Criosifizzazione e nozioni, Citologia e istologia

Criofissazione e utilizzo di campioni congelati

I campioni destinati alla microscopia elettronica possono essere congelati. La criofissazione fa sì che i processi metabolici nel tessuto si blocchino e le strutture biologiche siano preservate. Per evitare la formazione di cristalli, il preparato va congelato molto rapidamente. Il tessuto congelato può essere sezionato utilizzando un microtomo (criomicrotomo) in modo simile al taglio di sezioni da blocchi di paraffina o di plastica. Le sezioni congelate (criosezioni) sono particolarmente utili per studiare l’attività di enzimi facilmente alterabile da fissativi chimici.

Colorazione negativa

Depositi di metalli pesanti si trovano ovunque su una griglia porta-campione, tranne dove sono presenti le particelle. La struttura del campione emerge per la sua relativa luminosità sullo schermo di osservazione.

Ombreggiatura

Tecnica adoperata comunemente per rendere visibili particelle isolate molto piccole. Le griglie sono poste in una camera sigillata, nella quale viene fatto il vuoto. Nella camera vi è un filamento composto da un metallo pesante insieme a carbonio. Il filamento è portato ad alta temperatura, facendolo evaporare e consentendogli di depositare uno strato di metallo sulle superfici accessibili all’interno della camera. Il metallo si deposita sulle superfici che guardano il filamento, mentre le superfici opposte del campione e lo spazio della griglia nella sua ombra rimangono scoperti. Le aree in ombra appaiono chiare sullo schermo di osservazione, mentre le regioni coperte dal metallo appaiono scure. Questa tecnica fornisce un eccellente contrasto per il materiale isolato e produce un effetto tridimensionale.

Criofrattura (freeze-fracture replication)

Piccoli pezzi di tessuto sono posti su un piccolo disco metallico e quindi rapidamente congelati. Il disco viene poi posto su uno speciale porta-campioni, raffreddato in una camera a vuoto e il blocco di tessuto congelato viene intaccato col bordo di una lama, in modo che il piano di frattura spezzi il tessuto in due parti in modo non dissimile. Sulla superficie avrò degli innalzamenti, delle depressioni, che riflettono i contorni del protoplasma attraversato. Nel processo di replica, uso la superficie fratturata come stampo su cui deposito uno strato metallico. Uno strato di carbonio viene poi depositato sullo strato metallico, così da formare uno strato uniforme di carbonio che cementa il mosaico metallico in uno strato solido. Tecnica adatta per esaminare la distribuzione delle proteine integrali di membrana che attraversano il doppio strato lipidico.

Evaporazione a freddo (freeze-etching)

Il campione è esposto a vuoto elevato e a una temperatura maggiore per un tempo durante il quale uno...