Istologia e citologia

Istologia

Introduzione

La materia vivente si organizza in più livelli: atomi → molecole → organuli → cellule → tessuti → organi → apparati → organismo. Ad esempio, l'epidermide (tessuto epiteliale) + derma (tessuto connettivo) = pelle o cute (organo). Cute + ghiandole + peli + unghie = apparato tegumentario.

Istologia → dal greco "Istos" = tessuto. Materia morfologica che studia i tessuti. La morfologia e l'immagine sono estremamente importanti.

Tessuto → insieme di cellule che hanno la stessa origine e cooperano per la stessa funzione. Attenzione però: non necessariamente le cellule di uno stesso tessuto hanno la stessa forma. Ad esempio, il tessuto epiteliale, nello specifico l'epidermide, ha la funzione di rivestimento e protezione. Quindi le cellule dell'epidermide hanno la stessa origine e funzione ma non la stessa forma: nello strato più interno è formato da cellule epiteliali cubiche, mentre nello strato più superficiale è formato da cellule epiteliali pavimentose.

Nel nostro organismo ci sono 4 tipi di tessuto: t. epiteliale, t. connettivo, t. muscolare, t. nervoso.

L'obbiettivo dell'istologia è correlare l'immagine alla funzione, ovvero conoscere l'organismo umano sotto il profilo morfologico e strutturale, presupposto necessario per l'aspetto funzionale. L'istologia si occupa dell'analisi della forma in quanto permette di studiare la funzione.

Tecniche e strumenti per l'indagine istologica

d = limite di risoluzione

Limite di risoluzione: distanza minima fra due punti vicini percepibili come distinti. Se si segnano due punti a mano a mano che li avvicino, l'occhio riuscirà a distinguerli fino a che la loro distanza sia 0,1 mm. Dopodiché non riesce più a discriminarli a causa del limite di risoluzione (che per l'occhio umano è proprio 0.1 mm). La maggior parte delle cellule stanno al di sotto del valore di 0.1 mm per cui è necessario utilizzare strumenti per osservare le cellule.

Strumenti

• Microscopio ottico o luce: il microscopio ottico è formato essenzialmente da una fonte luminosa (semplicemente una lampadina), un tavolino portaoggetti forato e due sistemi di lenti, l'obiettivo e l'oculare. L'obiettivo è rivolto verso il tavolino portaoggetti sul quale viene posto il campione istologico da esaminare; la fonte luminosa emette un fascio di luce che attraversa il preparato e, sfruttando la lunghezza d'onda, dirige l'immagine verso l'obiettivo. L'obiettivo ne proietta un'immagine ingrandita verso l'oculare che ingrandisce ulteriormente l'immagine.
• Il microscopio ottico permette di osservare corpi molto piccoli oppure sezioni sottili di organi e tessuti. Esso consente di ingrandire l'immagine fino a 2000 volte; il suo limite di risoluzione è infatti 0.2 μm: micrometri (0,0002 mm). Se per esempio l'obiettivo è regolato a 40 x e l'oculare è regolato a 10 x, l'immagine verrà ingrandita 400 volte. Potremmo ingrandire all'infinito, senza tuttavia avere un'immagine nitida del nostro preparato istologico a causa del limite di risoluzione (0,0002 mm).
• Un tipo di microscopio ottico un po' più specializzato è il microscopio ottico confocale, così chiamato perché fa delle sezioni ottiche del preparato e per ogni sezione ottica vengono eliminati i fotoni che non sono perfettamente messi a fuoco utilizzando la fluorescenza. La struttura tridimensionale è molto più rifinita rispetto al tradizionale microscopio ottico.
• Microscopio elettronico: il microscopio elettronico utilizza un fascio di elettroni, anziché un fascio di luce, in quanto il fascio di luce possiede una lunghezza d'onda maggiore rispetto a quella degli elettroni. Dato che il potere di risoluzione è inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda delle radiazioni che esso utilizza, usando un fascio di elettroni è possibile raggiungere un potere di risoluzione di grandezza maggiore, ovvero 0,4 nm: nanometri (0,0004 μm → 0,0000004 mm).
• Il fascio di elettroni viaggia nel vuoto in modo che non ci siano interferenze. Incontrando il campione, gli elettroni vengono deviati maggiormente dai punti del preparato che sono più densi. Quindi ogni punto del preparato sarà più o meno scuro. Di conseguenza al microscopio elettronico è possibile vedere il preparato solo in bianco e nero dove i punti neri (chiamati elettrondensi o elettronopachi) sono i punti del preparato che hanno maggiormente deviato gli elettroni.
• Un altro tipo di microscopio elettronico è il microscopio elettronico a scansione che opera una scansione superficiale dei tessuti fornendo un'immagine tridimensionale.
• Nel 2017 Dobuchet, Henderson e Frank hanno vinto il premio Nobel per la chimica per essere stati gli inventori della microscopia crioelettronica → tecnica di osservazione al microscopio che rende possibile visualizzare le biomolecole (proteine, DNA, RNA, ...) dopo averle "congelate" molto velocemente con il metodo della vitrificazione. In questo modo si preserva la loro forma naturale ed è possibile osservare nel dettaglio le relazioni spaziali fra le diverse molecole.
• La microscopia crioelettronica potrebbe mettere in risalto la gamma secretasi, proteina che provoca l'Alzheimer.

Tecniche

• Per un microscopio ottico o luce un campione deve essere sottile. L'osservazione deve essere fatta per trasparenza, per cui i campioni devono essere altamente sottili per essere trasparenti ai raggi luminosi. Quindi di norma non si può osservare un pezzo di cute per poterla studiare al microscopio, perché subentrerebbero una serie di processi che farebbero morire le cellule della cute mentre il mio obiettivo era proprio studiare una sezione vivente. A causa dell'instaurarsi di artefatti (cose causate da me e che non riportano le condizioni del tessuto fedelmente, così com'è), la cute non sarebbe al suo stadio iniziale, quando cioè è irrorata dal sangue.
• La prima cosa da fare, quindi, è quella di preservare il tessuto tramite la fissazione:
• Fissazione: blocco istantaneo degli enzimi autolitici che interverrebbero ad alterare la cellula dopo la sua morte spontanea.
• 3 metodi di fissazione: → alcoli, → aldeidi (la formalina è il fissante più utilizzato in assoluto), → congelamento (tramite getto di CO2 o azoto liquido).
• Come metodo di congelamento non va bene il freezer di casa perché gli aghetti che si formano vanno a congelare gradualmente le cellule. L'acqua deve, invece, passare istantaneamente dallo stato liquido allo stato solido e una temperatura di vitrificazione può essere ottenuta per esempio con un getto di CO2 che porta il tessuto istantaneamente a -75 gradi o tramite azoto liquido che porta il tessuto a -190 gradi. La cosa fondamentale è essere rapidi nella fissazione. Tempo → variabile = dalle 24 alle 48 ore.

Preparazione materiale istologico

• Il tessuto adesso deve essere sezionato, tagliato tramite mitocromi → speciali apparecchi che tagliano dei campioni ad uno spessore che per la microscopia ottica va dai 4 ai 10 μm, mentre per la microscopia elettronica è di 80 nm (spessore standard).
• Ma qui si presenta un ulteriore problema: le "fette" di tessuto non sarebbero tutte uguali, perché non sono abbastanza consistenti. Per cui, prima del taglio, il tessuto deve essere reso consistente tramite inclusione.
• Includere un campione: lo si infiltra con un mezzo di inclusione che inizialmente è liquido in modo da poter penetrare al proprio interno, poi da liquido deve solidificare in maniera da rendere solido tutto il tessuto. Il mezzo di inclusione universalmente utilizzato è la paraffina. La paraffina ha le stesse caratteristiche della cera da candele, quindi è solida a temperatura ambiente e diventa liquida sui 55-60 gradi.
• Negli istituti di istologia ci sono delle stufette mantenute sui 55-60 gradi come temperatura interna e dentro le stufette vi sono delle vaschette di alluminio con all'interno la paraffina e il nostro preparato istologico, opportunamente lavato. A 60 gradi la paraffina è allo stato liquido, per cui può infiltrare il preparato. La paraffina viene mantenuta liquida per circa 4-8 ore, dopodiché si tira fuori la vaschetta di alluminio dalla stufetta e la si lascia a temperatura ambiente in modo che la paraffina solidifichi in piccoli blocchi in cui è incluso il nostro preparato istologico.
• Se invece di aver utilizzato un fissatore liquido avevamo congelato le cellule del tessuto, il passaggio sopra citato perde di significato dato che il tessuto, grazie al congelamento, ha la giusta consistenza. Il problema è piuttosto non far scongelare i tessuti. A tal proposito i criostati sono delle apparecchiature che tagliano i tessuti senza farli scongelare.
• Se invece lavoriamo in microscopia elettronica, devo utilizzare un materiale più resistente della paraffina: un esempio è l'epon (resina epossilica).

IMPORTANTE: i pezzettini bioptici del nostro preparato devono essere veramente piccoli per essere ben fissati ed inclusi.

Dopo aver ottenuto i blocchetti tramite l'inclusione, li posso quindi portare al microtomo per tagliarle ad uno spessore adeguato. Per poterli osservare li porto al microscopio ottico, li poggio nel tavolino portaoggetti e qui si ripresenta ulteriormente un altro problema: non si riescono a distinguere le componenti del campione perché non abbastanza contrastato. I tessuti, effettivamente, sono incolori e privi di contrasto, per cui bisogna colorare il preparato.

I colorati istologici sono tantissimi. In genere si dividono in coloranti acidi e coloranti basici. Il sistema più comune utilizzato per la microscopia ottica è quello che utilizza in sequenza ematossilina ed eosina. Come si fa? Si prende il vetrino, lo si immerge prima nell'ematossilina, poi lo si sciacqua, lo si immerge nell'eosina e lo si osserva. Risultato → vetrino molto più contrastato. Questo metodo è talmente comune che quando si parla di preparato istologico si intende non un preparato qualunque, ma proprio un campione fissato con la formalina, incluso in paraffina e colorato con ematossilina ed eosina.

Ematossilina → colorante blu, violaceo: basico → colora di blu le strutture basofile.

Eosina → colorante rosso: acido → colora di rosso le sostanze acidofile.

Di conseguenza, in base alla colorazione, possiamo distinguere le componenti basofile ed acidofile del nostro preparato istologico. IMPORTANTE (NON CONFONDERSI): - Le sostanze acide che si trovano nei tessuti hanno affinità per i coloranti basici (strutture basofile, colore blu) - Le sostanze basiche che si trovano nei tessuti hanno affinità per i coloranti acidi (strutture acidofile, colore rosso).

Il nucleo, per esempio, è basofilo perché contiene l'acido desossiribonucleico (DNA) per cui si colora di blu. I microvilli sono piccole espansioni della membrana plasmatica con funzione di aumentare la superficie disponibile per l'assorbimento (si trovano infatti nelle pareti interne dell'intestino). Questi hanno un orletto acidofilo perché presentano al loro interno filamenti di actina (proteina citoscheletrica → basica → acidofila → colore rosso).

Ci sono sostanze cellulari che, invece, non si colorano per niente perché non trovano affinità né con l'ematossilina, né con l'eosina. Queste sostanze sono i lipidi e i glucidi. Per esempio, le zone del citoplasma di cellule che secernono muco non si colorano perché il muco è formato da glucidi.

In alcuni tessuti, invece, esiste un'ulteriore basofilia citoplasmatica oltre al nucleo dovuta all'RNA che si organizza a formare ribosomi (ribosomi → sintesi proteica).

Citologia

Di cellula si parla sin dalla seconda metà del 1600 quando Robert Hooke cercò di studiare e capire la cellula. Vari processi hanno portato poi a definire nel 1830 la Teoria Cellulare, teoria valida ancora oggi, che si basa su tre concetti fondamentali: 1. La cellula è l'unità strutturale e funzionale di ogni organismo vivente; 2. Ogni cellula ha origine da un'altra cellula preesistente; 3. La cellula è la più piccola struttura capace di vita autonoma.

Tutto parte dal differenziamento: attivazione di geni specifici di un determinato tipo cellulare. Il differenziamento porta, però, a una perdita di potenzialità: tanto più è specializzata la cellula, tanto meno è potenziata (esempio: blastomeri → 0 differenziamento, 100 potenzialità; neuroni → molto specializzati ma poco potenziati). Il differenziamento è, inoltre, inversamente proporzionale alla propensione mitotica.

La cellula è immersa in un mezzo acquoso chiamato fluido extracellulare. Una membrana plasmatica separa il contenuto cellulare, il citoplasma, dal fluido extracellulare.

Membrana plasmatica (o membrana cellulare o plasmalemma): costituisce il limite esterno della cellula. Generalmente è molto sottile e delicata e il suo spessore è di circa 8 nm. È definita doppio strato fosfolipidico in quanto i fosfolipidi che la compongono formano due strati distinti. In ogni strato, le molecole di fosfolipidi sono disposte in maniera tale che le teste (idrofile) siano rivolte verso l'intra - e l'extracellulare, mentre le code di acidi grassi (idrofobiche) si intersecano tra di loro nella parte interna.

Le funzioni principali della membrana plasmatica sono: isolamento fisico (il doppio strato fosfolipidico costituisce una sorta di barriera fisica); regolazione di scambi con l'ambiente (la membrana limita il passaggio di ioni e sostanze nutritive); sensibilità (la membrana è la prima parte cellulare ad essere in contatto con l'ambiente esterno, dunque la più vulnerabile); comunicazione cellula-cellula (le giunzioni tra le cellule consentono la comunicazione o meno tra le stesse).

Sulla membrana sono presenti tre diversi tipi di proteine: p. estrinseche, p. intrinseche e p. transmembrana. Le proteine transmembrana sono immerse nella membrana plasmatica e alcune di queste formano dei canali che permettono il passaggio di molecole di acqua, ioni e piccoli composti idrosolubili verso l'interno o l'esterno della cellula. Esistono diversi tipi di canali:

• Canali a controllo di ligando → si aprono in seguito al legame di una proteina del canale di una specifica molecola.
• Canali a controllo meccanico → si aprono in seguito a una stimolazione meccanica del canale.
• Canali a controllo di voltaggio (o di potenziale) → si aprono quando la differenza di potenziale tra i due lati della membrana raggiunge un determinato valore.

Potenziale transmembrana: l'asimmetria nella distribuzione di ioni carichi elettricamente è all'origine di una differenza di potenziale fra i due lati della membrana che si trova normalmente in tutte le cellule. Le superfici interna ed esterna della membrana cellulare differiscono per la composizione lipidica e proteica. Le componenti glucidiche delle glicoproteine e dei glicolipidi che si trovano sul versante esterno formano un rivestimento superficiale e viscoso, un ambiente zuccherino in cui la cellula si trova immersa, il glicocalice.

Esempi di proteine che si trovano sulla superficie della membrana plasmatica sono la distrofina e la spettrina. La spettrina (7 μm e mezzo) è una proteina citoscheletrica presente sul versante interno della membrana plasmatica delle cellule eucariotiche (isolata dagli eritrociti). Le sue funzioni sono: feltro proteico della membrana; responsabile della caratteristica plasticità. La distrofina fa parte di un complesso di proteine che connettono il citoscheletro di una fibra muscolare alla matrice extracellulare circostante attraverso la membrana cellulare.

Permeabilità: la membrana può essere più o meno permeabile. Se non lascia passare quasi nessuna sostanza si dice impermeabile; se lascia passare tante sostanze si dice liberamente permeabile; nelle condizioni normali lascia passare alcune sostanze mentre regola il passaggio di altre: si dice selettivamente permeabile. Il passaggio attraverso la membrana può essere attivo o passivo.

Trasporto passivo → secondo gradiente di concentrazione, non richiede quindi la fornitura di energia (di 3 tipi: diffusione semplice, diffusione facilitata, osmosi); Trasporto attivo → contro gradiente di concentrazione, richiede la fornitura di energia (di 3 tipi: trasporto attivo, endocitosi ed esocitosi).

Citoplasma: con citoplasma si intende tutto il contenuto cellulare in cui possiamo distinguere il citosol (o ialoplasma) che corrisponde al fluido intracellulare e gli organuli. Gli organuli si suddividono a loro volta in organuli non membranosi se a stretto contatto con il citosol e organuli membranosi se immersi nel citosol ma aventi una piccola membrana fosfolipidica che li separa dal fluido.

Organuli non membranosi: il citoscheletro è formato da piccoli tubi e filamenti molto sottili che nei comuni preparati istologici non si vedono. Esso fornisce un supporto per la cellula e determina la posizione dei vari organuli all'interno della cellula fissandoli e facendoli muovere nel citoplasma solo quando necessario. Le quattro principali componenti del citoscheletro sono:

• Microtubuli (25 nm / sono formati principalmente dalla proteina tubulina / hanno varie funzioni: strutturali, di trasporto, di ancoraggio e formano il fuso mitotico durante la divisione cellulare. Inoltre, sono i componenti strutturali di centrioli, ciglia e flagelli).
• Filamenti spessi (formati da miosina).
• Filamenti intermedi (10 nm / così chiamati ...