Criosifizzazione e nozioni, Citologia e istologia

CRIOFISSAZIONE E UTILIZZO DI CAMPIONI CONGELATI

I campioni destinati alla microscopia elettronica possono essere congelati. La criofissazione fa si

che i processi metabolici nel tessuto si blocchino e le strutture biologiche siano preservate. Per

evitare la formazione di cristalli,il preparato va congelato molto rapidamente. Il tessuto congelato

può essere sezionato utilizzando un microtomo (criomicrotomo) in modo simile al taglio di sezioni

da blocchi di paraffina o di plastica. Le sezioni congelate (criosezioni) sono particolarmente utili per

studiare l’attività di enzimi facilemente alterabile da fissativi chimici.

COLORAZIONE NEGATIVA

Depositi di metalli pesanti si trovano ovunque su una griglia porta-campione,tranne dove sono

presenti le particelle. La struttura del campione emerge per la sua relativa luminosità sullo schermo

di osservazione.

OMBREGGIATURA

Tecnica adoperata comunemente per rendere visibili particelle isolate molto piccole. Le griglie sono

poste in una camera sigillata,nella quale viene fatto il vuoto. Nella camera vi è un filamento

composto da un metallo pesante insieme a carbonio. Il filamento è portato ad alta

temperatura,facendolo evaporare e consentendogli di depositare uno strato di metallo sulle

superfici accessibili all’interno della camera. Il metallo si deposita sulle superfici che guardano il

filamento,mentre le superfici opposte del campione e lo spazio della griglia nella sua ombra

rimangono scoperti. Le aree in ombra appaiono chiare sullo schermo di osservazione,mentre le

regioni coperte dal metallo appaiono scure. Questa tecnica fornisce un eccellente contrasto per il

materiale isolato e produce un effetto tridimensionale.

CRIOFRATTURA (freeze-fracture replication)

Piccoli pezzi di tessuto sono posti su un piccolo disco metallico e quindi rapidamente congelati. Il

disco viene poi posto su uno speciale porta-campioni,raffreddato in una camera a vuoto e il blocco

di tessuto congelato viene intaccato col bordo di una lama ,in modo che il piano di frattura spezzi il

tessuto in due parti in modo non dissimile. Sulla superficie avrò degli innalzamenti,delle

depressioni,che riflettono i contorni del protoplasma attraversato. Nel processo di replica,uso la

superficie fratturata come stampo su cui deposito uno strato metallico. Uno strato di carbonio viene

poi depositato sullo strato metallico cosi da formare uno strato uniforme di carbonio che cementa il

mosaico metallico in uno strato solido. Tecnica adatta per esaminare la distribuzione delle proteine

integrali di membrana che attraversano il doppio strato lipidico.

EVAPORAZIONE A FREDDO ( freeze-etching)

Il campione è esposto a vuoto elevato e a una temperatura maggiore per un tempo durante il quale

uno strato di ghiaccio sublima. Questa tecnica permette una risoluzione molto alta e può essere

usata per rilevare la forma e la distribuzione di complessi macromolecolari.

MICROSCOPIO ELETTRONICO A FORZA ATOMICA

Opera una scansione con una delicata sonda sul campione . Associato alla sonda c’è un sottile

stiletto movibile che è spostato da variazioni nella topografia del campione per cui il grado di

spostamento si correla con le differenze nell’altezza delle parti del campione. Lo strumento genera

una mappa nanoscopica dello spostamento,che viene tradotto in un’immagine topografica

tridimensionale della superficie del campione.