Cromatografia

CROMATOGRAFIA A RIPARTIZIONE

FASE STAZIONARIA

La silice è intrinsecamente polare, ma se

derivatizzata la polarità della sua superficie può

essere modulata. Immobilizzando composti

organici idrofobi o idrofili che si presentano in

forma liquida, si crea in pratica un film liquido

permanente sulla superficie della fase

stazionaria.

Le fasi legate più diffuse da HPLC hanno catene

alchiliche lineari e sigle che ne indicano la

lunghezza in atomi di carbonio (es. C18, C8, C4).

Altre fasi stazionarie hanno catene alchiliche

corte con gruppi funzionali (dette CN o cyano,

oppure NH2 o amino).

Altre fasi comuni sono le colonne che legano gruppi fenili (phenyl) a volte derivatizzati per renderli più

apolari (pentafluorophenyl, PFP).

IN FARMACOPEA

La farmacopea cita la fase stazionaria con catene alchiliche a 18 atomi di carbonio immobilizzate su

silice (C18) come octadecylsilyl silica gel (es. metodo HPLC per determinare l'aflatossina).

La fase mobile con legati anelli aromatici viene invece riportata ad esempio come phenylsilyl silica gel

per la caratterizzazione delle impurezze dell'alprazolam.

FASE STAZIONARIA

Le interazioni con gli analiti avvengono principalmente per interazioni deboli

CROMATOGRAFIA LIQUIDO-LIQUIDO

Analogamente a quanto visto per l'estrazione liquido-liquido (vedere materiale

relativo alle tecniche estrattive), si crea un'interfaccia liquido- liquido tra due

fasi immiscibili, di cui una più idrofila e l'altra più idrofoba

A seconda della natura della fase stazionaria la cromatografia a ripartizione si

definisce:

1. in fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, è stata sviluppata per

prima (può essere ad esempio fatta su carta bagnata da acqua, paper chromatography) e

richiede l'uso di solventi organici immiscibili con l'acqua che sono costosi, tossici, volatili e

infiammabili.

Siccome la fase stazionaria è polare i composti più trattenuti saranno quelli più idrofili, mentre

i composti apolari eluiranno per primi perché meno affini alla fase stazionaria. Gli analiti

saranno quindi eluiti in ordine di polarità crescente.

È ancora utilizzata nella TLC, in cui spesso si lavora su silice non derivatizzata, come ad esempio

nella monografia della fenolftaleina, in cui si usa silice e come eluente il diclorometano.

2. in fase inversa (reversed phase, RP) se la fase stazionaria è apolare (meno polare della fase

mobile), è nata dopo (con le fasi legate) ma è diventata la più diffusa delle tecniche

cromatografiche.

Si usano solventi polari o mediamente apolari (acqua, alcoli, acetonitrile), che hanno minori

costi e tossicità dei solventi usati in fase normale.

Al contrario della fase normale gli analiti saranno eluiti in ordine di polarità decrescente (dal più

polare al meno polare e più affine alla fase stazionaria idrofobica).

È la tecnica più diffusa per metodi strumentali (HPLC, UHPLC).

Per ciascun analita, la concentrazione nelle due fasi dipende dall'equilibrio che si instaura dovuto alla

costante di distribuzione.

INTERAZIONE CON LA FASE MOBILE

La cromatografia liquida a ripartizione differisce dalla gascromatografia a ripartizione.

L'equilibrio di distribuzione tra le fasi è sempre influenzato da temperatura e pressione (come in GC),

ma a differenza della GC la fase mobile non fa solo da carrier perché la solubilità degli analiti in fase

mobile (liquida) può essere influenzata da altri fattori come il pH, la forza ionica e polarità.

OTTIMIZZAZIONE DEL METODO

EFFETTO DEL FLUSSO

Come in GC, anche in HPLC i fattori che concorrono all'allargamento di

picchi si controbilanciano in modo ottimale per un dato valore di flusso.

Si lavora a flussi costanti e al valore ottimale (per colonne col ramo destro

dell'equazione di Van-Deemter "piatto", aumentare il flusso non è

dannoso e fa risparmiare tempo). EFFETTO DELLA TEMPERATURA

La temperatura è solitamente mantenuta entro intervalli più bassi

rispetto alla GC, per mantenere gli eluenti liquidi (intervalli tipici di

lavoro 20-50 C°).

Aumentare la temperatura migliora l'efficienza (accelera il

trasferimento di massa tra le fasi, diminuisce la viscosità) ma non

è detto che migliori la risoluzione.

La temperatura può anche modificare la selettività fino a provocare inversioni di ordine di eluizione

degli analiti.

Per questi motivi, a differenza della GC, in HPLC non si usano gradienti termici (isoterma) .

PARAMETRI GENERALI INDIPENDENTI DAL MECCANISMO DI SEPARAZIONE

Quando si ottimizza un metodo in genere:

• Lavorare al flusso raccomandato per la colonna, tranne per colonne UHPLC in cui si può

lavorare a flussi maggiori del consigliato (ramo destro dell'equazione di Van-Deemter quasi

parallelo all'asse delle ascisse)

• Lavorare a temperature alte migliora la velocità di instaurazione degli equilibri e, diminuendo la

viscosità, diminuisce pressione (permettendo di incrementare il flusso) bisogna però valutare

gli effetti sulla selettività ed efficienza.

CROMATOGRAFIA A RIPARTIZIONE

In cromatografia a ripartizione si può facilmente modulare la

selettività e l'efficienza per eluire analiti diversi modulando la

polarità dell'eluente (cambiandolo o attraverso l'uso di

miscele di solventi).

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA

EFFETTO DEL pH

In cromatografia a fase inversa (RP) la ritenzione di analiti

ionizzabili è modulabile in funzione del pH della fase mobile,

perché analiti carichi e neutri hanno diversi coefficienti di

ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile. (ciò non

accade in GC o in HPLC se la fase mobile non è acquosa)

In cromatografia a fase inversa (RP) bisogna controllare il

pH della fase mobile per evitare la dissociazione degli acidi

deboli con sdoppiamento del picco (all'equilibrio si hanno

entrambe le specie RCOOH e RCOO-)

In cromatografia a fase

inversa (RP) il pH può

influenzare non solo la

risoluzione ma anche

la selettività, spesso la risoluzione migliore si ottiene a pH non

estremamente acidi.

Gli acidi organici (formico, acetico) sono preferiti quando si usa la

ionizzazione ESI per MS, ma in UV coprono sotto 220 nm.

ESEMPI DA FARMACOPEA

Nella monografia del celecoxib viene utilizzata la cromatografia a fase inversa (colonna fenilica) con

fase mobile tamponata a pH 3 (il celecoxib è un acido), l'eluente contiene 10% acetonitrile e 30%

metanolo. Le impurezze hanno struttura, polarità e tempi di ritenzione simili.

Nella monografia del butilparabene, viene utilizzata la cromatografia a fase inversa (colonna C18) con

fase mobile acida (non è specificato ma si aggiunge potassio diidrogenofosfato) contenente 50%

acetonitrile. Le impurezze hanno ordine di eluizione crescente in base alla lipofilia (dagli esteri a catena

corta a quelli a catena più lunga).

ADDITIVI DELLA FASE MOBILE

In cromatografia a fase inversa (RP) sono molto popolari l'acido trifluoroacetico (TFA)

e altri acidi organici perfluorati (es. acido perfluorobutirrico PFBA,

perfluoropentanoico PFPA).

Gli acidi organici perfluorati sono acidi forti, ma la loro catena organica è apolare. Si

distribuiscono bene nella fase stazionaria apolare e neutralizzano i silanoli non

derivatizzati. (in teoria non dovrebbero essercene, ma nessuna silice è perfettamente

derivatizzata) La presenza silanoli carichi negativamente può causare interazioni ioniche

con alcuni analiti provocando un allargamento e scodatura dei picchi (analita

troppo affine alla fase stazionaria, resistenza al trasferimento).

La neutralizzazione con TFA può migliorare la forma del picco rimuovendo

queste interazioni addizionali.

La presenza silanoli carichi può essere mascherata anche aggiungendo sali

(es. fosfati, cloruri o formiati di ammonio, potassio o sodio) che interagiscono

coi silanoli al posto degli analiti (possono anche essere usati per creare

eluenti a pH tamponato). L'effetto è concentrazione dipendente e può

cambiare efficienza e selettività. Gli acidi organici perfluorati (es. TFA) vengono anche chiamati

accoppianti ionici (ion pairing reagents) e quando vengono usati con

colonne da cromatografia a fase inversa (es. C18) si parla di ion pair

chromatography.

USO DI ACCOPPIANTI IONICI

Le catene perfluorate sono molto lipofile e si inseriscono tra le catene

lipofile della fase stazionaria creando una fase stazionaria con

superfice carica negativamente.

In ion pair chromatography la fase stazionaria a fase inversa cambia così meccanismo di interazione

e diventa una fase stazionaria a meccanismo misto, in cui oltre che per ripartizione gli analiti si legano

per interazione di carica (cromatografia a

scambio ionico vedere più avanti).

Per caricare positivamente la superficie, invece

che acidi perfluorati, si aggiungono sali di

ammonio quaternario con catene alchiliche

lipofile molto lunghe che ne facilitano

l'adsorbimento sulla fase stazionaria.

L'uso di accoppianti ionici, pur aumentando la ritenzione di analiti polari, riduce drasticamente la

sensibilità in spettrometria di massa.

ESEMPI DA FARMACOPEA

Nella monografia della gentamicina viene utilizzata la cromatografia a fase inversa (colonna C18) per

caratterizzare la composizione del farmaco. La fase mobile contiene accoppianti ionici per aumentare

la ritenzione dei componenti (molto polari) il rivelatore non è UV (assenza cromofori).

Nella monografia del midazolam, viene utilizzata la cromatografia a fase inversa (colonna C18) con

fase mobile che contiene come additivi ammonio acetato, tetrabutilammonio e acido acetico fino a pH

5.

CROMATOGRAFIA A RIPARTIZIONE

SEPARAZIONI ISOCRATICHE

In condizioni costanti di composizione di fase mobile

(isocratica) è difficile ottenere una buona risoluzione di tutti gli

analiti di miscele multicomponenti (così come quando si lavora

in isoterma in GC).

EFFETTO DELLA POLARITÀ DELLA FASE MOBILE

In HPLC, a differenza della GC, non conviene lavorare in

gradiente termico perché la temperatura può modificare la selettività e può essere variata in un

intervallo ristretto. Il flusso ha un suo valore ottimale e non è consigliato lavorare in gradiente di flusso.

Le pompe moderne hanno però dei sistemi di miscelazione dei solventi in tempo reale che permettono

di lavorare a gradiente di eluente, ossia variando la composizione della fase mobile nel tempo, per

modulare le costanti di distribuzione degli analiti e favorire una efficiente eluizione di tutti i picchi.

GRADIENTE DI POLARITÀ

In