Clonazione e MAnipolazione DNA

La Clonazione

È l'amplificazione di una sequenza di DNA in vitro e richiede:

• un seguenza, da amplificare.
• un vettore, ossia una molecola di DNA in grado di contenere al suo interno la sequenza da amplificare. Il vettore contenente la sequenza prende il nome di DNA Ricombinante.

Enzimi

Sono delle molecole proteiche, permettono la duplicazione del DNA ricombinante. I principali sono;

1. Enzimi di restrizione: tagliano le varie sequenze del DNA in segmenti, in modo tale che le estremità siano adatte ad unirsi al momento dell'inserimento all'interno di un vettore.
2. Ligasi: è un enzima che tagliamo il vettore e lo richiude, permettendo di introdurre la sequenza di DNA plasmidico tagliata precedentemente nella cellula ospite.
3. DNA Polimerasi: un enzima che permette la sintesi di un nuovo filamento.

Vettori

Una molecola di DNA deve avere precise caratteristiche per fungere da vettore:

• un originario deve essere in grado di autoplicarsi e mantenersi dopo l'entrata nella cellula ospite,
• deve essere abbastanza grande da ospitare la sequenza da vary ma al tempo stesso abbastanza piccolo da entrare nel vettore.

Esistono vari tipi di tecnologia di DNA che rispondono a questi requisiti: i plasmidi e i cromosomi dei batteriofagi.

Plasmidi

Sono una piccola molecola di DNA circolare a doppio filamento, contenuta in una cellula batterica. Solitamente contiene geni che conferiscono caratteristiche di resistenza agli antibiotici.

• hanno una origine di replicazione che può riprodurse indipendentemente dal cromosoma batterico.

Batteriofagi

Vengono comunemente noti come "fagi".

La Clonazione

È un'amplificazione di una sequenza di DNA in vitro e richiede:

• un segmento da amplificare,
• un vettore, ossia una molecola di DNA in grado di contenere al suo interno il segmento da amplificare. Il vettore contenente la sequenza prende il nome di DNA Ricomb.

Vettore

Il vettori più comunemente usati, che permettono la duplicazione dei DNA ricombinate, vengono usati in molti protocolli sperimentali:

• Scelta preparazione dei vettori
• Preparazione del frammento di DNA da clonare
• Utilizzo dello stesso enzima di restrizione per tagliare il vettore e lo stesso segmento di DNA
• Introduzione dell'elemento in una cellula ospite per ottenere la crescita e amplificazione
• Uso della cellula ospite per ottenere la produzione del prodotto
• Selezione del marcatore prodotto dal frammento che abbiamo introdotto

Vettori

Una molecola di DNA deve avere poche caratteristiche per fungere da vettore:

• ricombinante deve essere in grado di autoproletaro anteriormente dalla cellula ospit
• inserto abbiano origine del ospite
• ottenere DNA

In generale, per clonazione, si usano 2 tipi di molecole di DNA che rispondono a questi requisiti: i plasmidi e i cromosomi dei batteriofagi.

Plasmidi

Piccoli anelli di DNA circolare doppio filamento che contengono una cellula batterica.

• Marco di resistenza, ossia gene che impedisce l'espressione genica.
• Hanno origine con una funzione specifica che permette loro di duplicarsi.
• Non vengono usualmente, di solito contengono uno o più geni che permettono l'individuazione delle cellule trasformate.

Batteriofagi

Comunemente noti come fagi, sono un virus che presentano una struttura del DNA lineare a doppio filamento di DNA associato con proteine di membrana (l'acido nucleico).

• Testa costituita da proteine
• Coda che permette alle particelle virali di attaccarsi alle cellule

perché l'elasticio di nuovi fagì é associato con una stessa cellula batterica.

Alcuni virus, definiscono anche ciclo detto litico, comincia caratterizzato dal

compare anche per inutilità, senza temperatura, rimane una cellula, formando detta ciclo lisogenico.

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assistor vivo. Induzione fare un altro dei fagi anche di seguito.

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• plasmidi o dei geo, e pianoforte;
• DNA genomico
• DNA Plasmidico
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