Corso di immunologia

Corso di immunologia (A. Chiocchetti)

Domande d'esame (tecniche)

1. Immunodiffusione radiale

Utilizzata per il dosaggio delle proteine sieriche e per il dosaggio delle Ig (l’antisiero specifico sarà costituito da Ab anti-Ig); serve per valutare la concentrazione di antigene o anticorpo in un campione. L’immunodiffusione radiale è basata sull’utilizzo di piastre con metodo di Mancini agar gel; consiste nell’effettuare un pozzetto in questa matrice di agar che contiene una quantità di antigene o anticorpo ignota. Per valutare la quantità di antigene o anticorpo poniamo nella periferia del pozzetto una quantità di anticorpi nota e l’antigene diffonderà nella matrice legandosi all’anticorpo formando l’immunocomplesso che precipita creando l’anello di precipitazione (proporzionale alla quantità di antigene migrata). Quindi è un saggio quantitativo perché ci permette di stabilire la concentrazione di antigene; se vogliamo stabilire la quantità invece di anticorpo procediamo mettendo nel pozzetto il campione e una quantità di antigene nota (processo uguale). Possiamo anche creare una retta di taratura che ci permette di definire la concentrazione di antigene o anticorpo variando la quantità di proteina nel pozzetto.

Attrezzatura: agar, campione, materiale per la calibrazione, e anticorpi o antigeni. Per misurare l’anello possiamo utilizzare lenti monofocali o lettori digitali di piastre.

2. Immunodiffusione doppia

L’immunodiffusione doppia o metodo di Ouchterlony serve per studiare la specificità di un antisiero verso specifici antigeni; è un saggio qualitativo poiché permette di determinare l’affinità di legame tra antigene e anticorpo. Usiamo piastre agar stratificato, si pratica un numero determinato di pozzetti ad una determinata distanza tra loro e si aggiunge ai pozzetti l’anticorpo che diffonderanno nella matrice del gel; quando avverrà il legame si creerà una banda di precipitazione che ci dirà la relazione tra antigene e anticorpo. Nel pozzetto centrale si pone l’anticorpo mentre l’antigene nei pozzetti laterali.

Per vedere meglio l’esperimento si possono utilizzare metodi di colorazione e viene condotto in camera umida. Permette di determinare se gli antigeni nei pozzetti hanno epitopi diversi, uguali o in comune. Modelli di precipitazione: se gli antigeni sono identici si forma una banda unita (linea continua, l’antisiero interagisce con entrambi gli epitopi), se sono diversi si formano due linee di precipitato che si incrociano (non identità), se invece l’identità è parziale ovvero un antigene possiede almeno un epitopo in comune con l’altro antigene allora si formerà una linea di precipitato non continua dato che gli anticorpi riconosceranno entrambi gli antigeni. Potremo anche avere una stima semi quantitativa in base a dove si trova la banda: la distanza della banda dal pozzetto con l’antigene è direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente.

3. Agglutinazione

L’agglutinazione avviene in adatte condizioni sperimentali che coinvolgono pH, temperatura, rapporti stechiometrici e forza ionica. Quando esistono le condizioni ottimali si può avere la precipitazione del complesso antigene-anticorpo. Sfrutta il legame dell’anticorpo con l’antigene che è costituito da una particella corpuscolata presente su batteri, eritrociti o leucociti. L’interazione tra anticorpo e antigene determina la formazione di aggregati visibili, definita agglutinazione (anticorpi prendono il nome di agglutine).

L’agglutinazione è un fenomeno dovuto alla segregazione e precipitazione dell’antigene dopo l’interazione con l’anticorpo. Può essere aggregazione diretta se l’antigene è corpuscolato o un batterio, indiretta se l’antigene è solubile e va legato a carrier insolubili (biglie di lattice o globuli rossi). I test che coinvolgono reazioni di agglutinazione si svolgono quando si vogliono cercare anticorpi nell’antisiero di un paziente per diagnosticare una malattia infettiva.

Possiamo distinguere agglutinazione batterica per rivelare la presenza nel siero di anticorpi specifici contro batteri, agglutinazione passiva per individuare anticorpi contro antigeni solubili o titolo anticorpale del siero per valutare la quantità di anticorpo presente in un antisiero.

4. Inibizione dell'agglutinazione

Saggio altamente sensibile per evidenziare piccole quantità di antigene (droghe) oppure determinare se un soggetto è stato esposto ad alcuni virus che causano agglutinazione dei globuli rossi come rosolia e influenza; in questo caso nel siero del paziente sono presenti anticorpi contro virus, essi reagiranno con questo e il virus non sarà più in grado di agglutinare i globuli rossi aggiunti in un secondo momento.

Le reazioni di agglutinazione sono utilizzate anche per determinare i gruppi sanguigni di un paziente (emoagglutinazione) oppure per ricercare un anticorpo legato ad un antigene (test di Coombs).

5. Emoagglutinazione

Test sierologico per la rilevazione di anticorpi basato sul principio che i virus dell’influenza hanno un effetto emoagglutinante sui globuli rossi. Metodo standard per la rilevazione di anticorpi anti-influenza, il sangue si coagula in presenza di questi virus poiché i globuli rossi si raggruppano in presenza di emoagglutina virale quindi se non c’è il virus non avremo reazione, se il virus è presente si forma un precipitato di emoagglutinazione, se invece abbiamo gli anticorpi per questi virus gli anticorpi si legano al virus in modo che non si possa legare ai globuli rossi e avremo una inibizione dell’emoagglutinazione. Se ricerchiamo la presenza di antigeni microbici (emoagglutinazione su particelle di lattice) gli anticorpi vengono adsorbiti in una parte solida di biglie di lattice presenti nel campione perciò l’emoagglutinazione sarà positiva.

Un esame del genere riguarda la ricerca di meningiti: viene prelevato liquido cerebro-spinale e messo in contatto con le biglie di lattice, l’interazione tra anticorpo-particella crea agglutinazione visibile a occhio nudo. Viene anche usato per determinare il gruppo sanguigno utilizzando anticorpi anti-A, anti-B o anti-AB; il metodo consiste nel mettere in contatto il campione di sangue con i diversi tipi di siero immune. La determinazione di quali antigeni sono presenti sui globuli rossi del donatore e del ricevente è l’elemento chiave su cui si basano le trasfusioni di sangue.

6. Test di Coombs diretto e indiretto

Si basa sull’utilizzo del siero di Coombs ossia l’uso di gammaglobuline eterologhe (anti-immunoglobuline) ottenute immunizzando una capra o un coniglio con immunoglobuline umane. Rappresenta una applicazione dell’emoagglutinazione applicata in ematologia per mettere in evidenza anticorpi diretti contro antigeni sugli eritrociti.

Può essere diretto (si esegue per evidenziare anticorpi incompleti legati alle emazie del soggetto ovvero se il paziente ha armato una risposta anti-eritrocitaria in seguito a malattie emolitiche del neonato, anemia emolitica autoimmune, reazioni trasfusionali o sensibilizzazione a farmaci) o indiretto (si esegue per la determinazione di autoanticorpi anti-IgG nel siero del paziente, si ricercano particolari emolisine nel sangue materno in caso di gravidanza a rischio per malattia emolitica).

Nel test diretto i globuli rossi del paziente vengono lavati per allontanare eventuali IgG non legate alla membrana e vengono posti direttamente a contatto con il siero di Coombs contenente Ig anti-Ig umane; si stabilisce quindi se i globuli rossi sono stati ricoperti in vivo da IgG (malattia autoimmune emolitica); se il test è positivo le emazie agglutinano ovvero gli anticorpi del coniglio si sono legati agli antigeni di membrana degli eritrociti.

Nel test indiretto si recupera il siero del paziente e lo si incuba con emazie bersaglio non del paziente, se nel siero sono presenti anticorpi anti-emazie si avrà il legame antigene-anticorpo, successivamente si incuba con il siero di Coombs per verificare agglutinazione delle emazie (test positivo); indiretto perché il siero del paziente è incubato con eritrociti normali per far aderire eventuali anticorpi anti-eritrocitari.

Una applicazione è la ricerca di anticorpi anti-Rh nella madre (metodo diretto ricerca anticorpi sangue neonato, indiretto ricerca nel siero della madre): se abbiamo una madre Rh- e un padre Rh+ e il bambino eredita Rh+ dal padre la madre entrando in contatto con il sangue del figlio può sviluppare gli anticorpi per questi antigeni e alla successiva gravidanza gli anticorpi della madre possono danneggiare il bambino attraversando la placenta.

7. ELISA diretto

ELISA (enzyme linked immoadsorbent assay) è utilizzata per rilevare la presenza di un antigene nel siero di un paziente, ad esempio citochine. Il metodo diretto è detto anche sandwich ELISA che consiste nel far aderire sul fondo del pozzetto gli anticorpi specifici verso un antigene, aggiungere il siero del paziente che contiene gli antigeni che interagiranno con gli anticorpi sul fondo del pozzetto, dopo una serie di lavaggi si aggiunge un anticorpo secondario anti-antigene coniugato ad un enzima e il substrato con l’enzima che produrrà la reazione colorimetrica (in base al colore determiniamo quantità). Sia l’anticorpo primario, sia quello secondario sono entrambi diretti verso lo stesso antigene, per evitare un ingombro stechiometrico verranno usati anticorpi che riconoscono epitopi diversi.

8. ELISA indiretto

ELISA enzyme linked immoadsorbent assay utilizza un marcatore enzimatico (perossidasi) e serve per rilevare anticorpi diretti contro un antigene nel siero del paziente; è un metodo di rilevamento e di valutazione quantitativa di un anticorpo. L’anticorpo secondario è quello coniugato con l’enzima, il materiale da dosare può essere ad esempio del siero umano con Ig: nel pozzetto viene fatto aderire l’antigene alla parete con la temperatura di 4 gradi, poi si esegue una serie di lavaggi per togliere gli antigeni non adesi e si incuba il campione. Dopo un’altra serie di lavaggi aggiungiamo una dose di anticorpi secondari anti-IgG umani coniugati con enzima, si lava nuovamente e si aggiunge un substrato di enzima. Dopo di che avverrà la reazione colorimetrica, il colore sarà proporzionale alla quantità di anticorpi specifici presenti nel siero originale. Come enzima si usa la perossidasi che è un enzima di tipo ossidasi che permette la degradazione di perossidi (l’ossidazione di diversi substrati permette di ottenere un composto cromogenico come prodotto finale).

9. ELISA competitivo

Nell’ELISA competitivo avviene una preincubazione dell’antigene di interesse con degli anticorpi, poi si aggiunge il composto ad un pozzetto sul cui fondo è stato coniugato l’antigene; maggiore è la quantità di anticorpi che interagisce minore sarà la presenza di antigene nel campione, ovvero solo gli anticorpi liberi che non si sono legati durante l’incubazione saranno in grado di legarsi a quelli del pozzetto. Si aggiunge un anticorpo secondario anti-frammento dell’anticorpo utilizzato coniugato all’enzima e avremo una reazione colorimetrica: il colore è inversamente proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione.

Curva standard: consente di determinare la concentrazione di un antigene o di un anticorpo presente nel campione; ad un numero di campioni viene aggiunta una concentrazione nota scalare di antigene e anticorpo che danno una specifica densità ottica (OD); interpolando i valori ottenuti si ottiene una curva lineare che permette la determinazione di antigeni o anticorpi presente nel campione.

10. ELISPOT

Usato per rilevare una determinata popolazione cellulare che secerne un particolare tipo di citochina (IFN-gamma in TBC), è quindi una identificazione e determinazione quantitativa del numero di cellule in una popolazione che producono antigeni o anticorpi specifici. Il saggio è sia qualitativo che quantitativo. Sul fondo del pozzetto viene preadsorbito un anticorpo diretto contro la citochina specifica, si aggiunge il campione del paziente e avremo una certa quantità di cellule capaci di secernere queste citochine; incubiamo a 37 gradi per far produrre le citochine, si lava per evitare legami aspecifici e dopo di che si aggiunge un anticorpo secondario coniugato all’enzima che riconoscerà le citochine e avviene la reazione colorimetrica data alle dimensioni dello spot visibile.

11. Western blot

Permette di identificare proteine a occhio nudo; è una tecnica che combina la risoluzione dell’elettroforesi con la sensibilità dell’immunoistochimica. Permette di quantificare e identificare proteine che reagiscono con un anticorpo specifico. Esse dopo essere state frazionate, vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa e sottoposte a corsa elettroforetica su gel di poli-acrilammide (separazione antigeni) per poi essere di nuovo trasferite su un’altra membrana di nitrocellulosa; successivamente avremo gli stessi passaggi del metodo ELISA (saturazione dei siti di legame aspecifici, incubazione con anticorpi marcati e rilevazione).

L’elettroforesi è il metodo usato per separare le proteine, la separazione avviene grazie all’influenza di un campo elettrico mentre la migrazione avviene in base al peso molecolare delle proteine. Altra parte fondamentale è il gel di poliacrilammide composto da stacking gel (pH 6,8, si trova nella parte superiore dove vengono posti i pozzetti durante l’allineamento, consente di impaccare tutto il materiale in modo che arrivi uniformemente alla zona di corsa ovvero viene aggiunto glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti con un agente riducente per rompere i legami disolfuro e un colorante per visualizzare i campioni, qui si applica campo elettrico) e running gel (pH 8,8 , qui le proteine si divideranno per dimensione perciò molecole di grandi dimensioni migreranno più lentamente rispetto a quelle più piccole), in entrambi i casi è formato da monomeri di acrilammide legati tra loro con crosslinker e la polimerizzazione avviene tramite un generatore di radicali liberi ed un acceleratore (APS iniziatore e TEMED catalizzatore). Così avremo un setaccio tridimensionale in cui le proteine saranno in grado di muoversi: la capacità di muoversi delle proteine nel gel dipende dalle loro dimensioni e dalla loro struttura.

Nell’SDS PAGE (polyacrylammide gel electrophoresis) le proteine vengono esposte al sodio dodecil solfato prima dell’elettroforesi, esso si lega alle proteine, le solubilizza e le denatura quindi assumono tutte una conformazione lineare, sono estese e con carica negativa per cui la migrazione nel gel dipenderà solo dalla dimensione e non dalla struttura. Per evitare che le proteine migrino troppo velocemente i gel di poliacrilammide possono essere fatti a concentrazioni diverse di acrilammide (le dimensioni dei pori diminuiscono all’aumentare della sua concentrazione).

Nella fase 2 di trasferimento le proteine separate tramite elettroforesi vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa sfruttando una differenza di potenziale elettrico: convenzionalmente si effettua mediante blotting ad immersione ovvero il sandwich per il blot (carta assorbente per il blotting, gel, membrana di trasferimento, carta da blotting) è interamente sommerso dal tampone di trasferimento.

Nella fase 3 e 4 di immunoblotting e visualizzazione delle bande avviene il bloccaggio dei siti aspecifici con latte (saturazione siti per prevenire legami non specifici tra anticorpo e membrana), successivamente l’anticorpo primario riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana l’anticorpo secondario coniugato con un sistema di rilevazione riconosce l’anticorpo primario già legato alla proteina di membrana (amplificare il segnale); ultimo passaggio lo sviluppo radiografico dove l’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che in corrispondenza della proteina sviluppa un precipitato chemioluminescente.

Per capire la dimensione e il peso molecolare della proteina posso utilizzare un ladder ovvero un pozzetto con caricate proteine con peso molecolare noto di solito colorato e visibile a occhio nudo. L’immunoblotting è utilizzato in campo chimico clinico per ricerche qualitative e quantitative di ormoni nel sangue e nelle urine per esempio in caso di ipo o ipertiroidei.

12. Immunoprecipitazione

Per identificare proteine di interesse in una soluzione acquosa possiamo utilizzare questa tecnica che consente l’identificazione e l’isolamento delle proteine di interesse per ulteriori analisi. Nel campione aggiungo uno specifico anticorpo e un anticorpo secondario che riconosce il frammento dell’anticorpo primario. L’anticorpo secondario è coniugato ad una biglia magnetica perciò applicando un campo magnetico possiamo estrarre gli antigeni che cercavamo i quali sono agganciati agli anticorpi.

13. Immunofluorescenza su tessuti e su cellule in sospensione

Serve per identificare antigeni nella loro esatta localizzazione in sezione istologiche e usando una reazione antigene anticorpo, dove l’anticorpo è marcato con una sostanza fluorescente che non alterano la sua capacità di legarsi agli antigeni. Il metodo è utilizzato per identificare fenotipi cellulari, antigeni tissutali, antigeni tumorali, batterici o virali. Gli anticorpi usati possono essere sia monoclonali che policlonali. Nel metodo diretto la sezione del tessuto è trattata con un anticorpo fluorescente che si lega direttamente all'antigene.