Colture microbiche

Colture microbiche per l'industria alimentare

Esame: orale discussione articolo scientifico e poi domande teoriche + presentazione alimento fermentato

Introduzione alle colture microbiche

Le colture microbiche sono presenti ogni volta che si assume un alimento fermentato in quanto sono presenti miliardi di cellule; ad esempio, in 1g di Parmigiano si hanno 10^11-12 cellule per g, mentre in un campione fecale si hanno 10¹¹ cellule per g. Gli alimenti fermentati incidono molto sulla dieta e sul microbiota intestinale; vengono assunti volontariamente ma senza essere consapevoli di quanti microrganismi vengono introdotti, anche solo con insalata si assume un livello di circa 10^6-7 cellule vitali/g.

Si è continuamente esposti ai microrganismi, in particolare negli alimenti fermentati che sono introdotti con la dieta da migliaia di anni. In un lavoro si parla che 1/3 della dieta è composto da alimenti e bevande fermentate, quindi l'ingestione di microrganismi quotidiana è davvero elevata. Gli alimenti fermentati hanno benefici sulla salute perché durante la crescita nei tratti desiderati i microrganismi sono in grado di produrre vitamine, peptidi bioattivi che hanno effetto positivo sulla salute del consumatore, oltre che ad avere la capacità di degradare da un alimento alcuni elementi non nutrienti che potrebbero essere tossici o inutili per la salute.

I prodotti fermentati esistono da circa 10 mila anni e prima si aveva un processo di fermentazione spontaneo per aumentare la conservabilità di un alimento (latte fermentato) e si è anche visto che grazie a questa era anche possibile produrre alcol; ci sono molte testimonianze riguardanti gli Egizi dove era già nota la pratica per la caseificazione, quindi la produzione del formaggio e dimostrano quanto sia antico il processo di fermentazione.

Il processo di fermentazione è un processo anaerobico dove l'ossigeno non è necessario per lo svolgimento e serve per convertire gli zuccheri (glucosio) in composti come alcol, acidi organici con l'obiettivo di produrre energia che è fondamentale per la sopravvivenza e la replicazione della cellula. Da un punto di vista biochimico è la combinazione della glicolisi che porta alla produzione di ATP e piruvato e poi nella parte finale del metabolismo si converte in acido organico con la presenza del NADH che viene riconvertito NAD+ e quindi ripristinato (agente riducente-ossidante).

Principali ruoli del processo di fermentazione

• Maggiore conservabilità del prodotto post-fermentazione perché tra i prodotti ci sono gli acidi organici che abbassano il pH e inibiscono la crescita dei microrganismi alterativi, contaminanti e soprattutto patogeni; un altro prodotto è l'etanolo che può essere letale per molti microrganismi, quindi aumenta la conservazione. Infine, si ha anche la produzione di batteriocine che sono peptidi con attività antimicrobica verso i batteri gram-positivi aumentando la shelf-life del prodotto fermentato. Inoltre, si ottiene una maggiore conservabilità perché spesso dopo il processo si ha anche un abbassamento attività dell'acqua perché in parallelo c'è l'utilizzo di salatura (produzione gorgonzola).
• Inoltre, viene implementata la safety del prodotto inibendo lo sviluppo dei patogeni e grazie al metabolismo si può avere la riduzione di composti tossici.
• Si ha anche un aumento del valore nutrizionale del prodotto perché durante la crescita del microrganismo si ha la liberazione di acidi grassi, amminoacidi essenziali, vitamine, peptidi bioattivi e proteine.
• Miglioramento della qualità dell'alimento perché diventa più conservabile e gradevole.

Il metabolismo viene svolto da batteri e lieviti dotati di determinati enzimi e di attività che consentono la fermentazione e la produzione di altri metaboliti come EPS che sono fondamentali per l'alimento fermentato. Questi processi di fermentazione possono anche essere spontanei però quando le colture vengono aggiunte accelerano un processo che potrebbe essere spontaneo normalmente rendendolo più rapido; un altro grosso vantaggio per cui si aggiungono colture starter selezionate è che consentono di controllare la reazione, velocizzarla, prevenendo contaminazioni e di poter ottenere dei prodotti standardizzati nelle caratteristiche che è una cosa fondamentale, quindi consente di avere riproducibilità nell'ottenimento di un determinato prodotto e affidabilità perché si velocizza il processo e il prodotto finito è riproducibile con una variabile è la matrice iniziale. Inoltre, si ottengono texture e aromi peculiari grazie all'impiego delle colture microbiche perché quando si selezionano i ceppi a seconda dalla texture che si vuole si selezionano microrganismi produttori o meno di eso-polisaccaridi.

Chi si occupa di colture microbiche è l'EFFCA che è un ente europeo che regola le colture microbiche per l'industria alimentare; questo ente presenta la definizione di colture microbiche, ovvero sono i batteri, lieviti e muffe che vengono volontariamente aggiunte a una matrice alimentare per l'ottenimento di un determinato prodotto e questi microrganismi diventano poi un ingrediente caratteristico dell'alimento stesso. Si parla di microrganismi in termini di batteri, lieviti e muffe, dove però non tutti danno via al processo della fermentazione (starter) ma alcuni sono colture microbiche coinvolte in step successivi alla fermentazione come i lieviti e le muffe nella produzione di Gorgonzola: il latte viene inoculato subito con batteri (due starter consumo glucosio) che fanno partire l'acidificazione e poi il latte viene raffreddato e subentra l'attività di lieviti che sono in grado di utilizzare il galattosio e questa attività è fondamentale per far lievitare la forma del Gorgonzola in modo che nella seconda parte della maturazione ci sia la possibilità di sporulazione delle muffe negli spazi creati. Se durante la crescita dei lieviti la forma si alza troppo, si ha il rischio di crollo e quindi il mancato sviluppo delle muffe, quindi è fondamentale che i lieviti lavorino correttamente a un livello ideale affinché la muffa si possa sviluppare. Si ottiene un equilibrio tra colture microbiche e senza di queste non si può ottenere prodotto finito; il rapporto spesso deve cambiare in funzione della matrice originale, quindi in funzione del latte di partenza. Le colture microbiche sono dei componenti essenziali del prodotto finito, il processo di fermentazione viene controllato, vengono inoculati direttamente nella matrice. I microrganismi fanno fermentazione, aumentano la conservabilità della matrice, aumentano il valore nutrizionale e vengono modificate le proprietà sensoriali anche in termini di texture e si ha un aumento del valore economico della matrice. Rispetto alla materia prima, si ottiene un costo al kg/L del prodotto fermentato maggiore, il valore economico aumenta di molto.

Colture microbiche per produzioni alimentari

Le colture microbiche sono microrganismi, lieviti e muffe che devono essere sicuri e vitali ed entrano a far parte di un alimento e vengono utilizzati per produrlo; sicuri in quanto non devono provocare danni per la salute dell'uomo e degli animali. Vengono impiegate anche nei mangimi, quindi negli alimenti destinati agli animali e questi poi sono destinati all'alimentazione umana (anche antibiotico-resistenza) e per questo devono essere sicuri. Devono essere anche vitali, quindi tutte le cellule presenti devono essere vive in grado di formare colonie e questo si può fare con la tecnica di diluizione e piastramento, che è una tecnica laboriosa che porta via tempo; il termine di vitalità non si riferisce solo alla crescita in un terreno agarizzato ma ci sono anche cellule vitali che non originano UFC e quindi si ha una metodica alternativa che è la citometria a flusso che viene considerata dal 2015 la metodica ufficiale per la conta totale di un alimento fermentato e dei microrganismi starter e probiotici.

Diventano una caratteristica fondamentale per un determinato alimento perché se si cambia la coltura microbica non si ha più lo stesso alimento che è quindi associato a una particolare coltura microbica o più colture microbiche. Nella tavola periodica si possono vedere le colture microbiche che caratterizzano un particolare alimento fermentato che può essere fatto da batteri, lieviti, muffe o solo microrganismi ecc. che diventano quindi una caratteristica fondamentale di quell'alimento perché se si cambia anche solo l'associazione si varia il prodotto ottenuto; è importante anche il rapporto e si deve anche fare una selezione a livello di ceppo perché non tutti i ceppi sono in grado di interagire tra loro. Le caratteristiche sono sempre presenti ma sono modulate in modo diverso, sono più attive in un ceppo e meno in un altro. Le colture microbiche vengono volontariamente aggiunte e in un modo estremamente controllato diventando una componente essenziale dell'alimento; la carica microbica impiegata può variare a seconda della stagionalità: ad esempio, il latte può contenere più o meno urea e Streptococcus thermophilus è fortemente influenzato dalla presenza urea e quindi la carica microbica varia a seconda della stagionalità; l'urea è un liquido, si trova in tutti i liquidi fisiologici.

Le colture microbiche portano cambiamenti desiderati e prevedibili nel prodotto finito: desiderati perché si usano colture selezionate basate su caratteristiche fenotipiche, biochimiche e fisiologiche e prevedibili perché se si fa una selezione per una particolare attività enzimatica si ha una particolare produzione. I cambiamenti prevedibili sono: dare maggiore conservabilità all'alimento, estendere la sua shelf-life, prevenendo lo sviluppo di patogeni e microrganismi indesiderati (alterativi), avere un maggiore valore nutrizionale come la capacità di degradare componenti non nutrizionali, modificare le qualità sensoriali e aumentare il valore economico del prodotto finito rispetto alla matrice di partenza. L'obiettivo dell'impiego di colture microbiche è di ottenere una qualità costante, riproducibile ed elevata di un alimento fermentato.

Alcuni alimenti fermentati sono: yogurt, mozzarelle acidificate con S. thermophilus (più importante e utilizzato), formaggio fresco, muffe che portano a formaggi erborinati, lieviti che portano alla produzione di birra, vino, impasti per pizza e focacce, quindi la dieta porta ad assumere molti di questi alimenti e quindi si ingerisce una quantità di cellule vive molto alta. Un alimento fermentato impatta molto sul microbiota.

I microrganismi sono stati scoperti nel 1665 quando è stato messo a punto il primo microscopio da Van Leeuwenhoek and Hooke; Pasteur scopre i microrganismi in grado di fermentare e procede con la messa a punto le tecniche di microbiologia classica che ancora oggi si utilizzano con i limiti della tecnica di diluzione e piastramento. Poi c'è stato un momento fondamentale nel 1870 con Lister che fu il primo a isolare il batterio lattico Bacterium lactis scoprendo che poteva acidificare il latte determinando poi la coagulazione delle proteine e dopo pochissimo tempo nel 1880 nasce la prima industria Hansen iniziando a produrre le colture microbiche che possono essere poi utilizzate come starter in diversi settori (vino, carne e latteo-caseari che 70% colture microbiche). Ai tempi, le colture microbiche venivano fatte crescere in latte e poi liofilizzate in latte perché è un crioprotettore dallo stress termico e oggi è meno utilizzato in quanto ci sono persone intolleranti al lattosio che altrimenti non potrebbero consumare l'alimento, soprattutto nelle preparazioni di microrganismi probiotici. Hasen ancora oggi è la leader mondiale insieme a poche altre aziende come Danisco e Sacco System (Como); chi lavora in queste aziende che producono colture microbiche sono microbiologi esperti che continuano ogni giorno a studiare e selezionare colture microbiche perché spesso i clienti richiedono diverse necessità. Oltre al reparto di produzione, c'è tutto il reparto di ricerca e sviluppo. Sono poche aziende che coprono le esigenze mondiali.

Colture microbiche destinate a settore caseario (dairy sector)

Nel settore latteo-caseario si hanno diversi tipi di colture microbiche:

• Le colture starter sono quelle che fanno la fermentazione, danno il via al processo di fermentazione, sono microrganismi che quando sono inoculati in latte sono in grado di utilizzare il lattosio. Le colture microbiche più importanti in assoluto sono quelle che costituiscono il consorzio dello Yogurt con Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus che idrolizzano il lattosio e utilizzano il glucosio per produrre acido lattico e questo consorzio è studiato da tantissimi anni in quanto sono molto rilevanti nei processi industriali ed è fondamentale selezionare i ceppi giusti con caratteristiche per avere il prodotto finale ottimale. Il consorzio dello yogurt contiene microrganismi dove si ha un'interazione di proto-cooperazione che è un mutualismo dove si ha un'interazione positiva per entrambi, quindi si ha un vantaggio l'un l'altro in quando L. bulgaricus fornisce a S. thermophilus peptidi e amminoacidi in quanto ha una scarsa attività protolitica e S. thermophilus è più ossigeno-tollerante e grazie alla sua attività ureasica che libera NH₃ e CO₂ rende anaerobico l'ambiente favorendo L. bulgaricus; entrambi traggono vantaggio e spesso sulla base della selezione dei ceppi è possibile che il mutualismo diventi un sinergismo, ovvero i due microrganismi danno una somma pari a 3 perché messi insieme riescono a crescere di più rispetto a quando coltivati singolarmente in latte. Per diventare sinergismo è fondamentale un'attenta selezione dei ceppi perché non tutti possono portare a sinergismo e quindi questo concetto di selezione dei ceppi è fondamentale per chi lavora alla selezione delle colture microbiche; ecco perché nelle aziende c'è anche una collezione enorme di ceppi, si fanno sempre isolamenti per avere nuovi ceppi da analizzare. Nello yogurt un ceppo deve produrre la giusta quantità di eso-polisaccaridi per conferire la cremosità allo yogurt e avere anche un'attività ureasica adeguata perché è importante per la produzione di CO₂ e per S. thermophilus perché è un acidificante omo-fermentate che inibisce la sua riproduzione e per questo la produzione di NH₃ è fondamentale. La caratterizzazione fenotipica dei ceppi è fondamentale e il sequenziamento dei genomi non consente di risparmiare lavoro perché permette di avere carta d'identità ma poi bisogna vedere come determinati geni ci sono nella condizione del latte. Queste colture starter fanno partire la fermentazione, sono fondamentali perché più sono rapidi, più si preserva il prodotto e sono utilizzati per tante produzioni come yogurt e gorgonzola; nel caso del gorgonzola, vengono inoculati nel latte pastorizzato possibilmente insieme al lievito e alle spore.
• Poi si hanno le colture starter secondarie che sono quelle fondamentali per lo sviluppo della texture, aromi e sapori e odori che sono poi caratteristiche peculiari di un formaggio o di un alimento fermentato: vengono inculati al t₀ o possono essere aggiunte dopo la fermentazione delle colture starter (ma in genere al t₀). Le colture starter sono più veloci, si ha la competizione per lo zucchero e quando rallentano iniziano le colture secondarie spesso meno sensibili all'inibizione da parte dell'acidità. Il ruolo delle colture secondarie è conferire aromi, sapore e texture.
• Poi si hanno colture che sono fondamentali per la maturazione delle croste; alcune croste non necessitano di colture microbiche ma se si vuole un prodotto riproducibile l'impiego colture consente di avere processo più controllato. In questo caso, le colture microbiche aiutano alla maturazione del formaggio, all'evoluzione della crosta e sono coinvolte nella texture e formazione degli aromi; ad esempio, il taleggio ha una crosta che si forma con il processo di maturazione e il ruolo che possono avere queste colture è proteggere la superficie della crosta del formaggio perché si forma una competizione tra la coltura secondaria e patogeno (L. monocitogenens). Queste colture consentono di proteggere la superficie inibendo lo sviluppo di microrganismi patogeni che sono indesiderati.

Si possono vedere alcuni esempi di questi microrganismi: Candida krusei e Kluiveromyces marxianus vengono utilizzati per la produzione formaggi del nord austriaci e tedeschi. Brevibacterium linens ha una forma che può variare in base alla fase in cui si sviluppa (bastoncino in fase esponenziale e coccoide in fase stazionaria) e si dice pleomorfio (varia morfologia); è fondamentale per la maturazione delle croste e per conferire il tipo di colore, aroma e sapore di moltissimi formaggi. Stando sulla crosta è anche molto tollerante all'ossigeno e quindi alo-tollerante. È alofilo, ovvero per crescere dipende dalle concentrazioni elevate di sodio-cloruro e quindi necessita di concentrazioni maggiori del 10% di sale; un microrganismo alo-tollerante invece tollera la presenza di sale fino ad alte concentrazioni ma non ha bisogno di sale. Sulla crosta si hanno spesso alo-tolleranti perché spesso le forme vanno incontro a salatura come il gorgonzola durante la maturazione. B. linens sviluppa un pigmento arancione sulla crosta ed è caratterizzato da avere proteasi extra-cellulari molto attive e in grado di sintetizzare composti solforati come zolfo-metil-tioesteri e uno di questi è il metan-tiolo che è il responsabile dell'odore tipico alcuni formaggi (piedi) e grazie alla produzione di proteasi extra-cellulari è anche un acceleratore della maturazione.