Microbiologia - ingegneria genetica e clonazione

Gli enzimi di restrizione (endonucleasi): riconoscono una sequenza sitospecifica nelle molecole di

DNA se:

- taglio sfalsato nella molecola di DNA generano estremità coesive (stikcy ends); è più facile

l’inserimento;

- taglio non sfalsato nella doppia elica di DNA generano estremità piatte (blunt ends); non c’è

l’appaiamento delle basi e il plasmide non tende a richiudersi. L’opera delle ligasi è più

complicata.

Un gene non viene manipolato direttamente (per esempio un gene costituisce lo 0.05% del genoma

E. coli), ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la quantità e facilitarne la

manipolazione >>clonaggio.

1) Isolamento e frammentazione DNA.

2) Introdurre frammento desiderato.

3) Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio.

4) Identificare e purificare il clone desiderato.

5) Produrre grandi quantità di gene clonato per studiarlo.

L’uso di enzimi di restrizione non è sufficiente per clonare un gene.

Quando le sticky o blunt ends create dagli enzimi di restrizione sono allineate si formeranno solo

dei legami idrogeno tra le basi appaiate e non saranno sufficienti a mantenere l’integrità del DNA.

È necessario ricostruire la continuità dello scheletro della molecola di DNA utilizzando una DNA

ligasi.

TRASFORMAZIONE E SELEZIONE

Dopo aver ottenuto il DNA ricombinante, si amplifica introducendolo in un ospite adeguato:

l’introduzione avviene mediante trasformazione in un ospite batterico (E. coli).

Poi si deve rendere le cellule competenti (mediante trattamento chimico o shock termico).

Problemi → bassa efficienza

→ falsi positivi: cellule trasformate da plasmidi circolarizzati ma senza inserto.

Selezionare cloni con frammento di DNA clonato utilizzando un marker che abbia una certa

resistenza all’antibiotico.

CREAZIONE E SCREENING DI UNA LIBRERIA

Abbiamo inserito un segmento di DNA in un vettore di clonaggio o espressore: abbiamo

trasformato e piastrato dei batteri.

Come identifichiamo tra tutte le colonie ottenute quella che esprime il segmento di DNA (GENE)

che ci interessa?

 32

Ibridizzazione delle colonie con probe di DNA marcato con radioattivo (P ).

 Screening immunologico per la proteina prodotta.

2

 Screening enzimatico per l’attività della proteina.

STRATEGIA PER CLONARE SEGMENTO DNA DA CELLULA PROCARIOTICA

1) Estrazione DNA > frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) >>

identificare segmento di interesse >>> clonaggio.

2) Frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) DNA >>clonare tutti i

frammenti (libreria) >>> identificare il gene giusto.

3) Sintetizzare il frammento di DNA desiderato (RT-PCR) > clonaggio nell’opportuno vettore.

STRATEGIA PER CLONARE SEQUENZA DI DNA DA CELLULA EUCARIOTICA

1) I geni delle cellule eucariote contengono “esoni” (sequenze non codificanti di DNA) >> non è

possibile clonare geni attraverso semplice digestione del DNA.

2) Isolato mRNA di interesse > trasformato in dsDNA (cDNA) (transcriptasi inversa) >>

amplificato con RT-PCR >>> clonato. 3

RT-PCR

 Possibilità di amplificare in vitro il numero di copie di una molecola di un segmento di DNA >

Clonare – sequenziare – mutagenesi – diagnostica

 Utilizza enzimi detti DNA –polimerasi che sintetizzano un frammento di DNA partendo da

una regione a doppia elica (primer).

E. coli 37°C con proof reading (il primer si può attaccare dappertutto)

TAQ 72°C senza proof reading (non è in grado di polimerizzare e poi di controllare se ha

commesso errori)

Pfu 72/75°C con proof reading (polimerizza e controlla se ha sbagliato l’inserimento di

nucleotidi) –ha un costo elevato-

Ciclo PCR :

- denaturazione DNA a doppia elica (80°C): i ciclatori hanno sblocchi in cui avviene la

denaturazione.

- appaiamento primer al template di DNA (40 – 70°C)

- estensione ad opera della polimerasi (37°C)

Questo è un processo esponenziale per cui il numero di copie del gene viene amplificata 2-4-8-16-

… in maniera progressiva. Viene copiata quella parte di DNA in cui la DNA polimerasi ha trovato

l’innesco. Servono primer specifici per le varie regioni.

Il gene amplificato può essere introdotto direttamente in un vettore di clonaggio ed essere poi

inserito nella fase successiva di trasformazione e amplificazione. Viene evitato il processo di

screening: siamo già partiti dal gene che ci interessava.

SCELTA DEI VETTORI DI CLONAGGIO

Un vettore di clonaggio è un elemento genetico al cui interno i geni possono essere ricombinati e

replicati.

Plasmide optimum 10 Kb.

 Per frammenti più larghi: batteriofago λ o cosmidi.

 Per sequenziare: batteriofago M13 (E. coli e salmonella) è un virus batterico a singolo filamento

 che gli conferisce notevoli vantaggi per il sequenziamento.

Yeast artificial chromosome: vettori per lieviti 200-400 Kb.

 Virali (per cellule eucariote): SV40; adenovirus; baculovirus (cellule insetto); retrovirus.



STRUTTURA DEL PLASMIDE Pbr322

Piccolo 4-3 Kb.

 Stabile in E. coli.

 Alto numero copie/cellule.

 Facile da isolare.

 Possibilità di inserire sino a 10 Kb.

 Completamente sequenziato.

 4

Singoli siti di clonaggio, ci sono i siti di taglio per enzimi diversi.

 Geni per antibiotico resistenze: il plasmide presenta resistenza alle penicillina e alle tetracicline.

 Facilmente trasformabile

 Non c’è operone tra



CARATERISCTICHE PLASMIDE PER CLONARE DNA

1. Piccole dimensioni;

2. Singoli siti per endonucleasi di restrizione;

3. Markers per identificare le cellule che contengono il contenuto.

COSMIDI

Vettori di clonaggio che possono clonare segmenti di DNA più larghi, fino a 40 Kb; e possono

essere mantenuti sotto forma di plasmidi ( circolare), ma anche sotto forma di fagi. Si utilizzano

.

solo le estremità della struttura del batteriofago Sono delle estremità COS (nel genoma del fago

) e contengono dei segnali per l’impaccamento del DNA nella testa del fago. Quando il materiale

genico viene introdotto in queste strutture viene replicato; tra un segmento e l’altro ci saranno le

sequenze COS che ne consentono l’introduzione nella testa del fago. Per cui vi saranno due

estremità COS.

SCELTA DELL’OSPITE PER IL CLONAGGIO

* Cellule procariote + facili da manipolare / poco costose / crescono rapidamente.

E. coli - difficili trasformare (di solito si riesce ad eliminare) / potenzialmente

patogene / produce endotossine / ritiene proteine.

B. subtilis - instabilità plasmidica / elimina DNA estraneo.

* Cellule eucariote - facili da manipolare.

S.cerevisiae è cellula di lievito che presenta una serie di problemi, cellule mammifero, cellule

insetto.

VETTORI DI ESPRESSIONE

 Vettori di clonaggio che contengono delle sequenze regolatorie per garantire la trascrizione e

la traslazione (possibilmente in maniera regolata) di un gene.

 Possono essere impiegati sia in cellule procariote che eucariote.

Nella scelta del vettore da utilizzare si deve valutare:

1. Numero copie vettore per cellula;

2. Tipo promotore e sua attività / possibilità regolarlo;

3. Segnali di inizio trascrizione;

4. Stabilità peptidi prodotti. 5