Appunti di lezioni di Colture microbiche

Scienze e Tecnologie Alimentari

Magistrale - UniMi

Appunti di lezioni di:

COLTURE

MICROBICHE PER

L’INDUSTRIA

ALIMENTARE 1

Introduzione alle colture microbiche

Le colture microbiche che studieremo sono per:

- Settore lattiero - caseario

- Carne e pesce

- Prodotti da forno

- Vegetali

- Alimenti funzionali e probiotici

- Ago veterinario

I prodotti alimentari fermentati sono stati parte della dieta umana da almeno 10000 anni aC

Fermentazione

= processo utilizzato dall'uomo per migliaia di anni, con un ruolo importante nella conservazione

degli alimenti e nella produzione di alcol.

Combinazione di glicolisi con coinvolgimento finale

= processo anaerobico che converte gli zuccheri, come il glucosio, in altri composti come l'alcool,

producendo energia per il microrganismo o la cellula.

Dal punto di vista biochimico, la fermentazione è un processo metabolico di derivazione di

energia da composti organici senza il coinvolgimento di un agente ossidante esogeno.

La fermentazione svolge un ruolo diverso nella lavorazione degli alimenti.

I principali ruoli considerati sono:

1. Conservazione degli alimenti mediante la formazione di metaboliti inibitori quali acido

organico (acido lattico, acido acetico, acido formico, acido propionico), etanolo, batteriocini, ecc.,

spesso in combinazione con la diminuzione dell'attività dell'acqua (mediante essiccazione o uso di

sale)

2. Migliorare la sicurezza alimentare mediante l'inibizione degli agenti patogeni (pH) o la

rimozione di composti tossici

3. Miglioramento del valore nutrizionale (vitamine, acidi grassi, produzione di aminoacidi

essenziali, proteine o peptidi)

4. Qualità organolettica dell'alimento (acido lattico, esopolisaccaridi, composti aromatici)

Le colture microbiche vengono utilizzate per standardizzare i prodotti finiti; per andare a

velocizzare i processi di trasformazione

Chi?

- Batteri e lieviti sono microrganismi con la capacità enzimatica di fermentazione, in particolare

- Molti prodotti diversi in tutto il mondo sono il risultato della fermentazione, che avviene in

natura o attraverso l'aggiunta di una coltura di avviamento

- Diverse specie batteriche e lievito sono presenti in ogni caso, che contribuiscono ai sapori unici

e texture presenti negli alimenti fermentati

COLTURE ALIMENTARI MICROBICHE PER LA PRODUZIONE ALIMENTARE

= I MFC sono BATTERI VIVI SICURI, LIEVITI O MUFFE utilizzati nella produzione alimentare che

sono di per sé un ingrediente alimentare caratteristico.

Sono lieviti, muffe e batteri vivi che vengono utilizzati come starter o come ingredienti.

es. gorgonzola: i due batteri lattici del lattosio vanno ad essere utilizzati come starter. In una

seconda parte della maturazione, va a lavorare il lievito

Sicure cioè non devono portare rischi per uomo e animali. 2

Oltre a scegliere il microrganismo adatto, si dovrà scegliere il ceppo idoneo per ogni produzione

alimentare.

Colture microbiche per la produzione alimentare

- componente essenziale di quasi tutti gli alimenti fermentati prodotti in commerci

es. A secondo della stagionalità dello yogurt, questo potrà contenere più o meno urea e St è

Ureasi positivo, l’attività ureasica influenza molto la crescita di St in latte e quindi anche il numero

di cellule iniziali di St varia con la stagionalità perchè a seconda della stagionalità cambia la

condizione di crescita di St. L’alimentazione delle vacche d’estate e d’inverno cambia e quindi

cambia anche il contenuto di urea.

- microrganismi inoculati direttamente nei materiali alimentari al fine di portare sui cambiamenti

desiderati e prevedibili nel prodotto finito

In relazione al mo inoculato possiamo aspettarci il metabolita desiderato, per quello è

prevedibile.

Cambiamenti prevedibili: i) maggiore conservazione: prevenire lo sviluppo di patogeni; prevenire

lo sviluppo di mo indesiderati e alterativi. ii) miglioramento del valore nutrizionale: degradazione

da parte dei mo di alcuni componenti che non hanno valore nutrizionale e che talvolta

diminuiscono la biosdisponibilità. iii) qualità sensoriali modificate. iv) maggiore valore economico:

i latti fermentati valgono di più del latte.

Anche se molti alimenti fermentati possono essere fatti senza una coltura di avviamento,

l'aggiunta di microrganismi concentrati, sotto forma di coltura di avviamento, fornisce una base

per garantire che i prodotti siano fabbricati secondo un calendario coerente, con qualità del

prodotto coerenti (qualità prevedibile e costante nel tempo).

Cronistoria

Van Leeuwenhoek and Hooke (1665): microscopio, microrganismi

Pasteur (1860s): tecniche di coltura pura in microbiologia, vita senza aria

Lister (1870s): identificazione di batteri dell'acido lattico (LAB), Bacterium lactis

In the late 1880s: industria dedicata alla produzione di culture pure, Christian Hansen ha iniziato

un'attività culturale che continua ancora oggi ad essere un importante fornitore di culture di

avviamento per l'industria lattiero-casearia, della carne, della birra, della panificazione e del vino.

- I ceppi di avviamento sono stati preparati dal produttore coltivando ceppi puri nel latte

sterilizzato a caldo

- aziende di cultura di avviamento mantengono uno staff di microbiologi altamente qualificati

- l'industria è dominata da un piccolo numero di grandi imprese

MFC per settore lattiero caseario

1. Colture starter

- coltura microbiologica che effettua effettivamente la fermentazione

- essenziale per tutti gli alimenti fermentati prodotti

Formaggio erborinato, pasta filata stagionata, formaggio feta, formaggio di media stagionatura,

stagionato formaggio, formaggio molle, burro..

Sterter per yogurt: (miscela di Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp

bulgaricus che converte il lattosio in acido lattico).

Tra i mo del latte si ha una protocoperazione, un mutualismo dove l’interazione è positiva per

entrambi: Lb fornisce a St peptidi e aa perché St ha una scarsa attività proteolitica, St che è più 3

ossigeno - tollerate, fornisce a Lb grazie all’attività ureasica, libera oltre che urea anche CO2,

rende anaerobico l’ambiente.

Entrambi traggono vantaggio ma spesso sulla base della selezione dei ceppi, il mutualismo

diventa sinergismo (1 + 1 = 3). Per ottenere sinergismo, si necessita di un’attenta selezione dei

ceppi.

2. Colture starter secondarie

- per la produzione di burro, formaggi stagionati, formaggi semiduri, panna fermentata,

formaggi a pasta molle

- essenziale per il sapore, la consistenza, l'aroma e la particolarità del formaggio

- direttamente inoculato nel latte di formaggio o spruzzato o spazzolato sulla superficie di fresco

formaggi stagionati

Batteri, muffe e lieviti, stafilococchi

3. Colture per maturazione delle croste

- per l'invecchiamento del formaggio

- per "personalizzare" la produzione del formaggio

- per migliorare la consistenza e il profilo organolettico

- per proteggere la superficie del formaggio dalla crescita di indesiderati microrganismi che

possono modificare l'aspetto esterno del formaggio.

es. proteggere la crosta da Lysteria monocytogenes uno tra i maggiori contaminanti della crosta

di Gorgonzola.

Queste colture possono inibire in modo competitivo i microrganismi patogeni che possono

apporsi sulla crosta.

- per ottenere un risultato visivo costante, sia dal punto di vista del colore che da quello la

consistenza della crosta

- mantenere e garantire il giusto sapore, il risultato di un equilibrio di diversi tipi di reazioni

enzimatiche

Esempi

Candida krusei + Kluiveromyces marxianus: per la maturazione del formaggio tipo Harzer.

Candida isolato da latte crudo, utilizzato per la produzione di formaggi del nord Europa (Austria).

Brevibacterium linens: Alotollerante: tolleranza al sale, sviluppo di un pigmento arancione,

aroma e sapore; mo aerobio, G+, con la forma che cambia in relazione alla fase di crescita (cocco

> bastoncino). Molto tollerante all’ossigeno; ha delle protesi extracellulari che producono

composti solforati (zolfo - metile - tioesteri) ed in particolare, questi composti solforati è il

metantiolo (responsabile dell’odore di piedi del formaggio).

[Alofilo: ha bisogno di sale per crescere, necessita di NaCl.]

Alotollerante: cresce a concentrazioni di sale ma non ha bisogno necessariamente.

Debaryomyces hansenii: alta attività proteolitica e lipolitica, neutralizzazione sulla

superficie del formaggio per l'assimilazione dell'acido lattico. Grazie all’attività proteolitica, si ha

una liberazione di ammoniaca che porta ad un innalzamento del pH del formaggio con

neutralizzazione dell’acido lattico formato dai mo in prima fase di maturazione.

È alotollerante, cresce

Viene utilizzato nei formaggi erboranti (tipicamente francesi) al posto di Saccaromyces cerevisiae 4

Kluiveromyces marxianus: applicato come coltura di superficie, per lo sviluppo di aromi,

per il controllo dello sviluppo di stampi indigeni, applicato per kefir. È lattosio positivo, sa

utilizzare il lattosio infatti ha la beta galattosidasi.

Il kefir è un consorzio di batteri lattici e batteri acetici e lieviti. Associazione sinergica dei mo. È in

grado di produrre i composti volatili come: esteri, chetoni, aldeidi e alcol.

Staphylococcus xylosus: per formaggi teneri, stagionatura e aroma. Microccoccacee,

anaerobio facoltativo, coagulasi negativo (un esoenzima) prodotto da mo coagulasi negativo.

Modifica il fibrinogeno in fibrina, portando la coagulazione del sangue. Ha una forte attività

lipolitica, quindi maturazione. Viene utilizzato anche nel settore carne. Ha come funzione la

riduzione dei nitrati in nitriti. Ed è catalasi positivo (va a decomporre l’acqua ossigenata) e va a

prevenire l’ossidazione dei lipidi. Alcuni producono anche delle batteriocine (anche contro

Staphylococcus aureus e Lysteria). Le concentrazioni di questo mo arrivano fino a 10 - 9 Log/g di

cellule vitali.

Si distingue dallo Staphylococcus aureus perché è coagulasi positivo.

Staphylococcus equorum: coagulasi negativo, inibizione della crescita della muffa: viene

utilizzato per inibire le muffe quei formaggi in cui non sono volute. Vene utilizzato per formaggi a

pasta dura (svizzeri)

Debaryomyces hansenii, Staphylococcus xylosus, Arthrobacter globiformis, Brevibacterium

linens, and Geotrichum candidum: mix commerciale, fornito al cliente sulla base dell’esigenza del

cliente. per un trattamento superficiale uniforme e controllato nella produzione di formaggio

pressato e molle dall'aspetto arancione

4. Colture per aromatizzazione e formazione delle occhiature

- Gruppo di colture aromatizzanti specificamente progettate per fornire più sapori al formaggio

- Per frenare lo sviluppo di qualsiasi NSLAB (Non Starter Lactic Acid Bacteria, una flora batterica

secondaria che è coinvolto nelle fasi di maturazione e maturazione del formaggio e non ha

alcuna influenza diretta sulla fase iniziale di acidificazione)

- Ridurre al minimo le variazioni di aroma dovute ad una crescita indesiderata

- Per il raggiungimento del livello desiderato di occhi nel prodotto finito

Esempi

Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc pseudomesenteroides: per la produzione di

gas > occhiature. Produce CO2. Talvolta produce batteriocine.

Batteri lattici eterofermentanti, anaerobi facoltativi. Per formaggi olandesi, si attivano durante la

terza fase di maturazione del formaggio perchè non utilizzano bene il lattosio che è abbondante e

quindi non si sviluppano all’inizio. Non hanno funzione principale quella di acidificare.

Appartengono a diverse nicchie, infatti si sono adattati a diverse nicchie (vegetale e lattiero

casearia) ha fatto si che hanno sviluppato un ampio spettro di proprietà biocatalitiche. Cosa che,

per es, St non ha perchè si è adattato all’interno del latte. Quindi l’adattamento all’interno del

latte ha portato questa specie a perdere i geni legati alla patogenicità e alla virulenza, tipici delle

specie di Streptococcus (S. pneumoniae). Infatti St viene definito regresso perchè ha perso tutti i

geni legati alla patogenicità tipici del genere Streptococcus ma ha guadagnato la sua migliore

adattabilità all’interno dell’ambiente latte, quindi la capacità di utilizzare il lattosio. Quindi ha

perso la patogenicità ed è molto adattato all’ambiente latte mentre i Leuconostoc si sono adattati

a diverse nicchie, quindi hanno un grosso spettro di azione e tante proprietà biocatalitiche. 5

Propionibacterium freudereichii: per il tipo di formaggio svizzero; fermenta lattosio e

lattato e produce anidride carbonica, acido propionico e acido acetico; acidi grassi a corta catena,

acidi grassi liberi che derivano dalla lipolisi del grasso del latte.

Resiste molto allo stress termico, tipico stress imposto per la produzione dell’Emmental. Cresce

anche a temperature di frigorifero quindi sviluppa l’aroma anche in conservazione.

Tutti i ceppi hanno queste attività ma vanno controllate queste attività a libello di ceppo. [La

selezione delle colture microbiche deve essere ceppo specifica].

Possono utilizzare oltre che il lattosio per fonte di energia, anche l’acido lattico e dal lattato

tornano a privato con produzione di ATP. Il privato può essere ossidato ad acetato + CO2 oppure

ridotto a dare propionato.

Resistente anche allo stress osmotico.

Lactococcus lactis spp. lactis biovar diacetylactis: per la fermentazione del citrato. Insieme

a St è una tra le colture più importanti nel settore lattiero caseario.

Dal citrato produce diacetile (aroma del burro), fondamentale per i prodotti lattiero caseari. Il

citrato viene trasportato tramite la citrato permeasi e scisso in acetato + ossalacetato da una

citrato liasi. L’ossalacetato diventata substrato dell’ossalacetato decarbossilasi che porta alla

produzione di CO2 e formazione di privato che porta alla formazione di alfa-aceto-lattato + CO2.

alfa-aceto-lattato subisce una decarbossilazione ossidativa a dare diacetile e decarbossilazione

non ossidativa a dare acetoino. È fondamentale che ci sia oltre al citrato anche l’ossigeno perchè

favorisce l’azione della alfa-aceto-lattato sintasi.

Essendo che i lactococchi producono diacetile, vengono anche chiamati aroma bacteria.

Enterococcus faecium: per esaltare il sapore del formaggio. Batterio lattico Gram +,

resistente al sale e cambiamenti di pH e temperatura. L’aroma di formaggio deriva dal

metabolismo primario della glicolisi e lipolisi e proteolisi della caseine.

Producono le batteriocine.

È sintomo di scarsa igiene perchè spesso derivano dall’intestino umano.

Si trova anche nel settore della carne

Lactobacillus fermentum: per formaggi con occhiature limitate (Cheddar, Emmentaler).

Viene utlizzato come starter per il caciocavallo silano. Può avere delle caratteristiche di probiotico.

Viene selezionato per la produzione di piccole occhiature ma anche per l’attività esterasica, aroma

fruttato nel formaggio.

Su cosa si basa la selezione ceppo - specifica? Si basa sulla selezione di mo con caratteristiche

fenotipiche ma nello specifico caratteristiche biochimiche e fisiologiche.

5. Colture per protezione

= preparati costituiti da microrganismi vivi (colture pure o concentrati di colture) aggiunti agli

alimenti allo scopo di ridurre i rischi derivanti da microrganismi patogeni o tossigeni.

- Anti-lievito e -Muffe, anti-Listeria monocytogenes, anti-Clostridi (per evitare il soffiaggio tardivo

e l'odore sgradevole), anti altri microrganismi di deterioramento

- Fermenti per la protezione contro i microrganismi inquinanti di yogurt, latte fermentato,

formaggi freschi, semiduri e a pasta dura, senza lasciarli interferire con le colture autoctone o le

colture altrimenti utilizzate nella produzione. Non devono competere con gli starter, loro 6

devono essere autonomi. Quindi non devono rubare le fonti di carbonio ai microrganismi

fermentativi.

- Le colture aiutano a controllare e proteggere il prodotto da alterazioni e migliorare la

conservabilità

- Possono essere utilizzati in prodotti con indicazioni "clean label" perché caratterizzati da una

bio-protezione naturale

- I fermenti selezionati non acidificano, né alterano le caratteristiche organolettiche del prodotto

e si adattano facilmente anche alle temperature di refrigerazione (es. Carnobacterium spp.

Carnobacterium divergens; Carnobacterium maltaromaticum)

Inibiscono Lysteria a dare acido lattico (conservante) e producendo batteriocine.

L'efficacia delle colture protettive si basa sui seguenti principi:

1. Esclusione concorrenziale, ad esempio attraverso la concorrenza per le sostanze nutritive e/o i

siti di legame sul substrato, o attraverso un migliore adattamento al contenuto di ossigeno

2. Formazione di sostanze antagonisticamente attive, ad es. con acidi organici lactobacilli (e. g.

lattici, acetici, propionici, formici, acido benzoico), etanolo, H2O2, CO2, batteriocini (peptidi

sintetizzati ribosomali, proteine e composti polipeptidici come Nisin) nonché antibiotici o altri

principi antagonisticamente attivi con attività antimicotica o antibatterica

Piccolina prodotta da maltaromaticum; Diviricina prodotta da divergens

Lieviti

Costituiscono un gruppo separato di culture che sono indubbiamente cruciali per alcuni prodotti

del settore lattiero-caseario.

Il loro contributo è essenziale per creare la giusta struttura e sapore di un formaggio o di un latte

fermentato

Spesso la loro azione deve evolvere in un delicato coordinamento con altri microrganismi presenti

nella produzione, conferendo al prodotto finito le sue caratteristiche tipiche

Garantire uno sviluppo controllato di CO2

Per la produzione di formaggi erborinati, come il Gorgonzola

Saccharomyces spp, Saccharomyce cerevisiae, Debariomyces hansenii, Kluyveromyces lactis,

Kluyveromyces marxianus, Candida utilis (degradazione del lattato, neutralizzazione della cagliata,

con