Microbiologia - ingegneria genetica e clonazione

Trasformazione e selezione

Dopo aver ottenuto il DNA ricombinante, si amplifica introducendolo in un ospite adeguato: l'introduzione avviene mediante trasformazione in un ospite batterico (E. coli). Poi si deve rendere le cellule competenti (mediante trattamento chimico o shock termico). Problemi → bassa efficienza → falsi positivi: cellule trasformate da plasmidi circolarizzati ma senza inserto. Selezionare cloni con frammento di DNA clonato utilizzando un marker che abbia una certa resistenza all'antibiotico.

Creazione e screening di una libreria

Abbiamo inserito un segmento di DNA in un vettore di clonaggio o espressore: abbiamo trasformato e piastrato dei batteri. Come identifichiamo tra tutte le colonie ottenute quella che esprime il segmento di DNA (GENE) che ci interessa? - Ibridizzazione delle colonie con probe di DNA marcato con radioattivo (P32). - Screening immunologico per la proteina prodotta. - Screening enzimatico per l'attività della proteina.

proteina.

STRATEGIA PER CLONARE SEGMENTO DNA DA CELLULA PROCARIOTICA

1. Estrazione DNA > frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) >>identificare segmento di interesse >>> clonaggio.
2. Frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) DNA >>clonare tutti i frammenti (libreria) >>> identificare il gene giusto.
3. Sintetizzare il frammento di DNA desiderato (RT-PCR) > clonaggio nell’opportuno vettore.

STRATEGIA PER CLONARE SEQUENZA DI DNA DA CELLULA EUCARIOTICA

1. I geni delle cellule eucariote contengono “esoni” (sequenze non codificanti di DNA) >> non è possibile clonare geni attraverso semplice digestione del DNA.
2. Isolato mRNA di interesse > trasformato in dsDNA (cDNA) (transcriptasi inversa) >> amplificato con RT-PCR >>> clonato.
3. RT-PCR Possibilità di amplificare in vitro il numero di copie di una molecola di un segmento di DNA > Clonare –

sequenziare – mutagenesi – diagnostica

Utilizza enzimi detti DNA –polimerasi che sintetizzano un frammento di DNA partendo da una regione a doppia elica (primer).

E. coli 37°C con proof reading (il primer si può attaccare dappertutto)

TAQ 72°C senza proof reading (non è in grado di polimerizzare e poi di controllare se ha commesso errori)

Pfu 72/75°C con proof reading (polimerizza e controlla se ha sbagliato l’inserimento di nucleotidi) – ha un costo elevato

Ciclo PCR :

• denaturazione DNA a doppia elica (80°C): i ciclatori hanno sblocchi in cui avviene la denaturazione.
• appaiamento primer al template di DNA (40 – 70°C)
• estensione ad opera della polimerasi (37°C)

Questo è un processo esponenziale per cui il numero di copie del gene viene amplificata 2-4-8-16-… in maniera progressiva. Viene copiata quella parte di DNA in cui la DNA polimerasi ha trovato l’innesco. Servono primer specifici per le

varie regioni. Il gene amplificato può essere introdotto direttamente in un vettore di clonaggio ed essere poi inserito nella fase successiva di trasformazione e amplificazione. Viene evitato il processo di screening: siamo già partiti dal gene che ci interessava. SCELTA DEI VETTORI DI CLONAGGIO Un vettore di clonaggio è un elemento genetico al cui interno i geni possono essere ricombinati e replicati. Plasmide optimum 10 Kb. - Per frammenti più larghi: batteriofago λ o cosmidi. - Per sequenziare: batteriofago M13 (E. coli e salmonella) è un virus batterico a singolo filamento che gli conferisce notevoli vantaggi per il sequenziamento. Yeast artificial chromosome: vettori per lieviti 200-400 Kb. Virali (per cellule eucariote): SV40; adenovirus; baculovirus (cellule insetto); retrovirus. STRUTTURA DEL PLASMIDE Pbr322 Piccolo 4-3 Kb. - Stabile in E. coli. - Alto numero copie/cellule. - Facile da isolare. - Possibilità di inserire

sino a 10 Kb.

Completamente sequenziato.

4 Singoli siti di clonaggio, ci sono i siti di taglio per enzimi diversi.

Geni per antibiotico resistenze: il plasmide presenta resistenza alle penicillina e alle tetracicline.

Facilmente trasformabile

Non c'è operone tra

CARATERISCTICHE PLASMIDE PER CLONARE DNA

1. Piccole dimensioni;
2. Singoli siti per endonucleasi di restrizione;
3. Markers per identificare le cellule che contengono il contenuto.

COSMIDI

Vettori di clonaggio che possono clonare segmenti di DNA più larghi, fino a 40 Kb; e possono essere mantenuti sotto forma di plasmidi (circolare), ma anche sotto forma di fagi. Si utilizzano solo le estremità della struttura del batteriofago Sono delle estremità COS (nel genoma del fago) e contengono dei segnali per l'impaccamento del DNA nella testa del fago. Quando il materiale genico viene introdotto in queste strutture viene replicato; tra un segmento e l'altro ci saranno

Le sequenze COS che ne consentono l'introduzione nella testa del fago. Per cui vi saranno due estremità COS. SC

Segnali di inizio trascrizione;

4. Stabilità peptidi prodotti. 5PROMOTORE* Requisito cruciale per il funzionamento di un sistema di espressione è la presenza di un forte eregolabile promotore.>>>regione (estremità 3' di un gene) regola l'efficienza / frequenza con cui un gene viene trascritto(lega RNA - polimerasi) nei batteri è generalmente costituita da un promotore e da un operatore.* * Problemi >> promotori di E. coli sono debolipromotore di cellule eucariote forti non funziona in batteriporre il gene sotto controllo promotore sempre attivo può essere negativo e puòcausare deficit energetici o tossica da accumulo .promotore ideale efficiente / attività regolabile dallo sperimentatore.LacTacTrpPLBatteriofago T7 >> promotore fago T7 e fago T7 RNA polimerasi.

SEGNALI DI INIZIO TRASCRIZIONENei procarioti il ribosoma si lega ad una specifica sequenza ( Shine - Delgarno) seguita da uno startcodon;

c'è un'adeguata reading frame.
STABILITÀ PROTEINE SINTETIZZATE

• Degradate;
• Tossiche se si accumulano nel citoplasma;
• Non vengono secrete.

Fondere una proteina con una CODA codificata dal vettore:

• Stabilizzi la proteina;
• Faciliti la purificazione;
• Segnale per secrezione.

PROBLEMI ASSOCIATI ALL'USO DI PROCARIOTI PER L'ESPRESSIONE DI PROTEINE DI ORIGINE EUCARIOTICA:

• Instabilità proteine sintetizzate/difficoltà secrezione;
• Contaminanti potenzialmente pericolosi (tossici);
• Assenza di attività biologica modificazioni post-traslazionali cellule eucariote:
• Ponti disolfuro;
• Rimozione proteolitica di frammenti;
• Glicosilazione (O-linked ser/tre; N-linked aspar);
• Modificazione di residui AA (acetilazione/metilazione/sulfatazione/fosforilazione).

Sistema di espressione in cellule eucariotiche.
Questi sistemi necessitano di:

1. Promotore per cellule eucariotiche;
2. Marker selezionabile;
3. Sequenza chesegnala poly A nell'mRNA formato; sequenza di inserzione ed origine di replicazione.S. CEREVISIAE Organismo unicellulare facile da far crescere in larga scala; Genoma ben conosciuto; Promoter potenti e ben caratterizzati; Capace di eseguire diverse modificazioni post-traslazionali; Secerne poche proteine non interferendo con purificazioni; Sicuro.Problematiche: perdita plasmidi; iperglicosilazione proteine; accumulo citoplasmatico proteine da secernere.Trasformare i lieviti mediante: rimuovere parete cellulare trattare con acetato di litio elettroporazione 7APPLICAZIONI INGEGNERIA GENETICA1. Fermentazioni microbiche (microrganismi modificati vengono utilizzati su scala industriale perla produzione di sostanze);2. Vaccini;3. Produzione proteine;4. Creazione di piante e animali transgenici;5. Controllo inquinamento;6. Terapia genica (possibilità di somministrare geni a scopo terapeutico);7. Diagnostica (infettiva e non).Tutti gli

   antibiotici derivano da batteri e funghi purificati: le colture dei batteri rilasciano grandiquantità di questi prodotti.

   COLTURE BATTERICHE

   Mediante l'ingegneria genetica si manipolano microrganismi.

   • Aumentare la produzione o produrre molecole opportunamente modificate: antibiotici, endonucleasi di restrizione.
   • Alterare pathway metabolici per ottenere maggiori quantità: acido ascorbico; coloranti; aminoacidi; biopolimeri. Agendo su sistemi di controllo si selezionano batteri in grado di dare questi prodotti.

   PRODUZIONE PROTEINE PER VACCINI

   Problemi legati ai vaccini tradizionali:

   • Agente infettivo problematico da produrre in coltura;
   • Quantità limitata;
   • Misure di sicurezza complesse/costose;
   • Rischio di incompleta inattivazione agente infettivo;
   • Possibile riacquisizione fenotipo "wild";
   • Problemi stoccaggio/emivita;
   • Vaccini tradizionali inefficaci.

   Esempio: Il vaccino per l'epatite B è basato sulla somministrazione di

   parto) e con l'ormone luteinizzante (coinvolto nella regolazione del ciclo mestruale). La produzione di questi ormoni ricombinanti ha rivoluzionato il campo della medicina, consentendo di trattare con successo diverse patologie legate a deficit ormonali.