Citologia, istologia, embriologia

Citologia

Capitolo 1 - Procarioti

Procarioti: organismi monocellulari, dotati di membrana plasmatica e parete cellulare. Non hanno nucleo, il DNA è sparso nel citoplasma. Sono batteri e archea.

Teorie sull'origine della cellula eucariotica

Teoria dell’inglobamento: associazione simbiotica di un archeobatterio con un eubatterio che porta alla formazione di un protomitocondrio.

Teoria della fusione: archea + batterio forma protocellula eucariotica che ingloba un altro batterio e forma il protomitocondrio.

Archeobatteri e eucarioti

Archeobatteri: anaerobi obbligati, usano H come fonte di energia e CO₂ come fonte di carbonio producendo metano.

Eucarioti: organismi mono/pluricellulari, membrana plasmatica esterna e DNA nel nucleo, insieme agli organelli cellulari è immerso nel citoplasma: animali, funghi, piante, protisti.

Organismi specifici

Protozoi (uni): attraverso la luce solare sintetizzano molecole biologicamente attive.

Lieviti: producono antibiotici.

Virus

Virus: oggetti biologici infettivi; possono riprodursi e mutare il genoma; necessitano obbligatoriamente di infettare una cellula ospite per poter sintetizzare le proprie proteine e replicare il proprio materiale genetico. Si dividono in virus DNA, RNA, dei batteri o batteriofagi; sono costituiti da un rivestimento proteico capside che racchiude il materiale genetico.

Capitolo 2 - Tecniche studio tessuti per MO

Preparazione dei tessuti

Preparazione dei tessuti utilizzata per il microscopio ottico: Poiché i tessuti si degradano vengono trattati con fissativi: formalin (soluzione acquosa di formaldeide 37%). Dopo la fissazione i campioni vengono disidratati immergendoli in etanolo a concentrazione crescente. Viene trattato con un solvente (xilene) per l’infiltrazione del tessuto con il mezzo indurente (portato a fusione: paraffina). Una volta raffreddato, il blocco di paraffina con campione viene sezionato con un microtomo. Le sezioni vengono adagiate su acqua calda per distenderle completamente. Viene trasferito sul vetro portaoggetto e fatto asciugare; per essere colorato deve essere tolto il mezzo indurente con etanolo a concentrazione decrescente e sciacquato in acqua. Quando il campione non si può tagliare con microtomo viene congelato e tagliato con criostato.

Colorazioni

Le più comuni colorazioni sono combinazioni di coloranti acidofili (con sostanze acide come ematossilina, le componenti acidofile di un tessuto sono dotate di cariche + libere) e basofili (“eosina” - “). Molte tecniche di colorazione dei tessuti servono per evidenziare sostanze chimiche prodotte dalle cellule come: polisaccaridi, lipidi, enzimi e acidi nucleici. Tra queste abbiamo:

• La reazione all’acido periodico e reattivo di Schiff (PAS) utilizzata per mettere in evidenza i polisaccaridi, trattamento preliminare con acido periodico che porta alla formazione di gruppi aldeidici che reagiscono con il reattivo di Schiff portando al colore magenta.
• Reazione di Feulgen: specifica per cromosomi in mitosi e per il DNA contenuto nel nucleo che si colora in rosso porpora mentre, nucleolo e citoplasma rimangono incolore.
• Colorazione di Alcian: permette di evidenziare specifici componenti della matrice extracellulare.

Immunofluorescenza

Serve per individuare più precisamente la composizione chimica della cellula introducendo anticorpi legati a fluorocromi.

Immunofluorescenza diretta: sezioni istologiche trattate con anticorpi policlonali marcati con sostanze fluorescenti con intensità del segnale bassa.

Indiretta: segnale più forte grazie all’aumentata emissione di fluorescenza legando all’anticorpo primario uno o più anticorpi secondari marcati.

La microscopia a fluorescenza permette di evidenziare il DNA nucleare (in blu), microtubuli (verde), filamenti di actina (rosso).

Immunocitochimica e ibridazione in situ

Immunocitochimica: usata per la ricerca e diagnosi di patologie, utilizza anticorpi diretti contro marcatori specifici di alcuni tumori, in modo da diagnosticare la presenza del tumore e la sua diffusione attraverso la metastasi.

Ibridazione in situ: complementazione delle sequenze tra RNA e DNA a singolo filamento con altre molecole = molecola ibrida a doppio filamento.

Microscopio ottico composto

Costituito da un sistema di lenti che ingrandiscono l’immagine in modo che il nostro occhio possa vederlo. La sorgente luminosa è una lampada a luce bianca, vi sono due sistemi di lente: oculare e obiettivo. Un ripiano per il vetrino si trova in corrispondenza di un foro da dove passa la luce. Il limite di risoluzione dipende dalla lunghezza d’onda della luce, apertura angolare delle lenti e indice di rifrazione del mezzo.

Microscopia a contrasto di fase

Utilizzata per osservare una cellula viva, sfrutta il principio del contrasto di fase: i raggi di luce che attraversano il campione subiscono dei rallentamenti e quindi un cambiamento di fase e luminosità; il campione presenterà aree chiare/scure su sfondo illuminato uniformemente.

Microscopia a fluorescenza

Usa la luce monocromatica per stimolare la fluorescenza nel campione. Inviando un raggio di luce blu sul campione, si provoca l’emissione di una luce verde che ha lunghezza d’onda maggiore della blu. Questo microscopio è dotato di un filtro di eccitazione posto tra la sorgente di luce e il condensatore e trasmette solo luce di una certa lunghezza d’onda. Il condensatore concentra la luce sul campione. Sia la luce di eccitazione, sia quella emessa dal campione, prima di arrivare all’obiettivo, incontrano un filtro di sbarramento che fa passare solo le lunghezze d’onda di emissione che formano l’immagine finale.

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

Utilizza come sorgente luminosa un fascio di elettroni con lunghezza d’onda più piccola di quella della luce, risoluzione più elevata. Il fascio arriva al campione passando all’interno di un contenitore con il vuoto. Il microscopio è fornito da lenti magnetiche che creano un campo elettromagnetico con cui gli elettroni si localizzano sul campione. L’immagine è dovuta alla presenza nel campione di zone opache agli elettroni. Il fascio di elettroni colpisce uno schermo fluorescente proiettando su di esso un’immagine in bianco e nero reale e ingrandita. Le componenti cellulari possono essere osservate al TEM usando la tecnica dell’ombreggiatura: il campione viene adagiato su uno strato di mica e “ombreggiato” ricoprendolo con atomi di metallo pesante. Si forma una replica che viene rivestita con atomi di carbonio per stabilizzarla, trattata con acido che elimina la parte organica del campione e osservata al TEM.

Microscopia elettronica a scansione (SEM)

Per ottenere informazioni morfologiche compositive e strutturali delle parti del campione. Si ottengono immagini 3D da elettroni deviati dalla superficie esterna del campione. Il sistema del vuoto e la sorgente di elettroni sono uguali al TEM. Gli elettroni emessi sono catturati da un rivelatore che consiste di uno scintillatore che emette fotoni di luce. I fotoni generano un’immagine visibile al monitor.

Capitolo 3 – Acqua

Ricopre ¾ del pianeta e costituisce il 95% del peso corporeo. Coinvolta in numerose reazioni chimiche, è il solvente universale, ha una struttura triangolare con due atomi di H legati all’O con angolo 104° = molecola polare. Le sue molecole formano una rigida struttura cristallina.

Acidi e basi

Le molecole dell’acqua presentano una debole tendenza a ionizzarsi formando ioni idrossido (H-) o ioni H+. Gli acidi liberano H+. Le basi accettano H+.

Carboidrati

Queste molecole rientrano in 4 categorie:

• Monosaccaridi: glucosio presente in tutte le cellule, prodotto nelle piante verdi tramite fotosintesi, principale fonte di energia, esiste lineare o ad anello. Glucosio e fruttosio sono esosi C₆H₁₂O₆, ribosio e desossiribosio sono pentosi C₅H₁₀O₅ e sono i costituenti dello scheletro di DNA e RNA.
• Disaccaridi: l’unione di due monosaccaridi è detta “reazione di condensazione” in cui due molecole si uniscono con la perdita di una molecola d’acqua.
• Polisaccaridi: enormi catene di monosaccaridi legati da legami glicosidici: amido e cellulosa.

Lipidi

Gruppo eterogeneo di composti idrocarburici, sono insolubili in acqua a causa della presenza di legami covalenti apolari, ma solubili in altri lipidi. Agiscono da riserva energetica. Esempi: carotenoidi, glicerolo e steroidi.

Fosfolipidi: costituiti da una molecola di glicerolo a cui sono legati acidi grassi. Costituenti fondamentali delle membrane biologiche.

Carotenoidi: assorbono la luce in piante e animali.

Steroidi: composti organici costituiti da più anelli fusi aventi in comune l’acido di C.

Vitamine

Liposolubili e prodotte in piante e batteri. Vitamina A formata dal beta carotene in verdure gialle e verdi, D regola l’assorbimento intestinale del calcio, E azione protettiva sulle cellule, K in foglie delle piante verdi per la coagulazione.

Proteine

Macromolecole costituite da amminoacidi (aa). Hanno funzione di supporto strutturale, catalisi, trasporto, difesa. Per formare una proteina il gruppo carbossilico di un aa reagisce con quello amminico di un altro con la formazione di un legame peptidico e liberazione di una molecola d’acqua. La struttura delle proteine può avere 4 livelli di complessità:

• Struttura primaria: sequenza di aa di una catena polipeptidica.
• Secondaria: Ripiegamento della catena polipeptidica.
• Terziaria: ripiegamento 3D di una singola catena di aa con legami di solfuro, H, e ionici.
• Quaternaria: associazione di più polipeptidi = proteina multimerica.

Denaturazione: perdita della corretta struttura terziaria causata da calore ecc. Un gruppo di proteine dette chaperone.

Acidi nucleici

DNA: contiene le informazioni necessarie per costruire cellule e tessuti. Le informazioni vengono organizzate nei geni, mediante la trascrizione vengono copiate nell’mRNA che a sua volta trasferisce le istruzioni copiate per determinare l’ordine degli aa per la sintesi proteica. L’assemblaggio degli aa in proteine avviene durante la traduzione dell’mRNA.

Struttura: polimeri lineari composti da nucleotidi. Il nucleotide è formato da un gruppo fosfato unito con legame fosfodiesterico a un pentoso che a sua volta è legato a una base organica. Nell’RNA il pentoso è il ribosio. Nel DNA desossiribosio. Nel DNA le basi sono: adenina, citosina, guanina, timina. RNA: adenina, citosina, uracile, timina. (adenina, guanina sono purine cioè 2 anelli chiusi; citosina uracile e timina sono pirimidine 1 sono anello). L’RNA è meno stabile in presenza di soluzione alcaline si scinde in mononucleotidi. Nella sintesi degli acidi nucleici vengono usati i nucleosidi trifosfati: ATP, GTP. Quando i nucleotidi polimerizzano per formare gli acidi nucleici il gruppo ossidrilico legato al carbonio 3’ dello zucchero di un nucleotide forma un legame sterico con il gruppo fosfato di un altro nucleotide con eliminazione di 1 molecola di acqua. Quindi il filamento di acido nucleico è un polimero pentoso-fosfato.

Sintesi DNA: vengono prodotti due nuovi filamenti con due doppie eliche uguali a quello originale.

Sintesi RNA: avviene attraverso la copia dello stampo di DNA, l’RNA viene rilasciato in soluzione e i due filamenti di DNA si riassociano tra loro. Denaturazione: srotolamento e separazione dei filamenti; avviene scaldando la soluzione di DNA, rompendo i legami H che stabilizzano la doppia elica. Se si abbassa la temperatura si aumenta la concentrazione ionica i filamenti si riuniscono.

DNA circolare: tutte le molecole di DNA genomico dei procarioti e le molecole del DNA virale sono circolari. Ognuno dei due filamenti forma una struttura continua priva di estremità libere, i due filamenti non possono srotolarsi.

Capitolo 4 - Struttura della cellula eucariotica

Membrana plasmatica

Separa il citoplasma (+acquoso) dall’ambiente extracellulare (-acquoso); regola i flussi di molecole tra interno e esterno della cellula; nella cellula eucariote può circondare gli organelli citoplasmatici. La struttura è fluida e serve per il mantenimento dell’omeostasi del pH, ancoraggio di sistemi enzimatici per il trasporto di ioni e del citoscheletro, riconoscimento segnali chimici extracellulari.

Struttura delle membrane biologiche

In generale le membrane sono semipermeabili; sono caratterizzate da una differenza di potenziale elettrico grazie alla pompa Na/K; hanno una sottile pellicola costituita da lipidi e proteine tenuti da legami non covalenti; contengono glucidi.

• Lipidi: sono molecole anfipatiche con un’estremità idrofila polare che interagisce con H₂O; una idrofoba apolare insolubile in H₂O. Formano il doppio strato lipidico. Una membrana tipica è formata da 3 classi di lipidi:
  • Fosfolipidi: costituiti da una molecola di glicerolo esterificata a due molecole di acidi grassi e legata ad un gruppo fosforico legato ad una base azotata; i più abbondanti;
  • Steroidi: il colesterolo è – flessibile e + rigido e per questo modula la fluidità della membrana; introdotto con cibo o sintetizzato dal fegato;
  • Glicolipidi: componenti delle membrane delle piante.
• Proteine: danno specificità alle membrane, sono asimmetriche, funzionano come enzimi o per il riconoscimento cellulare e si dividono in:
  • Proteine estrinseche: periferiche, non penetrano nel doppio strato lipidico.
  • Intrinseche: integrali, attraversano il dsl e sono proteine trasportatrici, p. canali e pori.

Trasporto di membrana mediato da proteine

Il passaggio delle sostanze può avvenire con 2 modalità:

Trasporto passivo

Non si consuma energia; le particelle si muovono spontaneamente da zone ad alta concentrazione a zone a bassa concentrazione secondo gradiente di concentrazione.

• Diffusione semplice: è il movimento di gas o molecole liposolubili attraverso il dsl finché la concentrazione non sarà uguale nei due lati della membrana.
• Diffusione facilitata: è il trasporto di ioni o molecole mediato dalle proteine trasportatrici (hanno dei siti specifici per la molecola da trasportare, dopo il legame la proteina cambia conformazione e la molecola viene trasferita dall’altro lato della membrana) e proteine canale (formate da pori idrofili attraverso cui passano gli ioni; si aprono in seguito a stimolo o a un cambiamento di potenziale; es. osmosi).

Trasporto attivo

Passaggio della sostanza contro gradiente di concentrazione; si dispende ATP. Il trasporto attivo primario è mediato da pompe ioniche. Il trasporto attivo secondario è mediato da proteine carrier.

• Glucidi: associati a proteine e lipidi; rivolti solo verso la faccia non citosolica delle membrane.
• Glicocalice: rivestimento sottile esterno alla membrana plasmatica delle cellule animali; media le risposte infiammatorie; protegge la superficie cellulare.

Giunzioni cellulari

Sistemi che servono per formare contatti stretti tra le cellule e con la matrice extracellulare e per scambiare segnali.

• Giunzioni tight o occludente: sono le più strette; formate da una rete di proteine (claudine, occludine, JAM) filamentose che avvolgono la cellula; sono presenti nei tessuti epiteliali; impediscono il passaggio di soluti attraverso lo spazio extracellulare.
• Giunzioni aderenti: quelle a fascia e i desmosomi formano i sistemi di adesione intercellulare; emidesmosomi e contatti focali per i sistemi di adesione cellula-matrice extracellulare.
• Giunzioni gap: canale aperto che consente il passaggio di ioni o molecole; usata da cellule di tessuti diversi per comunicare.

Citosol

Porzione di cellula esterna al nucleo ma interna alla membrana plasmatica; ricca di H₂O, proteine, acidi grassi, classi di RNA.

Sistema membranoso interno

È formato da:

Reticolo endoplasmatico

Labirinto costituito da tubuli ramificati e cisterne appiattite interconnessi e estesi nel citoplasma; importante nella biosintesi di proteine e lipidi e come deposito di Ca. Si divide in:

• R.E. rugoso: formato da cisterne appiattite e circondate da membrane in continuità con l’involucro nucleare. Chiamato così per la presenza di ribosomi: organuli non delimitati da membrane; di natura ribonucleoproteica (costituiti da RNA ribosomiale e proteine).
• R.E. liscio: labirinto di canali intercomunicanti nel citoplasma; NON ha ribosomi; regola la distribuzione di Ca intracellulare; è in comunicazione con le cisterne del RER e Golgi; i lipidi sintetizzati nel REL raggiungono la loro destinazione finale tramite vescicole (processo di gemmazione). È importante per i processi di detossificazione perché elimina sostanze lipofile in eccesso.

Sintesi delle proteine (traduzione)

È lo stadio della sintesi proteica in cui le istruzioni portate dall’m-RNA vengono tradotte nella sequenza corretta di amminoacidi per formare una proteina. Ha luogo nel ribosoma composto da due subunità: quella piccola contiene un sito di legame per l’m-RNA; quella grande ha due siti di legame per due molecole di t-RNA. Ogni molecola di t-RNA è specifica per un unico amminoacido. La traduzione ha inizio quando due codoni del filamento di m-RNA si legano alla subunità piccola di un ribosoma. Il primo codone è la tripletta AUG, alla quale corrisponde l'aa metionina; il secondo codifica il primo vero aa della proteina. I due t-RNA, che hanno rispettivamente l'anticodone di inizio e l'anticodone complementare al secondo codone, si legano alla subunità grande e si forma un legame peptidico tra i due amminoacidi trasportati. Il t-RNA di inizio si stacca dal ribosoma mentre il dipeptide rimane legato al secondo t-RNA. Il ribosoma si sposta sopra un altro codone dell’m-RNA e una nuova molecola di t-RNA con il proprio amminoacido si dispone nel sito di legame vuoto del ribosoma. Si crea un nuovo legame peptidico e il tripeptide si salda all'ultimo t-RNA. Il processo di allungamento della catena polipeptidica prosegue in questo modo finché tutte le triplette sono state tradotte e viene raggiunto il codone di "fine lettura". La proteina completa si stacca dal ribosoma e specifici enzimi scindono il legame con la metionina.

Indirizzamento proteine

Il giusto indirizzamento è dovuto alla presenza di sequenze segnale o LS. Ci sono 2 vie di smistamento proteico:

Via co-traduzionale: durante la traduzione; i polipeptidi iniziano ad essere sintetizzati su ribosomi liberi e convogliati al RER. Con questo processo vengono prodotte tutte le proteine secretorie, lisosomiali, del RER. Le proteine intrinseche di membrana sono sintetizzate nel RER: le proteine a singolo passo di tipo 1 hanno estremità N-terminale verso la parte extra.