccia le interferenze, ma questa tecnica è in disuso in quanto non permette la concentrazione del campione.

Materiali adsorbenti per la SPE

• Gel di silice
• Gel di silice modificata costituita da semplice silice legata a catene di 8 o 18 atomi di C
• Gel di silice legata a catene amminopropiliche
• Resine anioniche o cationiche
• Gel borato
• Gel di immunità (utilizzate in biologia)

Se si utilizza il gel di silice in fase normale il solvente impiegato per il condizionamento e per il caricamento del campione dovrà essere un solvente poco polare come il CH₂Cl₂ mentre l'eluizione viene fatta con un solvente molto polare come il MeOH. Se si utilizza il gel di silice in fase inversa si procede al contrario. Nella resina a scambio ionico si utilizzano gradienti di pH o tamponi per il lavaggio e la fase di eluizione.

I vantaggi della SPE rispetto all'estrazione liquido-liquido sono i seguenti: non si formano emulsioni, i volumi di lavoro sono estremamente ridotti. I limiti di questa tecnica sono invece dovuti alla necessità di avere a disposizione l'adatto adsorbente e di dover mettere a punto le giuste condizioni per evitare che l'analita rimanga adsorbito sulla cartuccia.

Cromatografia

HPLC = Cromatografia liquida ad alta prestazione

La fase stazionaria della colonna cromatografica è costituita da particelle < 3 micron. Man mano che le dimensioni delle particelle diminuiscono e la loro forma si avvicina a quella di una sfera, l'efficienza della cromatografia aumenta riflettendosi sulla forma dei picchi del cromatogramma che saranno stretti.

Strumentazione

I componenti fondamentali dell'HPLC sono:

• Le pompe
• I solventi
• Il sistema di iniezione
• La colonna
• Il rivelatore
• Lo scarico o il raccoglitore

Tutto il sistema è interfacciato al PC e regolato da software.

Pompe

I requisiti delle pompe sono regolati dalla farmacopea; queste devono generare pressioni molto elevate non pulsatili ma costanti. Si tratta di pompe alternative a doppio pistone: una pompa spinge, l'altra aspira; ciò garantisce un'elevata riproducibilità del flusso. Le pompe e i pistoni devono inoltre essere molto resistenti; i pistoni sono fatti in zaffiro industriale o porcellana mentre le pompe in acciaio inox. Le pompe sono inoltre provviste di sistemi che servono per linearizzare il flusso smorzando le discontinuità.

Solitamente in HPLC si utilizzano più solventi; questi possono essere prelevati da più pompe o da una sola a seconda che si utilizzi un sistema ad alta pressione o un sistema a bassa pressione.

Nel sistema ad alta pressione è necessario impiegare una pompa per ciascun solvente; queste pompe sono poi collegate ad un miscelatore. Nel sistema a bassa pressione viene impiegata un'unica pompa per i solventi. Questi, prima di raggiungere la pompa, vengono convogliati in una valvola dosatrice regolata tramite il software, i solventi passano poi attraverso il miscelatore e arrivano infine alla pompa.

Solventi

In HPLC non si possono usare solventi classici ma si devono usare solventi appositi per HPLC. Questi infatti devono avere elevata purezza per evitare interferenze. Inoltre, non ci devono essere particelle in sospensione che potrebbero otturare il sistema; per questo motivo i solventi per HPLC devono essere filtrati. I solventi devono essere compatibili con l'intera strumentazione; ad esempio, non può essere utilizzato come solvente il benzene se si impiega come rivelatore lo spettrofotometro perché questo assorbe nell'UV-VIS. Inoltre i solventi devono essere a bassa viscosità e non devono essere comprimibili, in quanto ciò porterebbe a una variazione della pressione. Per questo motivo è necessario che i solventi vengano degassati; un tempo per degassare i solventi si utilizzava l'elio mentre oggi si usa il sonicatore.

Per scegliere il solvente ci si basa sull'ε, cioè il coefficiente eluotropico che indica la polarità del solvente; i solventi apolari vengono definiti weak e i solventi polari strong. Nella scelta è necessario anche tener conto della miscibilità dei solventi: per esempio l'acqua e l'etilacetato sono immiscibili e non possono essere usati insieme in HPLC. Anche alcuni solventi che sono generalmente miscibili in determinate concentrazioni hanno delle "lacune di miscibilità".

Tipi di eluizioni

• Isocratica: avviene alla stessa concentrazione di solvente; il vantaggio è che è possibile utilizzare un'unica pompa e non serve la camera di miscelazione. È un metodo che viene utilizzato in analisi di routine ma raramente in ricerca.
• A gradiente: il rapporto tra i due solventi cambia nel tempo. Per questo tipo di eluizione è possibile utilizzare sia una miscelazione ad alta pressione che a bassa pressione.

Se si hanno degli analiti che escono dalla colonna a distanza di tempo elevato utilizzando l'eluizione isocratica i tempi si allungano e gli analiti che escono per ultimi tendono a scodare (talling) mentre gli analiti che escono per primi tenderanno ad avere una bassa risoluzione (i picchi saranno molto vicini tra loro e talvolta sovrapposti). Con l'eluizione a gradiente invece è possibile accorciare i tempi di lavoro e risolvere entrambi i problemi. Tuttavia non sempre è possibile usare l'eluizione a gradiente; infatti non tutte le fasi stazionarie si riequilibrano velocemente.

Iniezione del campione

Nella CG si usa la siringa per iniettare il campione. Nell'HPLC c'è un'elevata pressione e l'iniezione del campione con la siringa è impossibile. Si usa quindi un iniettore multivia o un autocampionatore. La siringa preleva da 0,1 a 10-20 µL in ambito analitico e inietta il campione nel rheodyne collegato ad un tubicino detto loop che può contenere un dato volume. Il volume di carico è quindi determinato dal loop interno dell'iniettore.

L'iniettore ha due posizioni: la posizione di carico e la posizione di iniezione. Nella posizione di carico il sistema ad alta pressione non è in connessione con il loop che viene riempito con la siringa; se si carica un volume maggiore rispetto a quello che il loop può contenere, la soluzione va a fluire nello scarico. Nella posizione di iniezione il loop va sulla linea ad alta pressione; arriva l'eluente che si porta via il campione caricato. Il solvente utilizzato per il caricamento del campione è uguale a quello della fase mobile (nell'eluizione isocratica), mentre nell'eluizione a gradiente si utilizza come solvente l'eluente iniziale. Tuttavia non sempre la miscela da analizzare si scioglie nell'eluente; in questi casi si possono utilizzare pochi µL di un cosolvente. Questo può comunque scompensare il sistema.

Colonne

Le colonne per HPLC sono tubi di acciaio impaccate con il materiale della fase stazionaria. L'impaccamento avviene con delle press ad altissima pressione. Il diametro interno delle colonne è generalmente di 4,4 mm, la lunghezza è di 5, 15 o 25 cm. Una volta preparate le colonne vengono depositate in un fornetto che mantiene la temperatura costante; infatti la temperatura incide sull'efficienza, cioè sul numero di piatti teorici. Aumentando la temperatura, il tempo di ritenzione diminuisce, il picco esce prima e si ha una minore risoluzione. Di contro l'aumento di temperatura è responsabile dell'aumento dell'efficienza e il numero di piatti teorici aumenta.

Per avere alta efficienza si devono usare nella fase stazionaria particelle sferiche di dimensioni tra 3 e 5 µm. La distribuzione particellare deve essere il più uniforme possibile (stessa dimensione e forma). Usando particelle piccole e sferiche aumenta l'area superficiale disponibile per gli scambi.

Come fase stazionaria polare è possibile utilizzare la silice microporosa, l'allumina oppure silice derivatizzata con catene che terminano con gruppi ciano, ammino, dioli. Invece come fase stazionaria non polare (fase inversa) si usano catene carboniose di 18 atomi di carbonio legate alla silice.

I farmaci sono generalmente acidi e basi deboli quindi si possono usare come tecniche cromatografiche la ionizzazione controllata, la soppressione ionica o la coppia ionica. Nella fase normale, la fase stazionaria è polare e la fase mobile è apolare. Nella fase inversa la fase stazionaria è apolare e la fase mobile polare. Nella fase normale le interazioni tra la fase stazionaria e l'analita sono legami a idrogeno; nel caso della fase inversa invece si tratta di interazioni apolari come interazioni di van der Waals.