Microbiologia - ingegneria genetica e clonazione

Ingegneria genetica

Modificazione dell'ingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico.

Ricerca di base

Purificare, esprimere, amplificare geni. Utilizzata in ricerca applicata/commerciale (biotecnologie): sviluppo di microrganismi ingegnerizzati per la produzione di specifiche sostanze (ormoni, vaccini, farmaci, proteine).

Clonaggio di un gene

Per poter manipolare un gene è necessario clonarlo: isolarlo, purificarlo e farlo esprimere (ovvero tradurlo in un sistema più comprensibile per l'operatore).

Strumenti dell'ingegneria genetica

• Vettori di clonaggio: Utilizzati per portare le sequenze di DNA in batteri ricettivi e per amplificare la sequenza desiderata. Sono i plasmidi che servono per inserire DNA esogeno al loro interno e al tempo stesso essere in grado di replicarsi nella cellula ospite. I vettori plasmidici sono pUC, pBR 322, pGEM e sono formati da circa 20 Kb; i batteriofagi, come lambda, costituiti da circa 25 Kb; cosmidici costituiti fino a 45 Kb.
• Enzimi di restrizione: Servono per tagliare in modo riproducibile il DNA da amplificare in punti precisi allo scopo di inserirlo nei vettori (sono le endonucleasi di restrizione). Riconoscono sequenze specifiche di DNA che sono rappresentate da 4-5 basi e tagliano solo quando ci sono questi indicatori. I siti di taglio sono specifici e si hanno solo in presenza di una sequenza di 5 basi.
• DNA ligasi: È il processo inverso in grado di unire molecole lineari di DNA riformando l'unità della catena nucleotidica.

Vettori di clonaggio

• Piccole, ben caratterizzate molecole di DNA;
• Contengono almeno un sito d'inizio (ori) di replicazione nell'ospite prescelto;
• Contengono uno o più geni che ne consentano l'identificazione;

Plasmidici

• Replicano indipendentemente;
• Piccole dimensioni;
• DNA circolare (stabile durante la manipolazione);
• Multiple copie per cellula;
• Trasportano geni per la resistenza agli antibiotici;
• Introdotti in batteri mediante trasformazione/elettroporazione (costosa, solo per alcuni batteri);
• Rimosso operone tra;
• Siti per azione endonucleasi di restrizione (siti di taglio per gli enzimi, detto sito di policlonaggio – multiple cloning site). Danno le estremità a cui far aderire il DNA da clonare.

Gli enzimi di restrizione (endonucleasi): riconoscono una sequenza sito specifica nelle molecole di DNA se:

• Taglio sfalsato nella molecola di DNA generano estremità coesive (sticky ends); è più facile l'inserimento;
• Taglio non sfalsato nella doppia elica di DNA generano estremità piatte (blunt ends); non c'è l'appaiamento delle basi e il plasmide non tende a richiudersi. L'opera delle ligasi è più complicata.

Clonaggio del gene

Un gene non viene manipolato direttamente (per esempio un gene costituisce lo 0.05% del genoma E. coli), ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la quantità e facilitarne la manipolazione >> clonaggio.

1. Isolamento e frammentazione DNA.
2. Introdurre frammento desiderato.
3. Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio.
4. Identificare e purificare il clone desiderato.
5. Produrre grandi quantità di gene clonato per studiarlo.

L'uso di enzimi di restrizione non è sufficiente per clonare un gene. Quando le sticky o blunt ends create dagli enzimi di restrizione sono allineate, si formeranno solo dei legami idrogeno tra le basi appaiate e non saranno sufficienti a mantenere l'integrità del DNA. È necessario ricostruire la continuità dello scheletro della molecola di DNA utilizzando una DNA ligasi.

Trasformazione e selezione

Dopo aver ottenuto il DNA ricombinante, si amplifica introducendolo in un ospite adeguato: l'introduzione avviene mediante trasformazione in un ospite batterico (E. coli). Poi si deve rendere le cellule competenti (mediante trattamento chimico o shock termico).

Problemi → bassa efficienza → falsi positivi: cellule trasformate da plasmidi circolarizzati ma senza inserto. Selezionare cloni con frammento di DNA clonato utilizzando un marker che abbia una certa resistenza all'antibiotico.

Creazione e screening di una libreria

Abbiamo inserito un segmento di DNA in un vettore di clonaggio o espressore: abbiamo trasformato e piastrato dei batteri. Come identifichiamo tra tutte le colonie ottenute quella che esprime il segmento di DNA (gene) che ci interessa?

• Ibridizzazione delle colonie con probe di DNA marcato con radioattivo (P³²).
• Screening immunologico per la proteina prodotta.
• Screening enzimatico per l'attività della proteina.

Strategia per clonare segmento DNA da cellula procariotica

1. Estrazione DNA > frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) >> identificare segmento di interesse >>> clonaggio.
2. Frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) DNA >> clonare tutti i frammenti (libreria) >>> identificare il gene giusto.
3. Sintetizzare il frammento di DNA desiderato (RT-PCR) > clonaggio nell'opportuno vettore.

Strategia per clonare sequenza di DNA da cellula eucariotica

I geni delle cellule eucariote contengono "esoni" (sequenze non codificanti di DNA) >> non è possibile procedere direttamente con la clonazione come avviene per procarioti.