Cromatografia ed altri metodi separativi

FASI STAZIONARIE POLARI

- Fase diolica: ha una bassa polarità perché i due gruppi OH sono impegnati in legami a idrogeno tra loro. Questa fase viene solitamente utilizzata nella cromatografia ad esclusione molecolare utile nella separazione di macromolecole.

- Fase amminopropilica: è molto polare. È la fase che per polarità si avvicina di più alla silice normale; lo svantaggio ad essa associato è che non può essere utilizzata con derivati aldeidici perché si formerebbe la base di Shiff (il legame covalente e non reversibile). Inoltre essa tende a ossidarsi ad elevate temperature. Viene utilizzata per la separazione di composti molto polari ma non ionici come gli zuccheri.

- Fase cianopropilica: è moderatamente polare, idonea per analiti che hanno doppi legami. Questa fase si riequilibra molto più velocemente rispetto alla silice e per questo motivo è molto utilizzata nella cromatografia a gradiente.

- Fase a scambio

ionico: non molto utilizzata in chimica farmaceutica.

FASI STAZIONARIE POLARI-C18: è la più utilizzata;-C8

Quando si lavora con una fase stazionaria a base di silice il pH di lavoro deve essere compreso tra 2 e 8; infatti a pH maggiore di 8 la silice si scioglie e a pH minore di 2 si rompe il legame tra la fase legata e la silice. Recenti colonne sono però molto resistenti ed è possibile arrivare fino a pH di 11-12.

In fase normale, come fase mobile si può utilizzare l'esano, il cloruro di metilene, isopropanolo e metanolo (modificatore di polarità che serve ad aumentare la polarità). I tempi di ritenzione aumentano all'aumentare della polarità del soluto. I vantaggi della cromatografia in fase normale legata sono i seguenti:

• si riequilibra facilmente e per questo è adatta all'eluizione a gradiente;
• è compatibile con molti solventi.

Invece i vantaggi della fase inversa sono:

• la versatilità: con una
C18 si possono fase diversi tipi di cromatografia: la cromatografia regolare, la soppressione ionica, la ionizzazione controllata e la coppia ionica. Nella cromatografia regolare si usa come fase stazionaria la C18 senza additivi e come solvente acqua, THF, metanolo. Nella soppressione ionica si utilizza la C18 con additivi acidi o basici per l'analisi di sostanze acidi o basi deboli; per l'analisi di un acido debole si aggiunge un acido più forte, generalmente acido perclorico, solforico, acetico o trifluoroacetico. In presenza ad esempio di un farmaco con un pKa di 4-5 questo in acqua si trova in due forme: dissociata e indissociata. La forma indissociata è meno polare della forma dissociata e si può legare meglio alla C18. Aggiungendo un acido (soppressione ionica) tutto il farmaco si troverà in forma indissociata. Nella ionizzazione controllata come eluente si utilizza un tampone. Quando si utilizza un tampone l'eluizione deve essere sempre.isocratica perché nell'eluizione a gradiente il tampone potrebbe precipitare. Altro problema associato all'uso di tamponi è che essi necessitano di un lungo lavaggio, che può richiedere anche giorni. Per gli analiti acidi si usano tamponi con pKa di 2 unità inferiore rispetto al pka della sostanza in esame per far si che questa si trovi completamente nella forma indissociata. I tamponi utilizzati solitamente sono: tampone acetato, fosfato, formiato o citrato. I tamponi devono essere puri, stabili nella fase mobile, avere una buona capacità tamponante, essere compatibili con il detector e essere volatili in HPLC preparativa (in cui è necessario il recupero dell'analita). Nella coppia ionica in presenza di un analita anionico si può utilizzare un controione cationico come ad esempio il sodio lauril solfato dotato di una testa cationica che in soluzione forma una coppia ionica con l'analita e di una lunga catena carboniosa con laquale interagisce con la C18. La coppia ionica è apolare (perché la testa cationica legata alla testa anionica). I controioni più utilizzati sono: ammine quaternarie, ammine terziarie, alchil e aril solfonati, alchilsolfati. Nella cromatografia per coppia ionica la driving force della separazione è il controione; è infatti il controione che si lega alla C18. Quindi a seconda del controione utilizzato si hanno tempi di ritenzione diversi. I fattori che influenzano la ritenzione sono: il tipo di controione e il valore di pH. Il vantaggio della cromatografia in coppia ionica è che è possibile usare la C18 per separare composti ionici altrimenti separabili solo per scambio ionico. Si possono separare miscele di acidi, basici, composti neutri o anfoteri. I solventi che vengono utilizzati nella fase inversa sono generalmente delle miscele binarie: non è consigliato usare H2O e MeOH perché il MeOH ingloba molte bolle di aria; di conseguenza la

linea2di base non si stabilizza a causa dell'oscillazione della pressione e inoltre le bolle d'aria possono dare interferenza con alcuni tipi di detector producendo dei segnali.

Le fasi inverse C18 presentano comunque un problema dovuto al collasso idrofobico: all'interno delle colonne la pressione è molto elevata e causa il collasso delle catene; quando ciò accade si verifica una brusca caduta della pressione. La colonna polar and copped evita il collasso idrofobico e inoltre minimizza le interazioni secondarie con i gruppi silanoici liberi (che possono essere responsabili delle scodature) grazie all'attacco di gruppi polari ai silanoidi.

CROMATOGRAFIA HILIC: hydrophilic interaction chromatography

Nella cromatografia HILIC si usa come eluente acqua al 3% e come fase stazionaria polare la semplice silice, la silice derivatizzata (diolica, amminopropilica ecc) oppure fasi stazionarie zwitterioniche con una parte cationica e l'altra anionica.

L'HILIC funziona bene con l'eluizione agradiente e viene utilizzata per la separazione di analiti molto polari, salificabili o ionizzabili. RIVELATORE (detector) I detector devono essere compatibili con il resto della strumentazione, devono essere stabili, resistenti, non distruttivi e possibilmente universali. In realtà non esistono detector che soddisfino in pieno quest'ultima caratteristica. I detector generano un segnale elettrico quando passa l'analita in funzione della sua concentrazione; mentre quando passa il solvente il segnale dovrebbe essere praticamente nullo. Infatti in analisi qualitativa il rapporto tra il segnale e il rumore di fondo deve essere almeno di 3 mentre in analisi quantitativa deve avere un valore di minimo 10. Il rivelatore più utilizzato è lo spettrofotometro in quanto rispetta il concetto di linearità: l'intensità del segnale è proporzionale alla concentrazione dell'analita seguendo la

La legge di Lambert-Beer. Tuttavia lo spettrofotometro non è un detector universale in quanto non tutte le molecole assorbono nell'UV-VIS. Ha però una buona sensibilità, non è distruttivo e può essere usato nell'eluizione a gradiente.

Esistono spettrofotometri a lunghezze d'onda variabile, in cui si impostano due lunghezze d'onde: una di lavoro a 250 nm e l'altra di monitoraggio a 220 nm e spettrofotometri a serie di fotodiodi (DAD) che invece leggono a tutte le lunghezze d'onda. Il DAD è una tecnologia avanzata, costosa ma comunque non universale; permette di ricercare il massimo di assorbimento per un analita incognito. Monitorando l'assorbanza nel tempo e in funzione delle diverse lunghezze d'onda si ottiene uno spettrocromatogramma. Gli HPLC-DAD solitamente sono inoltre interfacciati con uno spettrometro di massa: così per ogni sostanza che esce è possibile avere lo spettro UV.

Il cromatogramma e la massa. In questo modo è possibile avere una conferma sulla natura della sostanza analizzata confrontando il suo spettro UV con quello di uno standard; infatti è praticamente impossibile che due sostanze diverse, per quanto simili, abbiano uno spettro UV perfettamente sovrapponibile. Altro metodo per la conferma della natura dell'analita è la fortificazione: se ad esempio si ipotizza che l'analita sia paracetamolo, si fanno due analisi in HPLC: la prima con il campione puro, la seconda aggiungendo al campione il paracetamolo. Nel caso in cui l'ipotesi sia corretta, l'area del picco corrispondente al paracetamolo dovrebbe aumentare. Altro vantaggio del DAD è la possibilità di valutare la purezza del picco; se sul cromatogramma si ottiene un picco relativo all'analita simmetrico si potrebbe ipotizzare che la sostanza in esame sia pura. In realtà sotto al picco dell'analita potrebbe trovarsi un altro picco,

relativo ad un’impurezza. Con il DAD si acquisisce lo spettro UV all’apice del picco e ai due punti di flesso. Si comparano poi questi tre spettri UV e se sono perfettamente sovrapponibili si conclude che il composto eluito è puro.

Quando in HPLC si usa come rivelatore lo spettrofotometro è necessario tener conto della lunghezza d’onda di assorbimento dei solventi: non tutti i solventi sono infatti compatibili con questo rivelatore. Ad esempio se l’analita in questione è un prodotto aromatico è impossibile utilizzare come solvente il benzene.

Altro tipo di rivelatore è il rivelatore a indice di rifrazione. Questo è il più universale di tutti ma è dipendente da altri parametri quali la temperatura, non può essere utilizzato nell’eluizione a gradiente ed è poco sensibile.

Il rivelatore a fluorescenza ha invece una sensibilità molto elevata (dal nano al pico molare) ed è in grado di

rilevare anche sostanze in tracce. Tuttavia, sfruttando la fluorescenza, non è undetector universale; per ovviare a questo problema è possibile derivatizzare l'analita con dellesonde di fluorescenza. La derivatizzazione può essere fatta pre-colonna o post colonna; leprincipali sonde utilizzate sono: il dansilcloruro usato per la derivatizzazione degli amminoacidiperché è in grado di reagire con la funzione amminica o amminoacilica e il BMC che viene inveceutilizzato per la derivatizzazione degli acidi.Lo spettrofotometro a fluorescenza è costituito da una sorgente luminosa: una lampada aldeuterio e da un monocromatore che seleziona la lunghezza d'onda di eccitazione ( chegeneralmente si trova nell'UV). La molecola che assorbe la lunghezza d'onda compie unatransizione elettronica e quando ritorna nello stato fondamentale emette in fluorescenza ( conlunghezza d'onda nel visibile a 300-600 nm). Il detector si trova adi essere un rivelatore universale, in quanto è in grado di rilevare una vasta gamma di composti, indipendentemente dalla loro natura chimica. Inoltre, è molto sensibile e può rilevare anche piccole quantità di sostanze presenti nella miscela. Il funzionamento del rivelatore ELSD si basa sulla dispersione della luce provocata dalla presenza dei composti da analizzare. Quando la luce di eccitazione colpisce i composti, questi vengono evaporati e la luce dispersa viene rilevata dal rivelatore. Grazie a questa tecnologia, è possibile ottenere una separazione e una quantificazione accurata dei composti presenti nella miscela.